Name: הדמיה פליטת אור כדי לזהות זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: למד הדמיה פליטת אור לזיהוי זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה בעכברים CD1. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת של Trypanosoma brucei במערכת העצבים המרכזית ומקצרת הערכת תרופות מ-180 ל-90 ימים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ג&#39;ון קלי מרטין טיילור (London School of Medicine טיפוח טרופי) למתן ט ב. GVR35-VSL-2 brucei וד&quot;ר אנדריאה Zelmer (LSHTM) עצה הדמיה in vivo. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית ביל ומלינדה גייטס גלובל בריאות (OPPGH5337 מספר מענק).

אֶתִיקָה כל העבודה בוצעה תחת אישור של בעלי חיים משרד הפנים בבריטניה (הליכים מדעיים) Act 1986 בלונדון סקול אוף צער בעלי חיים רפואה היגיינה &amp; Tropical המועצה לביקורת אתיקה. ARRIVE מנחה מלוות בדוח זה. 1. בקטע Vivo של Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מניה cryopreserved (המכונה stabilate) של T. ב. brucei זן GVR35-VSL-2 (זמין פרופ &#39;ג&#39;ון קלי ב&quot;לונדון סקול אוף להיגיינה ורפואה טרופית &amp; דרך MTA) 9 מ חנקן נוזלי ולאפשר לאזן לטמפרטורת החדר. לדלל stabilate עד 2 x 10 4 trypanosomes / מ&quot;ל סליין גלוקוז שנאגרו פוספט סטרילית (PBS-G) pH 8.0 (1 L PBS + 15 גלוקוז גרם) 10. הערה: ט ב. brucei GVR35-VSL-2 הוא לא זיהומיות לבני אדם ודורשים סאפו מורשה מתקנים לבצע ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> inject עכבר CD1 נקבה 20-25 גרם עם 0.2 מ&quot;ל מדולל trypanosomes דרך המסלול הזרקה (IP) עם מחט 25 G. זהו &quot;עכבר התורם&quot;. מניחים את העכבר נגוע לתוך חינם פתוגן ספציפי (SPF) כרצונך -cage ולהאכיל. הערה: עכברים CD1 הם זן outbred וט ב. זיהומי GVR35 brucei הם מאופיינים היטב זן זה. עם זאת, פרוטוקול זה הוא גם החלים על זנים טהורים או גנטי שונים, אך חשוב לציין כי צבע פרווה עשוי להשפיע על רגישות ההדמיה 6,9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג parasitemia היקפי ידי לקיחת דמים. מניחים את העכבר לתוך עוצר פלסטיק ולקחת 5 μl של דם מזנב ידי venepuncture עם 21 G מחט או venesection ומערבבים 1/10 עם אמוניום כלוריד סטרילי 0.85% ל lyse תאי דם אדומים ולאפשר ספירת קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת הדם המדולל נויבאואר hemocytometer. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדם המדולל לשני התאים. ספירת הגר המרכזי כולהid של תא אחד לתת trypanosomes n. ריכוז trypanosomes בדם = n x 10 מ&quot;ל 4 trypanosomes /, להתאים לכל גורם לדילול ולחשב את הממוצע של שני החדרים. הערה: לאחר כ 5-7 ימים לאחר ההדבקה, parasitemia היקפי צריך לעלות מספיק לבצע זיהום בריכוז של 2 x 10 4 trypanosomes / מ&quot;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר רמות trypanosome גבוהות מספיק עבור מספר העכברים הנדרשים, עבור לשלב 1.6. רמת parasitemia של 6 x 10 מיליליטר 4 trypanosomes / עכבר תורם אחת מספיקה עבור זיהום של 10 עכברים. הערה: גדלים קבוצה משמעותית סטטיסטית, n = 6 לכל קבוצת טיפול של עכברים נדרשים 8. עבור דגמים אחרים של זיהום, חישובי כוח היו צריכים להיות מיושמים כדי לקבוע גדלים לקבוצה מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום עכברים לתוך קופסא חום (ב 28-30 מעלות צלזיוס למשך כ 5-10 דקות) כדי לאפשר את ורידי הזנב להתרחב.כדי לגרום הרדמה מסוף, לנהל 20 מ&quot;ג / iv pentobarbital ק&quot;ג עם מחט 25 G. אשר העכבר הוא מורדם בעדינות על ידי לחיצה לכפות הרגלים כדי להבטיח שאין רפלקס נסיגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Heparinize מחט 21 G על ידי aliquoting 5 מ&quot;ל הפרין ב 5000 מ&quot;ל / יחידות USP לתוך צינור Bijou ומוצץ פעמיים פנימה והחוצה של מחט מצורף מזרק 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את מזרק 21 G מחט 1 מיליליטר heparinized, ולבצע לנקב לב על העכבר מעבר הרדים ידי החדרת מחט מרכזית מתחת לצלעות (אגל הדם יהיה ברכה בבסיס המחט) ומשוך בעדינות בחזרה על הבוכנה כדי לא להתמוטט לשכת בלב. לאסוף מינימום של 0.7 מ&quot;ל של דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דם נגוע לייצר הבידוד של 2 x 10 4 trypanosomes / מ&quot;ל ב PBS-G pH 8.0 כצעד 1.1 לעיל. הערה: בשלב זה, הדם הנותרים ניתן cryopreserved לייצר stabilate ידי ערבוב עם גליצרול 8%, 20% ca עוברי חום מומתסרום LF (היי-FCS) ו -72% דם נגוע. לאט להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס באמצעות להקפיא איטי מקפיא מיכל להשיג קצב הקירור של -1 ° C / min, לפני העברת חנקן נוזלי. </li></ol> 2. זיהום של עכברי ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים CD1 עכברות (~ 21-25 גרם) לתוך תיבת חימום חם בעדינות להתרחב ורידים. מניחים את העכברים חימם לתוך איפוק פלסטיק להזריק 0.2 מ&quot;ל הבידוד בדילול לווריד עם מחט 25 G לווריד הזנב, שווה ערך ל -4,000 trypanosomes לכל עכבר. מניח לחץ באזור הזריקה לאחר מכן לעצור את הדימום. הערה: זיהום Intraperitoneal הוא ניתוב חוקי של זיהום ויש בו נעשה שימוש במחקרים קודמים 10, אבל אנחנו מצאנו את זה פחות לשחזור מאשר המסלול תוך ורידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באקראי עכברים בכלוב נגועים בקבוצות של 3 בכלובים-פרקו SPF. כביקורת, להזריק עכברות CD1 עם טפיל שאינו bioluminescent סוג בר, ט ב. brucei GVR35 (n =3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על הזיהום באמצעות מיקרוסקופיה סרטי דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דם ספוט 5 μl מן venepuncture או venesection לשקופית כוס ולבצע כתם דם (באמצעות שקופיות כוס שניות בעדינות את טיפת הדם על פני השקופית כדי להפיק סרט דק). אפשר שקופיות לייבוש באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את כתם דם עם 100% מתנול ואת הכתם עם Giemsa במשך 10 דקות לפני השטיפה עם DH 2 O ולאפשר לייבוש באוויר. תחת מטרה 100x לספור את מספר trypanosomes ב 10 שדות הראייה (FOV). הערה: צילומי דם מתבצעים לצד הדמיה לא פולשנית כולה חיה מוקדם ככל שלאחר זיהום יום אחד. כאשר עיבוד מספר בעלי חיים, בשיטה זו של quantitation trypanosome עדיפה על פני ספירת hemocytometer כפי הדגימות ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ומנה מאוחר יותר. </li></ol></li></ol> 3. פליטת אור הדמיה כדי לעקוב אחר זיהום הערה: כדי לפקח על הזיהום, כולו עניםניתן להשתמש הדמיה אל פולשני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון המניות של D-luciferin, המצע בלוציפראז גחלילית, ב בופר פוספט של Dulbecco (DPBS) 30 מ&quot;ג / מ&quot;ל. סנן לעקר ולהקפיא aliquots ב -20 ° C. הערה: D-Luciferin הוא אור רגיש, ולכן להגן עליו מפני האור על ידי לפפה aliquots בנייר כסף. אין להקפיא להפשיר luciferin שוב ושוב כפי שהוא יכול להשפיע על הפעילות 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם aliquot של D-luciferin לטמפרטורת החדר. הסר כל עכבר מהכלוב (כולל שליטה עכברים נגועים בזן טפיל סוג בר nonbioluminescent) ולהזריק 150 מ&quot;ג / ק&quot;ג של D-luciferin חיממה (מדולל DPBS) intraperitoneally עם מחט 25 G. מניחים את העכברים לתוך תא isofluorane כ 5 דקות כדי להשרות הרדמה עם 2% isofluorane / O 2 תערובת של 2.5 ליטר / דקה. הערה: העכברים להיות נייחים כשהם נמצאים תחת הרדמה. עבור תרמי משמש כאן, 3 עכברים ניתן לעבד בכל פעם. אם עכברים הם anesthetized עבור יותר מ -30 דקות, משחה דמעה מלאכותית עיניים יכול להיות מיושם כדי למנוע את העיניים של העכברים מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תרמי המתואר כאן, לפתוח את התוכנה לאתחל את המכשיר באמצעות תוכנה לפי הוראות היצרן. לרכוש תמונות הפעם הגיעה לטמפרטורת מצלמת צלחת מחוממת. הערה: מכשיר זה אינו בדרך כלל כבוי, המאפשר את המכונה כדי לבצע כיולי רקע לילה. במקרה זה צריך להפעיל מחדש, זה חייב להפעיל בדיקת כיול ראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכברים מורדם לתוך תרמי (ראה 3.5). השתמש מפרידי שחור גדולים בין העכברים כדי למזער לדמם דרך של כל אות bioluminescent בהירה. עכברי תמונה באמצעות סט של פעמי חשיפה; 1, 3, 10, 30, 60 ו -180 שניות, עם binning בינוני, 1 f / stop מסנן פתוח, ותחום E נוף (12.5 x 12.5 ס&quot;מ 2). ההערה: עכברי השליטה נגועים טפילי GVR35 nonbioluminescent סוג הבר לספק backgrערך פליטת אור ound. מניסוי קינטיקה luciferin (איור 6) עם מודל זה, מצאנו כי פסגות אות פליטת האור ב -10 דקות לפרסם ממשל וההדמיה לוקחת כ 5 דקות עבור 3 עכברים. קח זמנים זה בחשבון בעת ​​הרדמה והדמיה העכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח הדמיה יסודית של העכברים, לסובב שתיתן להם תמונת גחון, הגבה ו לרוחב. לשמור על עקביות סדר אוריינטציה הדמיה בין בעלי חיים רציפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדמיה, לאפשר עכברים להתאושש מן ההרדמה בהשגחה לפני שחזר