Name: ה Ex Vivo גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: למדו פרוטוקול לגידול אורגנואידים ממעי דק של עכבר וטיפול ב-PAMPs ו-Listeria monocytogenes. השיטה מדגישה נורמליזציה של חלבונים וניתוח ביטוי גנים למחקר אימונולוגיה רירית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לד"ר שריל קוטרמארש-אוט, דילן מקדניאל ובטינה הייד על הדיונים הטכניים. המחברים מודים לד"ר Nanda Nanthakumar על אספקת תאי Caco-2. המחברים מודים גם לתוכנית ההזדמנויות האקדמיות הרב-תרבותיות (MAOP) בווירג'יניה טק. עבודה זו נתמכה על ידי פרס המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות K01DK092355 (ל-I.C.A). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Freshney, R. I., Freshney, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+epithelial+cells.+2nd+edn%22">Culture of epithelial cells. 2nd edn</a>. , Wiley-Liss. (2002).</li>
<li>Vachon, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+state-selective+roles+of+p38+isoforms+in+human+intestinal+epithelial+cell+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis.</a> Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).</li>
<li>Hynds, R. E., Giangreco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+relevance+of+human+stem+cell-derived+organoid+models+for+epithelial+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine.</a> Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).</li>
<li>Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+shaping+the+gastrointestinal+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment.</a> Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).</li>
<li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogenic+influence+of+human+R-spondin1+on+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium.</a> Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRX1+protein+attenuates+inflammatory+responses+to+infection+by+interfering+with+the+RIG-I-MAVS+and+TRAF6-NF-kappaB+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways.</a> Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).</li>
<li>Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella-infected+crypt-derived+intestinal+organoid+culture+system+for+host-bacterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions.</a> Physiol Rep. 2 (9), (2014).</li>
<li>Grabinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+intestinal+crypt+organoids+as+a+model+system+for+assessing+cell+death+induction+in+intestinal+epithelial+cells+and+enteropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy.</a> Cell Death Dis. 5, 1228(2014).</li>
<li>Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Succinate-Tetrazolium+Reductase+Systems.+Iii.+Points+of+Coupling+of+Four+Different+Tetrazolium+Salts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts.</a> Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).</li>
<li>Parry, M. F., Neu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+N-acetylcysteine+on+antibiotic+activity+and+bacterial+growth+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro.</a> J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

התרבות והתחזוקה של organoids מעיים היא הליך זה ניתן לשלוט על ידי כל אדם עם טכניקה בתרבית רקמה נאותה. יש דקויות ב passaging בהשוואה לגידול תאים בשכבה קונבנציונלית יותר, אבל הדקויות הללו אינן שקשה להתגבר עליו. השלבים הקריטיים של שיטה זו כרוך יכולת לגדל את organoids צפיפות גבוהה מספיק עבור זריעה אופטימלית. ניסויים חייב להיות scaled למטה עם organoids כמו צפיפות זריעה גדולה שיכולה להיות מושגת בדרך כלל עם שורות תאים אינן מעשיות. זה הופך בולט במיוחד כאשר יש קבוצות טיפול מרובות. <p cl...

