בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד אקסוזומים ממרה אנושית לניתוחים נוספים כולל פרופיל מיקרו-RNA. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות הכבד כגון זיהוי סמן מרה מסוים עבור כולנגיוקרצינומות או מחלות מרה אחרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא חזקה וניתנת לחזרה.

כדי לבצע כולנגיופנקראטוגרפיה אנדוסקופית רטרוגרדית, או ERCP, התחל בהנחת המטופל במצב שכיבה. לאחר אינטובציה והעברת תריסריון דרך פיו של המטופל, הכנס אותו לחלק השני של התריסריון וזהה את הפפילה העיקרית. קנוט באופן סלקטיבי את צינור המרה המשותף על ידי החדרת סוגר משולש לומן טעון מראש בחוט מנחה הידרופילי בגודל 0.35 אינץ' או 0.9 מילימטר.

בהנחיה פלואורוסקופית, קדם את חוט ההנחיה לצינור הכבד השמאלי ואז קדם את הסוגר חמישה סנטימטרים לתוך צינור המרה כדי להשיג מיקום יציב. לאחר הסרת חוט המנחה, חבר מזרק של 10 מילימטר ליציאת חוט ההנחיה דרך המנעול התחתון והשתמש ב-10 מיליליטר של לחץ שלילי כדי לשאוב את המרה. הסר את המזרק המכיל את המרה ולאחר הכנסת חוט ההנחיה מחדש, הזריק חומר ניגוד דרך פתח ההזרקה כדי לאטום את עץ המרה.

לאחר מכן, העבירו את המרה שנאספה לצינור של 15 מיליליטר על קרח ואם מאחסנים לזמן מאוחר יותר, צנטריפוגה את הדגימה ב-500 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני הקפאה במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי להמשיך מיד בבידוד אקסוזום, העבירו 400 מיקרוליטר מרה לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה וצנטריפוגה בטמפרטורה של פי 300 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאסוף תאים ופסולת תאים. כדי לנקות עוד יותר את הסופרנטנט, העבירו את התמיסה לצינורות מיקרו-צנטריפוגות טריים וצנטריפוגות את הדגימות בטמפרטורה של 16, 500 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר מכן, בארון בטיחות ביולוגית, אספו את הסופרנטנט למזרק וסננו אותו דרך מסנן ממברנה פוליאתרסולפון בגודל 0.2 מיקרומטר כדי להסיר את כל החלקיקים שנותרו גדולים מ-200 ננומטר. העבירו את הסופרנטנט המסונן לצינורות אולטרה-צנטריפוגה והשתמשו ב-PBS כדי להביא את הצינורות לשני שליש מלאים לפחות כדי למנוע את קריסת הצינורות במהלך הצנטריפוגה. גלולה את האקסוזומים דרך אולטרה-צנטריפוגה ב-120, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 70 דקות.

כדור קטן וצהוב יכיל את האקסוזומים. השליכו את הסופרנטנט על ידי סילוק וחיטוי בזהירות של הפסולת על ידי הוספת אקונומיקה לריכוז סופי של 10% נפח לנפח. ואז תן לזה לעמוד 20 דקות.

לניסויים במורד הזרם, עבדו את הכדורים בנפח קטן של תמיסה מתאימה או השעו אותם מחדש ב-50 עד 100 מיקרוליטר PBS ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. לאחר הכנת רשתות של שלפוחיות חוץ-תאיות מוכתמות בניגודיות, או EVs, על פי פרוטוקול הטקסט, רכשו תמונות במיקרוסקופ אלקטרונים באמצעות מתח תאוצה של 80 קילו-וולט החל מהגדלות של 20,000 X, וגדל ל-100,000 X, בעת קביעת גודל החלקיקים. אקסוזומים קטנים מכדי להיות מזוהים על ידי מיקרוסקופיה רגילה או ציטומטריית זרימה; עם זאת, איור זה מציג את התוצאות של ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים טיפוסי, או NTA, של אקסוזומים המודדים את הריכוז והתפלגות הגודל, שהיו בממוצע 97 ננומטר בדגימת מרה אנושית מבודדת זו.

ניתן להשתמש במיקרוסקופ אלקטרונים גם כדי לאשר את גודל החלקיקים המבודדים במרה האנושית ואיור זה מציג תוצאת EM שידור טיפוסית. כתמים מערביים אלה נבדקו עבור חלבונים מועשרים באקסוזומים כגון טטרה-ספנין CD63 ו-Tsg101. תרשים הגברה בזמן אמת זה מציג מגוון מיני מיקרו-RNA המופקים מאקסוזומים של מרה אנושית.

מכיוון שלאקסוזומים חסרים תקנים אמינים כמו RNA ריבוזומלי 18S או 28S או גנים לניהול משק בית, הזינוק של מיקרו-רנ"א סינתטי חשוב לנורמליזציה. טכניקת בידוד האקסוס יכולה להיעשות תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג ולעבד מרה מחולים או מבעלי חיים כדי לבודד ולנתח שלפוחיות חוץ-תאיות.

בעת ביטול הליך זה, חשוב לזכור לצנטריפוגה של הדגימה ב-500 גרם וארבע מעלות לפני ההקפאה במינוס 80, אם אינך יכול להמשיך עם אולטרה-צנטריפוגה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מחקרי מיקרו-רנ"א על מנת לענות על שאלות נוספות כמו פרופילי מיקרו-רנ"א. אל תשכח שעבודה עם מרה עלולה להיות מסוכנת ביותר מכיוון שהיא עלולה להכיל דלקת כבד, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ומשקפי בטיחות בעת ביצוע הליך זה.

לאחר פיתוחה, הטכניקה סללה את הדרך למחקר בתחום חקר כולנגיוקרצינומה כדי לחקור שלפוחיות חוץ-תאיות כסמן ביולוגי פוטנציאלי במרה מחולים עם בעיות מרה כגון חסימת PSA.