כלוב SPF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך הדמיה עכברים כל 7 ימים עד יום 21 לאחר הפגיעה. לא צריך להיות עלייה מתמדת אות פליטת אור על החיה כולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה D21, תמונה ודם הסרט העכברים כמתואר לעיל, והמנה עכברים עם 40 מ&quot;ג / ק&quot;ג diminazene aceturate intraperitoneally. תרופה זו תנקה את parasitemia ההיקפי אבל לא לחצות את הדם-braiמחסום n, ולכן מאפשרת ויזואליזציה טובה יותר של זיהום במערכת העצבים המרכזית. הערה: aceturate Diminazene הוא תרופה ומבוססת המשמשת לטיפול trypanosomiasis חי בשלב מוקדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך הדמיה וניטור ב D28 ו D35. </li></ol> 4. אישור CNS זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעת D35, עכברי תמונה כמפורט לעיל (שלבי 3.1-3.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדמיה, לאפשר עכברים להתאושש מעכברי הרדמה, ולגרום לדימום מחודש כמפורט צעד 1.6-1.8, איסוף דם לצורך ניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לנקב לב, perfuse עכברים עם 20 מ&quot;ל PBS (אופציונלי: להוסיף 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של luciferin לפתרון זלוף) דרך הלב כדי לנקות דם מן האיברים לחדש תווית luciferin שאולי פינה מאזור המוח על מרווח זמן משלב 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות את המוח, באמצעות מספריים מעוקלים, חיתוך מהבסיס סביב היקף הגולגולת, מרים את החלק העליון של הגולגולת, כדי לאפשר למוחשירים החוצה בזהירות עם מלקחיים מעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המוח נכרת על קטע של פלסטיק שחור פיפטה 50 μl של 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​luciferin מעל האיבר לפני הדמיה, כדי להבטיח luciferin נאותה נוספה המוח נכרת. תמונה תוך שימוש בהגדרות כנ&quot;ל. זה יהיה להדגים לוקליזציה של הזיהום ההמיספרות של המוח. הערה: כימות Downstream של parasitemia על המוח הניכר יכולה להתבצע על ידי qPCR כפי שתוארו לעיל 8. יישומים במורד הזרם חלופיים אחרים עשויים לכלול היסטולוגיה או אימונוהיסטוכימיה לזהות טפילים ברקמת המוח לאחר קיבעון. </li></ol> 5. כימות של הדמיה פליטת אור הערה: פליטת אור ניתן לכמת באמצעות האזור של עניין (ROI) עם תוכנת ההדמיה ותיקן עבור פליטת אור רקע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות כלי ROI, ליצור ROI מלבני עבור quantitation כל חיהnd למקמו מעל תמונת העכבר לכסות קצה האף כדי בבסיס הזנב של העכבר. השתמש באותו בתיבת הגודל עבור כל בעל חיים וכל נקודת זמן. כאשר מסתכלים על ההחזר על ההשקעה עבור המוח, להשתמש ROI חוזר באותה דרך, מיקומה על אזור הראש העכבר בתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, להתאים תמונות להופיע באותו ספקטרום עבור ייצוג חזותי של זיהום. הערה: התוכנה בה משתמשת כאן מייצרת מפת צבע עבור כל תמונה המותאמת באופן אוטומטי עבור ספירת פוטון מינימום ומקסימום. כדי לאפשר השוואה ויזואלית בין סדרה של תמונות, את סולם הצבעים חייב להיות מוגדר אותם הערכים עבור כל התמונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתמונה עם פליטת האור הגבוהה ביותר ואת הכרטיסייה &#39;תמונה להתאים&#39; על לוח הכלי, בחר סולם לוגריתמים ו למינימום סקאלת צבעים מתאים ומקסימום (נקבע באופן אמפירי). החל סולם זה על כל התמונות לאורך הניסוי. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 375 (9709), 148-159 (2010).</li>
<li>Rodgers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosomiasis+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Trypanosomiasis and the brain.</a> Parasitology. 137 (14), 1995-2006 (2010).</li>
<li>Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%3A+pharmacological+re-engagement+with+a+neglected+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis: pharmacological re-engagement with a neglected disease.</a> Br. J. Pharmacol. 152 (8), 1155-1171 (2007).</li>
<li>Barrett, M. P., Vincent, I. M., Burchmore, R. J. S., Kazibwe, A. J. N., Matovu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+in+human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drug resistance in human African trypanosomiasis.</a> Future Microbiol. 6 (9), 1037-1047 (2011).</li>