היכולת לקצור organoids עיקרי התרבות תואר עבור מעי דק, מעי גס, לבלב, כבד ומוח והם התקדמות מרגשת רלוונטית להבנת תופעות נציג יותר פיסיולוגי לביולוגית רקמות 1-5. השיטות הראשונות מתארות את התרבות ותחזוקה של organoids מעי הדק נמסרו על ידי סאטו et al. מחוץ למעבדה של נס Clevers 1. לפני זה שיטה, קציר והתרבות של תאים אפיתל במעי העיקרי הוכיחו להיות מוגבל ולא יעיל בשמירת צמיחת תאי אפיתל. טכניקות אלה היו דיסוציאציה של רקמות באמצעות דגירה עם אנזימים, כגון collagenase ו dispase, שיובילו בסופו של דבר אל התולדה של תאי פיברובלסטים העיקריים intermixed 6. תנאים אלו גם להיות מוגבלים בזמן בשמירה על תרבית תאי אפיתל. מינימל ללא נישת תא אפיתל יהווה כמו התאים אפיתל ייכנסו אפופטוזיס בשלחוסר גורמים או אובדן צמיחה המתאימים של שלמות מגע, כינת 7 anokis. הופעתו של מערכת התרבות 3D-organoid ספקה שיטה לתאי מעי עיקריים תרבות המכילים מגוון של סוגי תאי מעי בתרבות מתמשכת 1. יש organoids אפיתל אלו יתרונות על פני שורות תאים להיות שהם מורכבים של תאים מובחנים מספר, וטוב יותר לחקות את האיבר הם נגזרים in vivo 8. התהליך בסופו של דבר &quot;לגדל בטן מינית בצלחת&quot; הוכיחה להיות כלי רב ערך להערכת התגובה של אפיתל מעי תחת לגירויים שונים. חוקר את האינטראקציה של תאי מעי עיקריים עם דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן חיידקים (PAMPs) רלוונטי בתחום האימונולוגיה דפוסים המולקולריים אלה יכולים לווסת תגובות מגוונות משני מארח חיידק 9. לא רק חוקרים יכולים כעת לחקור את יחסי הגומלין הללו עם organoids עכבר, אבל הםיכול להיות מתורבת מבני אדם, כמו גם 2. טכנולוגיה זו יש פוטנציאל לשנות באופן דרמטי רפואה אישית וזה מפתה להעלות השערות לגבי ההתקדמות כי טכניקה זו תאפשר בעתיד הקרוב. המטרה הכללית של שיטה זו היא לספק פרוטוקול לתרבות, הרחבה, וטיפול organoids מעיים עם מגוון רחב של גירויים. גירויים כאלה בסופו של דבר יכול לנוע בין חיסונים, PAMPs בקטריאלי, פתוגנים חי, העיכול (GI) ו בריפוי הסרטן. הבידוד והתרבות של organoids עכבר המעיים הותאמו מ סאטו et al. למרות שקיימות סטיות קלות המשייטת המקורית, המוצר הסופי להיות organoid התרבות עדיין מושג כאשר בעקבות פרוטוקול זה. שיטה זו מתמקדת בתיאור טכניקה נאותה לנורמליזציה ראויה כשעובד עם מבנים של תאים הלא-הומוגנית, אשר חייב להילקח בחשבון כאשר מבצעים assay מבוסס על תא nחוּם אֲדַמדַם.

