בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר

המטרה הכללית של שיטה זו היא לבודד אקסוזומים ממרה אנושית לצורך ניתוחים נוספים, כולל פרופיל microRNA. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום מחלות הכבד, כגון זיהוי של סמן מרה ספציפי עבור כולנגיוקרצינומה או מחלות דרכי מרה אחרות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא חסונה וניתנת לשחזור.

כדי לבצע כולינגיו-פנקריאטוגרפיה רטרוגרדית אנדוסקופית, או ERCP, התחל בהנחת המטופל במצב שכיבה על הגב. לאחר אינטובציה והעברת דואודנוסקופ דרך פה של המטופל, הכנס אותו לחלק השני של התריסריון וזהה את הפפילה המרכזית (major papilla). בצע קניולציה סלקטיבית של תעלת המרה המשותפת על ידי הכנסת ספינקטרוטום בעל שלושה לומנים, שנטען מראש עם חוט סיב אופטי הידרופילי בקוטר 0.35-inch או 0.9-millimeter.

בהדרכה פלואורוסקופית, התקדמו עם תיל ההובלה אל תעל הכבד השמאלית, ולאחר מכן התקדמו עם הספינקטרוטום חמישה סנטימטרים לתוך תעלת המרה כדי להשיג מיקום יציב. לאחר הוצאת תיל ההובלה, חברו מזרק של 10 מיליליטר לפתח תיל ההובלה דרך הנעילה התחתונה, והשתמשו בלחץ שלילי של 10 מיליליטר כדי לשאוב את המרה. הוציאו את המזרק המכיל את המרה, ולאחר החזרת תיל ההובלה, הזריקו חומר ניגוד דרך פתח ההזרקה כדי להדגיש את עץ המרה.

לאחר מכן, העבירו את המרה שנאספה למספורת של 15-milliliter על קרח, ובמידה והיא מאחסנת למועד מאוחר יותר, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 500 times g ובטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני הקפאה במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי להמשיך באופן מיידי בבידוד האקסוזומים, העבירו 400 microliters של מרה למספורת מיקרוצנטריפוגה וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 300 times g ובטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאיסוף תאים ושיירי תאים. כדי לנקות עוד יותר את supernatant, העבירו את התמיסה למספורות מיקרוצנטריפוגה חדשות וסבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 16,500 times g ובטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר מכן, בתוך קבינה בטיחותית ביולוגית, אספו את העלייה (supernatant) למזרק וסננו אותה דרך מסנן קרומי פוליאתרסולפון של 0.2 µm כדי להסיר חלקיקים שנותרו שגודלם מעל 200 nm. העבירו את העלייה המסוננת למבחנות אולטרה-צנטריפוגה והוסיפו PBS עד שהמבחנות יתמלאו לפחות בשני שלישים, כדי למנוע את קריסת המבחנות במהלך הצנטריפוגה. השקיעו את האקסוזומים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה ב-120,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 70 דקות.

משקע קטן וצהוב יכיל את האקסוזומים. השליכו את הנוזל העליון על ידי דקנטציה זהירה וחטאו את הפסולת על ידי הוספת אקונומיקה לריכוז סופי של 10% נפח לנפח. לאחר מכן, המתינו 20 דקות.

עבור ניסויים המשכיים, ניתן לעבד את המשקעים בנפח קטן של תמיסה מתאימה או להשעותם מחדש ב-50 עד 100 µL של PBS ולאחסנם בטמפרטורה של 80- °C לשימוש עתידי. לאחר הכנת רשתות של שלפוחיות חוץ-תאיות, או EVs, שצבעו בצביעת ניגודיות (contrast-stained) בהתאם לפרוטוקול הכתוב, רכשו תמונות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים במתח האצה של 80 kV, החל מהגדלה של 20,000 X, ובעלייה עד ל-100,000 X, בעת קביעת גודל החלקיקים. אקסוזומים קטנים מכדי שניתן יהיה לזהותם באמצעות מיקרוסקופיה רגילה או ציטומטריית זרימה; עם זאת, דמות זו מציגה את תוצאותיה של אנליזה טיפוסית של מעקב אחרי ננו-חלקיקים, או NTA, של אקסוזומים, המודדת את הריכוז ואת התפלגות הגדלים, שאveraged ל-97 nm בדגימת מרה אנושית מבודדת זו.

ניתן להשתמש גם במיקרוסקופיה אלקטרונית כדי לאשר את גודלן של החלקיקים המבודדים ממרה אנושית, ואיור זה מציג תוצאה טיפוסית של EM בשיטת תמסורת (transmission). blots מערביים אלו נבדקו לנוכחות חלבונים המועשרים באקסוזומים, כגון הטטרספאנין CD63 ו-Tsg101. תרשים הגברה בזמן אמת זה מציג מגוון של מיני microRNA שהופקו מאקסוזומים של מרה אנושית.

מכיוון שאקסוזומים חסרים סטנדרטים מהימנים כגון RNA ריבוזומלי 18S או 28S או גנים של בית (housekeeping genes), הוספה של microRNA סינתטי היא חשובה לצורך נורמליזציה. ניתן לבצע את טכניקת בידוד האקסוזומים בשלוש שעות אם היא מבוצעת כהלכה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה של האופן שבו ניתן להשיג ולעבד מרה מחולים או מבעלי חיים כדי לבודד ולנתח שלפוחיות חוץ-תאיות.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לצנטריפוג את הדגימה ב-500 G ובטמפרטורה של ארבע מעלות לפני הקפאה במינוס 80, במידה ואינכם יכולים להמשיך לסבב אולטרה-צנטריפוגה. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מחקרי microRNA, על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון פרופילי microRNA. זכרו כי עבודה עם מרה עלולה להיות מסוכנת ביותר מכיוון שהיא עשויה להכיל צהובון (hepatitis), ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות והרכבת משקפי מגן, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

לאחר פיתוחה, סללה הטכניקה את הדרך למחקר בתחום ה-cholangiocarcinoma כדי לבחון שלפוחיות חוץ-תאיות כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים במרה של מטופלים עם בעיות במערכת המרה, כגון חסימה של PSA.