<li>Jennings, F. W., Whitelaw, D. D., Urquhart, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+duration+of+infection+with+Trypanosoma+brucei+in+mice+and+the+efficacy+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">The relationship between duration of infection with Trypanosoma brucei in mice and the efficacy of chemotherapy.</a> Parasitology. 75 (2), 143-153 (1977).</li>
<li>Andreu, N., Zelmer, A., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+biophotonic+imaging+for+studies+of+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Noninvasive biophotonic imaging for studies of infectious disease.</a> FEMS Microbiol. Rev. 35 (2), 360-394 (2011).</li>
<li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (6), 537-540 (2005).</li>
<li>Burrell-Saward, H., Rodgers, J., Bradley, B., Croft, S. L., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+reproducible+in+vivo+imaging+mouse+model+for+evaluation+of+drugs+against+late-stage+human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">A sensitive and reproducible in vivo imaging mouse model for evaluation of drugs against late-stage human African trypanosomiasis.</a> J. Antimicrob. Chemother. 70 (2), 510-517 (2015).</li>
<li>McLatchie, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+in+vivo+imaging+of+Trypanosoma+brucei+expressing+%27red-shifted%27+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (11), e2571(2013).</li>
<li>Jennings, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%3A+potential+therapeutic+benefits+of+an+alternative+suramin+and+melarsoprol+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Int%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis: potential therapeutic benefits of an alternative suramin and melarsoprol regimen.</a> Parasitol. Int. 51 (4), 381-388 (2002).</li>
<li>Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+monitoring+of+in+vivo+colonization+and+clearance+dynamics+by+light-emitting+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria.</a> Methods Mol. Biol. 574, 137-153 (2009).</li>
<li>Rodgers, J., Bradley, B., Kennedy, P. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+chemotherapy+with+a+substance+P+receptor+antagonist+%28aprepitant%29+and+melarsoprol+in+a+mouse+model+of+human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Int%22%5BJournal%5D)">Combination chemotherapy with a substance P receptor antagonist (aprepitant) and melarsoprol in a mouse model of human African trypanosomiasis.</a> Parasitol. Int. 56 (4), 321-324 (2007).</li>
<li>Kamerkar, S., Davis, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+on+the+brain%3A+understanding+host-pathogen+interactions+in+chronic+CNS+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma on the brain: understanding host-pathogen interactions in chronic CNS infection.</a> J. Parasitol. Res. 2012, 589295(2012).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (32), 11468-11473 (2005).</li>
<li>Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+Toxoplasma+gondii+to+immunoprivileged+organs+and+role+of+Toll%2Finterleukin-1+receptor+signalling+for+host+resistance+assessed+by+in+vivo+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging.</a> Cell. Microbiol. 7 (6), 837-848 (2005).</li>
<li>Lewis, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+chronic+Trypanosoma+cruzi+infections+reveals+tissue-specific+parasite+dynamics+and+heart+disease+in+the+absence+of+locally+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection.</a> Cell. Microbiol. 16 (9), 1285-1300 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ההתפתחות המינית של ט bioluminescent ב. זן brucei GVR35 מאפשר הדמיה של זיהום trypanosome מן המוקדמות בשלב מאוחר. מודלי זיהום קודמים לא הצליחו לזהות בשלב מאוחר, כאשר טפילים הם במוח, בזמן אמת במיקרוסקופ סרט דם, ודרשו קולינג והסרת המוח של עכברים הנגועים לקבוע טפיל נטל 12. פליטת אור מפחית השתנות בין עכבר כמו עכבר אחת ניתן לעקוב לאורך כל כולו של זיהום הערכה איכותית מהירה של זיהום ניתן לראות בכל שלב. השיטה רגישה מאוד של הדמיה פליטת אור מאפשר זיהום בר...