<table><tbody><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050</td> <td>(סעיף 1,3,6) או מותג שווה ערך</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR צנטריפוגה</td><td>תרמו</td><td></td> <td>(סעיף 1,3)</td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare</td><td>Sh30243.01</td> <td>(סעיף 1,6) עבור תאי Caco-2 ו-HEK293 Rspondin1</td></tr><tr><td>קו תאים מפריש HEK293T-Rspondin1</td><td></td><td></td><td>(סעיף 1) תואר ושונה מ-Kim, K.A. et al. חלקיקים לנטי-ויראלים הכילו RSPO1(NM_138683) ORF cDNA משובט לתוך עמוד שדרה pReceiver-Lv105 שהוזמן ונרכש בהתאמה אישית מ-GeneCopoeia.&nbsp;</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>Falcon</td><td>352070</td> <td>(סעיף 1) או מותג שווה ערך</td></tr><tr><td>T-175 Flask</td><td>Corning</td><td>431079</td><td>(סעיף 1) או מותג שווה ערך&nbsp;</td></tr><tr><td>קורנינג</td> <td>מטריצת חלבון</td><td>356231</td><td>(סעיף 2,3,4,5,6) גורם גדילה מטריג'ל מופחת&nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's (DPBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30264.01</td> <td>(סעיף 2,3)</td></tr> <tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td> <td>(סעיף 2,3) מתקדם DMEM/F12</td></tr><tr><td>קורנינג 24 באר צלחות TC</td><td>קורנינג</td><td>3524</td> <td>(סעיף 2)</td></tr> <tr><td>N2 תוספת 100x&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>17502-048</td> <td>(סעיף 2)</td></tr><tr><td>B27 ללא ויטמין A 50x&nbsp;</td><td>לייף טכנולוגיות</td><td>12587-010&nbsp;</td><td>(סעיף 2)</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td> <td>(סעיף 2)</td></tr> <tr><td>תוסף גלוטמין (גלוטמקס)</td> <td>Life Technologies</td><td>35050-061</td> <td>(סעיף 2) יכול לשלב עם DMEM / F12</td></tr><tr><td>HEPES מתקדם (1 מ ')</td> <td>Life Technologies</td><td>15630-080</td> <td>(סעיף 2) יכול לשלב עם DMEM / F12 מתקדם &</td></tr><tr><td>10 מ"ל פלקון פיפט סרולוגי</td><td></td><td>357551</td><td>(סעיף 2) או מותג שווה ערך</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td> <td>(סעיף 2) מלאי = 100 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>N-אצטיל-L-ציסטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9165</td> <td>(סעיף 2) מלאי = 1M</td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי EGF</td><td>Biolegend</td><td>585608</td><td>(סעיף 2) מלאי = 500 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>נדנדה משתנה</td><td>Bioexpres</td><td></td><td>(סעיף 3)</td></tr><tr><td>מספריים</td><td></td><td></td> לניתוח<td>(סעיף 3)</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td>(סעיף 3)</td></tr><tr><td>מגלשות</td><td></td><td></td> זכוכית<td>(סעיף 3)</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td></td><td></td> לניתוח<td>(סעיף 3)</td></tr><tr><td>25 מ"ל פיפט פלקון</td><td></td><td></td> סרולוגי(<td>סעיף 3)</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SLBB9821</td><td>(סעיף 3) 0.5 מ' או חלופה צלחת</td></tr><tr><td>פטרי סטרילית EDTA בדרגת TC 100 מ"מ x 15 מ"מ</td><td>פישר</td><td>FB0875712</td><td>(סעיף 3) או צלחת TC בגודל שווה</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>309659</td><td>(סעיף 4)</td></tr> <tr><td>מחט גלישה מדויקת</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>305120</td> <td>(סעיף 4) 23G x 1 1/4 (0.6 מ"מ x 30 מ"מ)</td></tr> <tr><td>פלאגלין מ- Bacillus subtilis</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-bsfla&nbsp;</td><td>(סעיף 5, 6)</td></tr><tr><td>ליסטריה מונוציטוגנס</td><td>ATCC</td><td>19115</td> <td>(סעיף 5,6)&nbsp;( מורי&nbsp; et&nbsp;al.)&nbsp;</td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z359629-1EA</td> <td>(סעיף 5,6) או מותג מקביל</td></tr><tr><td>BBL עירוי לב מוח אגר</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>211065</td><td>(סעיף 5)</td></tr> <tr><td>עירוי לב מוח</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>237500</td> <td>(סעיף 5)</td></tr> <tr><td>Caco-2</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td> <td>(סעיף 6)</td></tr> <tr><td>טריפסין&nbsp;</td><td>gibco</td><td>25200056</td><td>(סעיף 6)</td></tr> <tr><td>מתנול</td><td>פישר</td><td>A412-4</td> <td>(סעיף 6)</td></tr> <tr><td>SpectraMax M5</td><td>התקני</td><td></td> מולקול <td>(סעיף 6)</td></tr> <tr><td>96 צלחת בדיקת באר</td><td>קורנינג</td><td>3603</td> <td>(סעיף 6) צלחת שחורה, תחתית שקופה TC מטופלת</td></tr><tr><td>בטכנולוגיית חיים של צבע צביעה גרעינית</td><td></td><td>H1399</td> <td>(סעיף 6) בקבוק Hoechst 33342</td></tr><tr><td>T-75</td><td>קורנינג</td><td>430641</td><td>(סעיף 6) או מותג שווה ערך</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור חרוטי</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>(סעיף 1,3) או מותג שווה ערך</td></tr><tr><td>1.7 מ"ל צינור פוליפרופילן</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td>או מותג שווה ערך</td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td>או מותג שווה ערך</td></tr><tr><td>TNF-alpha&nbsp;</td><td>ערכת בדיקת ביטוי גנים</td>של <td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00443260_g1</td> Taqman</tr><tr><td>IL-6&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td> <td>(Mm 00446190_m1</td><td>ערכת בדיקת ביטוי גנים Taqman</td></tr><tr><td>IL-1beta</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>ערכת בדיקת ביטוי גנים 00434228_m1 Taqman</td></tr><tr><td>IL-18</td><td>Applied Biosystems</td><td>מ"מ 00434225_m1</td><td>ערכת בדיקת ביטוי גנים Taqman</td></tr><tr><td>18s</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs 99999901_s1</td><td>ערכת בדיקת ביטוי גנים Taqman</td></tr><tr><td>7500 מערכת PCR מהירה בזמן אמת</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nexus gradient Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master</td><td>Mix Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>קיבולת גבוהה cDNA ערכת שעתוק הפוך</td><td>טכנולוגיות חיים/יישומי ביוסיסטמס</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תגובה אופטית מהירה 96 בארות, 0.1 מ"ל</td><td>טכנולוגיות חיים/ביו-מערכות יישומיות</td><td></td><td></td>4346907</tr><tr><td>עכבר רקומביננטי R-Spondin 1 חלבון</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>500 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C7559</td><td></td></tr></tbody></table>

ה<em&gt; ex vivo</em&gt; גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

organoids מעיים הראשי הוא מערכת מודל ערך כי יש הפוטנציאל להשפיע על השדה משמעותי האימונולוגיה רירית. עם זאת, את המורכבות של מאפייני צמיחת organoid לשאת אזהרות משמעותיות עבור החוקר. באופן ספציפי, את דפוסי הצמיחה של כל organoid הבודד הם משתנים מאוד וליצור אוכלוסייה הטרוגנית של תאים אפיתל בתרבות. עם אזהרות כאלה, שיטות בתרבית רקמה משותפת לא יכולות להיות מיושמות פשוט למערכת organoid בשל המורכבות של המבנה התאי. ספירת ציפוי מבוסס אך ורק על מספר תא, אשר נפוץ תאים מופרדים בנפרד, כגון שורות תאים, אינה שיטה אמינה organoids אלא טכניקת נורמליזציה כמה מוחלת. נירמול לתוכן חלבון כולל עשוי מורכב בשל מטריקס חלבון התושב. מאפיינים אלה במונחים של תא מספר, צורה וסוג התא צריכים להילקח בחשבון בעת ​​הערכת con המופרשאוהלים מן המונית organoid. פרוטוקול זה נוצר להתוות תהליך פשוט לתרבות ולטפל organoids מעי דק עם פתוגנים חיידקים ודפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs). זה גם מדגיש את טכניקות הנורמליזציה כי צריך להיות מיושמות כאשר ניתוח חלבון נערך אחרי תיקול כזה.

כאשר בעקבות פרוטוקול זה לטפח organoids מעיים, organoids כדור בצורת המאפיין יהיה נוכח לאחר קטיף. תוספת של התקשורת מותנה R-spondin1 יומי תיזום צמיחה נביטה של ​​organoids. הצמיחה של organoids מוצג באיור 1 א - F, והוא נציג של organoids מעיים בימים 1, 2, 4, 5, 6 ו יום 14. איור 1F מייצג את מאפייני הצמיחה הלא הומוגנית של organoids ביום 14. <p class="jove_content" fo:keep-together.with...