טריפנוזומיאזיס אפריקאי אנושי (HAT), או מחלת שינה, נגרמת על ידי טפילי הפרוטוזואה הנישאים על ידי וקטור של Trypanosoma brucei spp1. המספר המשוער של המקרים הנוכחיים הוא פחות מ-7,000 מדי שנה, כאשר כמעט 70 מיליון אנשים חשופים לסיכון של זיהום הטפיל ביבשת אפריקה. המחלה, שהיא לרוב קטלנית אם לא מטפלים בה, כוללת שלב המולימפטי מוקדם שבו טפילים נמצאים בדם, ומתקדמת לשלב מאוחר שבו טפילים פולשים למערכת העצבים המרכזית (CNS) ואינם רגישים עוד לטיפול על ידי תרופות טריפנוזומליות בשלב מוקדם2. לטיפולים התרופתיים הנוכחיים ל-HAT בשלב מאוחר יש משטרי טיפול מורכבים וממושכים ותופעות לוואי חמורות כמו גם עמידות מדווחת, ולכן מחקר על טיפולים תרופתיים חדשים הוא הכרחי3,4. 
המחקר של טריפנוזומיאזיס אפריקאי אנושי בשלב מאוחר (HAT) במודלים מסורתיים של עכברים הוא ארוך ומורכב, כאשר הסרת רקמת המוח נדרשת כדי לנטר את העומס הטפילי5. הזן הזיהומי של בעלי החיים T. b. brucei משמש כמודל המחקר של טריפנוזומיאזיס כאשר השלב המאוחר מופיע 21 יום לאחר ההדבקה (dpi). כדי לנטר את זיהום הטפיל הפראי שאינו ביולומינסנט במודל העכבר, סרטי דם היקפיים או PCR כמותי הם השיטות היחידות לקביעת נטל הטפילים. עבור עומס הטפילים במוח, יש להוציא את העכבר, לכרות את המוח ולבצע qPCR על רקמות, מה שהופך את זה לבלתי אפשרי לעקוב אחר טפילים בנקודות זמן מרובות בשלב המאוחר של ההדבקה. התוצאה היא חוסר יכולת לעקוב אחר זיהומים בזמן אמת במערכת העצבים המרכזית (CNS). 
הדמיית ביולומינסנציה in vivo (BLI) יכולה לספק זיהוי רגיש מאוד ולא פולשני של התפשטות הטפילים והתקדמות המחלה במודל עכבר שניתן לעקוב אחריו בחיה בודדת במשך כל הניסוי6. BLI מבוסס על פליטת אור בספקטרום הנראה הנוצר על ידי תגובה מזורזת על ידי לוציפראז. הפוטונים הנפלטים מזוהים לאחר מכן על ידי מצלמת התקן מצמד מטען (CCD)7. למטרה זו, הפתוגן עובר שינוי גנטי כדי לבטא חלבון לוציפראז והמצע, לוציפרין, מוחדר בנקודות זמן מעניינות על ידי הזרקה. היתרון העיקרי בשיטה זו הוא היכולת לבצע מחקרי אורך, בהם ניתן לדמות את אותה חיה מספר פעמים עם מינימום תופעות לוואי. ניתן לכמת את אות הביו-לומינסנציה הנרכש, ובכך להצביע על עומס הפתוגן.
האופטימיזציה והאימות של T. b. brucei ביולוגי מוסט לאדום אפשרו לחקור את הזיהום בשלב המאוחר באמצעות פרוצדורות לא פולשניות, איתור טפילים מוקדם יותר ממיקרוסקופ סרט הדם והפחתה משמעותית של הזמן, העלות ומספר בעלי החיים הדרושים לחקר זיהום במערכת העצבים המרכזית ובדיקת תרופות בטריפנוזומיאזיס בשלב מאוחר8,9. בפרוטוקול זה אנו מדגימים הדבקה של עכברים בטריפנוזומים ביולוגיים וכיצד לדמיין את הטפילים in vivo לכימות התקדמות המחלה וחדירת מערכת העצבים המרכזית.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma, בריטניה</td><td>P4417</td><td>טבליות pH 7.4</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא, בריטניה</td><td>G8270</td><td>99.5% (מולקולרי)</td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד</td><td>סיגמא, בריטניה</td><td>A9434</td><td>99.5% (מולקולרי)</td></tr><tr><td>הפרין (מלח ליתיום)</td> <td>סיגמה, בריטניה</td><td>H0878</td><td></td></tr><tr><td>Hi-FCS</td><td>Gibco, Life Technologies, UK</td><td>10500-064</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>סיגמא, בריטניה</td><td>D4031</td><td>סטרילי מסונן</td></tr><tr><td>מר פרוסטי</td><td>נלג'ן, בריטניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ג'ימסה</td><td>סיגמה, בריטניה</td><td>G5637</td><td></td></tr><tr><td>D-לוציפרין</td><td>פרקין אלמר, בריטניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיגמא, בריטניה</td><td>115144-35-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דימינאזן אצטוראט</td><td>סיגמה, בריטניה</td><td>D7770</td><td>כיתה אנליטית</td></tr><tr><td>IVIS לומינה II</td><td>פרקין אלמר, בריטניה</td><td></td><td>מצלמות ביולוגיות אחרות זמינות e. מבית Bruker, Kodak</td></tr><tr><td>Living Image v. 4.2</td><td>Perkin Elmer,</td><td>תוכנה קניינית בריטית למכשירי Perkin Elmer IVIS; מכשירים אחרים עשויים להיות בעלי</td>מזרק 1 מ"ל משלהם Fisher Scientific, UK 10142104 מזרק 20 מ"ל Fisher Scientific, UK 10743785 25 גרם מחטים <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>גריינר ביו-אחד</td><td>N2516</td><td></td></tr><tr><td>21 גרם מחטים</td><td>גריינר ביו-אחד</td><td>N2138</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ חלבית כפולה</td><td>VWR, בריטניה</td><td>631-0117</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>StarLab, בריטניה</td><td>I1415-1000</td><td></td></tr><tr><td>7 מ"ל שפופרת ביז'ו</td><td>StarLab, בריטניה</td><td>E1412-0710</td><td></td></tr><tr><td>מסנן עכבר</td><td>סיגמא, בריטניה</td><td>Z756903</td><td>הריסון שלנו נעשה בבית, זהו דגם דומה</td></tr></tbody></table>