כאן, פרוטוקול למסוק, לתחזק ולטפל organoids הקטנה עכבר מעיים עם דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs) ו חיידקי ליסטריה מתואר, כמו גם דגש על ביטוי גנים וטכניקות נורמליזציה ראויות חלבון.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא למדוד את השפעותיהם של אתגרים פתוגניים על אורגנואידים של המעי הדק, תוך דגש על טכניקות נורמליזציה ביחס למספר התאים הכולל. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה המולדת והרירית, על ידי אספקת אמצעי לחקר אינטראקציות בין פתוגנים מארח של חיידקים לבין תאי אפיתל של המעי in vitro. חלק חיוני בפרוצדורה זו הוא שיטת הנורמליזציה ביחס למספר התאים הכולל, שהיא הכרחית בעת מדידת חלבונים מוקרשים מאורגנואידים באמצעות טכניקות כגון ELISA. כדי לאסוף קריפטות מהמעי הדק של עכבר לצורך תרבית אורגנואידים, התחילו בשימוש בזהרית זכוכית סטרילית כדי לגרד בעדינות את הוולי (villi) מהמשטח הלומנלי של המעי הדק. לאחר מכן, השתמשו במספרי דיסקציה כדי לחתוך את הרקמה לרצועות באורך 1-2 סנטימטר. העבירו את הרצועות לשפופרת קונית של 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של PBS קר מאוד. ערבבו את התוכן על ידי היפוך עדין והמתינו עד שתוכני הרקמה ישקעו לתחתית השפופרת. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS ושטפו את הרצועות שלוש פעמים נוספות ב-10 מיליליטר של PBS טרי, בכל פעם באותו אופן. בסוף השטיפה האחרונה, הניחו את השפופרת על קרח למשך עשר דקות. לאחר מכן, החליפו את ה-PBS ב-25 מיליליטר של PBS מועשר ב-2 מילימולר EDTA, בתוך דלי קרח על פלטפורמת נדנדה למשך 45 דקות. בסוף האינקובציה, המתינו שרצועות הרקמה ישקעו לתחתית השפופרת והחליפו את ה-PBS-EDTA ב-10 מיליליטר של PBS מועשר ב-10% FBS. נערו את השפופרת בעוצמה ביד עשר פעמים. לאחר מכן, המתינו שהרקמה תשקע לתחתית השפופרת והעבירו את העלייה לשפופרת קונית של 15 מיליליטר המסומנת כ-Fraction 1. נערו את הרקמות ב-PBS FBS חמש פעמים נוספות. העבירו את העלייה לשפופרת פראקציה חדשה בכל פעם. לאחר הנעורה האחרונה, סובבו בצנטריפוגה את כל הדגימות והשעיקו מחדש את המשקעים ב-5 מיליליטר של DMEM/F12 שחומם מראש וללא גורמי גדילה מוספים. כעת, סובבו שוב את הדגימות בצנטריפוגה ושאבו 4 מיליליטר מהעלייה מכל שפופרת. השעיקו מחדש את המשקעים במיליליטר האחרון של המצע שנותר והשתמשו באליקוט של 20 מיקרוליטר מכל פראקציה כדי להדמיאנ את הקריפטות והפסולת על זהריות זכוכית. לאחר איסוף הפראקציות המתאימות כדי להשיג את אחוז היחס הגבוה ביותר של קריפטות לפסולת, סובבו את הפראקציות המאוחדות בצנטריפוגה ושאבו את כל העלייה למעט 50-100 מיקרוליטר האחרונים. תוך שמירת השפופרות על קרח, הוסיפו 1 מיליליטר של מטריקס חלבון לפראקציות המאוחדות, תוך פיפטינג איטי למעלה ולמטה כדי למנוע הוספה של בועות אוויר. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטר של תגסוס מטריקס חלבון/קריפטה למרכזו של כל באר ב-37

the-ex-vivo-culture-pattern-recognition-receptor-stimulation-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

שיטה פשוטה להקמת organoid גידול במעי העכברי העיקרי מתוארת. שיטה זו מנצלת את התכונה שתאים סרטניים במעי הגס לשרוד ולגדול לתוך organoids בתקשורת המכילות גורמי צמיחה מוגבלים, ואילו מעי גס נורמלי אפיתל לא.

בתרבות Organoid מבחנה של גידולים במעי גס עכבר העיקרי

טכנולוגיית הדמיה משופרת מאפשרת הדמיה תלת מימדית של איברים במהלך ההתפתחות. כאן אנו מתארים מערכת תרבית איברים שלמה המאפשרת הדמיה חיה של הווילי המתפתח במעי העכבר העוברי.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל Ex Vivo מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

organoids קריפטה מעי הדק תרבית ex vivo לספק מערכת תרבית רקמה שמשחזרת צמיחה של מאורות תלויים בתאי גזע והנישה שלהם. הקמנו שיטה לassay הפרופיל המטבולי בזמן אמת בorganoids קריפטה עכבר העיקרי. מצאנו organoids לשמור על מאפיינים פיסיולוגיים שהוגדרו על ידי המקור שלהם.

אמיתי ניתוח זמן של פרופיל המטבולי ב Ex Vivo תרבויות עכבר המעיים קריפטה Organoid

בפרוטוקול וידאו זה אנו נותנים הסבר שלב אחר שלב על התמרה לנטי-ויראלית באורגנואידים של אפיתל המעי הראשוני ועל עיבוד וניתוח במורד הזרם של תרביות אלה על ידי RT-PCR כמותית, מיקרו-מערך RNA ואימונוהיסטוכימיה.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

תרבית האיברים ex vivo מאפשרת חקירה של תהליכים ביולוגיים בהקשר של ארכיטקטורת הרקמה השלמה. כאן, אנו מציגים שיטה של תרבית ex vivo של המעי הגס של העכבר, שניתן להשתמש בה כדי לחקור חסינות מולדת והגנה אנטי-מיקרוביאלית של המארח במעי.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; קולון איברי תרבות השימוש בו מארח אנטימיקרוביים ללימודי ביטחון

מאמר זה מציג שיטה ייחודית לניתוח אינטראקציות בין מארח למיקרוביום באמצעות מערכת תרבית איברי מעיים חדשנית לניסויים ex vivo.

מערכת תרבית איברי מעיים לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה

פרוטוקול זה מציע הוראות מפורטות לביסוס אורגנואידים של המעי הדק של מורין, בידוד תאי לימפואידים מולדים מסוג 1 מהלמינה פרופריה של המעי הדק מורין, והקמת תרביות משותפות תלת-ממדיות (3D) בין שני סוגי התאים כדי לחקור אינטראקציות דו-כיווניות בין תאי אפיתל במעי לבין תאי לימפואידים מולדים מסוג 1.

תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הקמת מערכת אורגנואידית של המעי הגס כדי לחקור את הפעילות והתפקוד של תאי גזע המעי הגס במודל נוקאאוט של קלודין-7.

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד קריפטים של מעי דק מורין ואורגנואידים תלת-ממדיים של תרבית מעיים מהקריפטים. בנוסף, אנו מתארים שיטה ליצירת אורגנואידים מתא גזע יחיד במעי בהיעדר נישה תאית תת-אפיתלית.

תרבית תלת-ממדית של אורגנואידים מקריפטים של מעי מורין ותא גזע יחיד למחקר אורגנואידים

למדו פרוטוקול לגידול אורגנואידים ממעי דק של עכבר וטיפול ב-PAMPs ו-Listeria monocytogenes. השיטה מדגישה נורמליזציה של חלבונים וניתוח ביטוי גנים למחקר אימונולוגיה רירית.

ה

גלה סרטונים נוספים