הדמיה פליטת אור כדי לזהות זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

טריפנוזומיאזיס אפריקאית אנושית (HAT) היא מחלה רב-שלבית המתבטאת בשני שלבים: שלב מוקדם בדם ושלב מאוחר שבו הטפיל פולש למערכת העצבים המרכזית (CNS). מחקר in vivo של השלב המאוחר היה מוגבל מכיוון שהמתודולוגיות המסורתיות דורשות הסרת המוח כדי לקבוע את נוכחות הטפילים.
הדמיית ביולומינסנציה היא צורה לא פולשנית ורגישה ביותר של הדמיה אופטית המאפשרת הדמיה של פתוגן שעבר טרנספקט לוציפראז בזמן אמת. על ידי שימוש בזן טריפנוזום שעבר טרנספטציה שיש לו את היכולת לייצר מחלה בשלב מאוחר בעכברים, אנו מסוגלים לחקור את הקינטיקה של זיהום במערכת העצבים המרכזית בבעל חיים בודד במהלך ההדבקה, כמו גם לצפות בתנועה ובהתפשטות של זיהום מערכתי.
כאן אנו מתארים פרוטוקול חזק לחקר זיהומים במערכת העצבים המרכזית באמצעות מודל ביולומינסנציה של טריפנוזומיאזיס אפריקאי, המספק תצפיות לא פולשניות בזמן אמת שניתן לנתח עוד יותר עם גישות אופציונליות במורד הזרם.

פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב התקדמות המחלה בעקבות זיהום של עכברים עם ט ב. brucei, מודל trypanosomiasis אדם אפריקני. איור 1 מציג את ציר הזמן של פרוטוקול הניסוי, הוכיח את לוח הזמנים עבור טיפול שלבים והדמיה. איור 2 הדגים שדה טיפוסי של נוף כתם דם Giemsa מוכתם קבוע משמש לכמת parasitemia ההיקפי, עם trypanosomes ותאי דם אדומים הנוכחי. פיתוח של הזיהום בחיות יכול להיות מלווה מדידת פליטת האור כמו באיור 3,</s...

כתב יד זה מתאר את השימוש בזן ביולומינסנט של טריפנוזומים אפריקאים כדי לאפשר מעקב אחר זיהום בשלב מאוחר ומדגים כיצד ניתן להשתמש בהדמיה חיה in vivo כדי להמחיש זיהומים בתוך מערכת העצבים המרכזית בזמן אמת.

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשתמש בדימות חי in vivo למעקב בזמן אמת אחר זיהום בטריפנוסומה, תוך ויזואליזציה של שלבי הזיהום המוקדמים בדם ועד לשלבים המאוחרים במוח בעכבר, באופן המדמה את התקדמות מחלת השינה הקלינית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הטריפנוסומה, זיהוי טיפולים תרפויטיים פוטנציאליים חדשים והערכת היעילות שלהם נגד הזיהום. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע את הערכת התרופות תוך 90 ימים, בניגוד ל-180 הימים שנדרשו עבור דגם התפקיד הקודם.פרוטוקול זה יכול לספק תובנות לגבי טריפנוסומיאזיס אפריקאי אנושי, אך הוא ישיים גם למודלים אחרים של מחלות זיהומיות כגון שחפת או מחלת צ'גאס. התחל בהנחת עכברים נקבות מסוג CD1 שמשקלן 21 עד 25 גרם בתוך תיבת חימום כדי להרחיב את ורידי הזנב. לאחר מכן, הנח את העכברים המחוממים באופן אינדיבידואלי בתוך מכשיר קיבוע מפלסטיק והשתמש במחט בנפח 25 gauge כדי להזריק 0.2 milliliters של תמיסת innoculum מדוללת של trypanosome brucei GVR35VSL2 לווריד הזנב, תוך הפעלת לחץ באתר ההזרקה מיד לאחר מכן כדי לעצור את הדימום.כדי לנטר את הזיהום באמצעות מיקרוסקופיה של משטח דם, טפטפו 5 µL של דם על עלית זכוכית. השתמשו בעלית זכוכית שנייה כדי למרוח בעדינות את הטיפה על פני העלית הראשונה, כך שייווצר שכבה דקה. הניחו לעליות להתייבש באוויר ולאחר מכן קבעו את

bioluminescence-imaging-to-detect-late-stage-infection-african

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בתחום ההדמיה vivo של טפילים טראנסגנטי שושנת יריחו שורה חיים

מאמר זה מתאר את הממשל...

הדמיה בקטריאלי bioluminescent<em&gt; In Vivo</em

שימוש בלוציפראז ובמערכות הדמית vivo (IVIS) כרומן האמצעי לזיהוי נקודתי קצה מחלה לפני התפתחויות קליניות להתרחש. IVIS אפשר לנו לחזות בזמן אמתו את הפלישה של וירוסי אנצפליטיים מעל ימים מרובים, מתן מודל מחלה מדויקת יותר למחקר עתידי. זה גם אפשר לנו לזהות את התכונות המגנות הפוטנציאליות של תרופות אנטי וחיסונים מהר יותר ממודלים של בעלי חיים מנוצלים כיום. היכולת לנצל חיות בודדות מעל נקודתי זמן מרובות מבטיחה דרישות מופחתות בבעלי חיים, עלויות ותחלואה הכוללת לבעלי החיים מנוצלים להבטיח אמצעי הומני יותר ויותר...

איתור vivo מערכות הדמיה (IVIS) של וירוס אנצפליטים נוירו פולשנית

מקור: דה וריס, ס. ר. ואח', מודל חיסון מאוחר של זיהום פצע כרוני בפסאודומונס אארוגינוסה . J. Vis. Exp. (2020).הסרטון הזה מדגים טכניקת הדמיה ביולומינצנטית למעקב אחר התקדמות זיהום חיידקי במודל עכבר חי. חיידקים פתוגניים שהונדסו באמצעות מערכת הדיווח luxABCDE פולטים אור באתר הזיהום, ומאפשרים ויזואליזציה של חיידקים פעילים מטבולית. על ידי הדמיית העכבר לאורך זמן, החוקרים יכולים לעקוב באופן לא פולשני אחר דינמיקת הזיהומים ולכמת את עוצמת האות הביולומינצנטי.

הדמיית ביולומינסציה של זיהומים חיידקיים בעכברים

דינמיקת גליקוזים בטריפנוזומים אפריקאים קשה לחקור על ידי טכניקות ביולוגיה מסורתיות של התא כגון מיקרוסקופ אלקטרונים ופלואורסצנטי.  כאמצעי להתבוננות בהתנהגות דינמית של אברונים, נעשה שימוש במערכת דיווח פלואורסצנטית-אברונים בשילוב עם זרימה ציטומטרית כדי לנטר דינמיקת גליקוזים בזמן אמת בטפילים חיים.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לפקח Dynamics Glycosome בTrypanosome האפריקאי

פרוטוקול זה מתאר את הקמתה של המודל הנושא הגידול העכבר כדי לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בזמן אמת על ידי הדמיה ביולומינציה כפול.

הדמיה ביולומינסנציה כפולה של התקדמות הגידול ואנגיוגנזה

הפרוטוקול המסופק כאן מתאר את השלבים המפורטים לביצוע מחקרי יעילות תרופות במודל ביולומינסנטי של זיהום טריפנוזומה קרוזי , תוך התמקדות ברכישת נתונים, ניתוח ופענוח. נהלי פתרון בעיות ובקרת איכות כדי למזער בעיות טכניות מסופקים גם כן.

הסרת המסתורין ב-Vivo Bioluminescence Imaging של מודל עכבר למחלת Chagas למחקרי יעילות תרופות

כאן אנו מציגים הערכה אורכית של אוגרים זהובים הנגועים תוך צפקית (IP) או דרך תוך חניכיים (IG) עם L. infantum-Luc על ידי הדמיה ביולוגית ועל ידי PCR. אוגרים הוערכו יום אחד לאחר ההדבקה (1 dpi), שבוע לאחר ההדבקה (8 dpi) ו-3 שבועות לאחר ההדבקה (22 dpi) והורדמו ב-50dpi ו-8 חודשים לאחר ההדבקה.

ב Vivo הדמיה של אוגרים נגועים בלישמניה אינפנטום על ידי חיסון חניכיים של אמסטיגוטים אקסניים המבטאים לוציפראז

אנטי retroviral טיפול לטיפול ב-HIV / איידס מנוטר בדרום אפריקה בקנה מידה גדול. Cytometry זרימה משולב עבור המטולוגיה (CD45), אימונולוגיה (CD4) ו ויראלי עומס המקושרים CD38 assay. הוקלט ב ומסתיימת בקטן-SA מעבדות, יוהנסבורג, אלה שיטות מודרניות הן וחסכוניים עם בקרת איכות פנימית גבוהה המקומי, משמש תפקיד מודלים עבור משאב מוגבל אבחון.

מקיף &amp; עלות מעבדה ניטור יעיל של HIV / איידס: מודל לחיקוי אפריקה

מונואמין NADPH הוא המקור העיקרי של מיני חמצן תגובתי (ROS) בphagocytes. בשל האופי הארעי של ROS, קשה למדוד ולעקוב אחר רמות ROS חי חיות. שיטה פולשנית לכימות סידורית של ROS בעכברים חיים מתוארת.

הדמית פליטת אור של פעילות מונואמין NADPH במודלים של בעלי חיים שונים

למד הדמיה פליטת אור לזיהוי זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה בעכברים CD1. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת של Trypanosoma brucei במערכת העצבים המרכזית ומקצרת הערכת תרופות מ-180 ל-90 ימים.

הדמיה פליטת אור כדי לזהות זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה

גלה סרטונים נוספים