Name: דור של איברים ממוזגים מדיה ויישומים עבור לימוד השפעות איבר ספציפי על התנהגות סרטן שד גרורתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: למד כיצד לייצר מדיה מותנית מאיברי עכברים לחקר גורמים מסיסים המשפיעים על התנהגות תאי סרטן שד גרורתיים. שיטה זו מאפשרת לחקור השפעות ספציפיות לאיבר על צמיחה והגרה של תאי סרטן במודל ex vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הקנדית לסרטן השד באזור אונטריו, הקרן הקנדית לחדשנות (מס' 13199), ותמיכת תורמים מג'ון ודונה בריסטול באמצעות קרן מדעי הבריאות של לונדון (ל-A.L.A). תמיכה במלגות ובמלגות ניתנה על ידי תוכנית המלגות לתארים מתקדמים של אונטריו (מחוז אונטריו, ל-G.M.P. ו-J.E.C.), תוכנית המלגות לתואר שני בקנדה (ל-M.M.P), המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) - תוכנית הכשרה אסטרטגית (ל-M.M.P., G.M.P ו-J.E.C) והיחידה לחקר סרטן השד התרגומי של פמלה גרינאוויי-קולמאייר בתוכנית הסרטן האזורית של לונדון (ל-M.M.P., G.M.P., J.E.C. ו-Y.X.). A.L.A. נתמך על ידי פרס החוקר החדש של CIHR ופרס החוקר המוקדם ממשרד המחקר והחדשנות של אונטריו.

כל המחקרים בבעלי חיים נערכו בהתאם להמלצות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים, תחת הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת המשנה השתמש בבעלי חיים באוניברסיטת המערבי. 1. בידוד איברים (ריאות, מוח, עצם, הלימפה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ארבעה צינורות חרוטי 50 מ&quot;ל סטרילי (אחד עבור כל איבר להיות מבודדת) המכיל כ 30 מ&quot;ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט סטרילית (PBS). טרום לשקול צינור אחד של PBS באמצעות משקל אלקטרוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים 6-12 בשבוע עכבר ישן משאיפת CO 2. עכברים יש להשאיר בתא CO 2 למשך כ 1 - 2 דקות או עד העכבר מפסיק לזוז ונשימה. המתת חסד מוצלחת ניתן אישור נוסף על ידי חוסר דופק כאשר בדקו באופן ידני עם אצבע. הימנע נקע בצוואר רחם כשיטה זה עלולה לגרום לפריצת כלי דם של הצוואר המוביל לקושי הסרת בלוטות הלימפה בבית השחי. הערה: מחקרים קודמים המשמשים במיוחדעכברים עירום נשי בריא, HSD: athymic Nude- Foxn1 נו 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף בתרבית רקמה סטרילית, במקום את העכבר על גבו על כרית קצף פוליסטירן, להפיץ את הגפיים ולהשתמש סיכות כדי לשמור אותם במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים ומספריים סטרילי, לחתוך את עור הבטן על קו האמצע על אברי המין ופצע כלפי מעלה לכיוון הפה. משוך בעדינות בחזרה את עור הבטן מן שרירי הבטן ואת הסיכה במקום על משטח קצף פוליסטירן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את בית השחי, הזרוע, ואת בלוטות הלימפה מפשעתי. הערה: בלוטות הלימפה בדרך כלל מוקפים רקמת שומן. בלוטות הלימפה מפשעתי הם הקלים ביותר לאיתור כפי שהם מצאו שטחי בצומת של שני כלי דם על עור הבטן משוך לאחור. בלוטות בית השחי והלימפה הזרוע נמצאות עמוקות בתוך הרקמה ודורשות תמרון עדין של רקמות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שאיתרת את בלוטות הלימפה, השתמש במספריים בעדינות ובזהירות לחתוך את לימפה לאdes מהעור, שומן וכלי ולהסיר אותם מן העכבר. כדי לאשר דיסקציה נכונה, לגלגל את המלקחיים על הרקמה שהוסרה. אם גוש קשה קיים כאשר מתגלגלים מלקחיים על הרקמות, ולאחר מכן לימפה סבירה הוסרה בהצלחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בלוטות לימפה שהוסרו ב PBS קר כקרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים ומספריים, לפתוח את חלל הבטן על ידי חיתוך דרך דופן הבטן נחשף בתנועה כלפי מעלה לכיוון החזה. בזהירות לחתוך דרך עצם החזה, חושף את חלל בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את הסרעפת מתחת הריאות לחתוך את הסרעפת. זה צריך למשוך לכיוון הצלעות בשל מתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את הריאות מתחת וחתך את הרקמה הבסיסית כלפי קנה הנשימה. זה מאפשר לריאות להסירו בחופשיות את חלל בית החזה. הסר את הלב והריאות כמקשה אחת ומניחים PBS קר כקרח. הלב ניתן להסיר מהריאות כאן או ממש לפני שקילת שלב 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אתסיכות, שמירה על העכבר במקום על משטח קצף פוליסטירן. סובבו את העכבר מעל לחתוך את העור של כל הגב התחתון הדרך מול ירך אל ירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיסת סטרילית של גזה להחזיק את פלג הגוף העליון של העכבר, לקלף את העור האחורי של העכבר על הרגליים וכפות הרגליים של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באותה פיסת גזה סטרילי, להחזיק את הרגל התחתונה במקום, בזהירות לשבור את מפרק הקרסול של הרגל העכבר לקלף את העור מעל המפרק proximally כלפי מפרק הברך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים, להסיר את השוקה ללא מפרק הברך ומניחים PBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.11) 1.12) עם איבר הפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להחזיק את הירך במקום, לחתוך משם לרקמות שרירות באמצעות המספריים להסיר את עצם הירך, הצבתו בקרח הקר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.14) עם איבר הפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות יצירה חדשה של גזה סטרילי, להחזיק את הראש של העכבר במקום. בעזרת מלקחיים ומספריים, להסיר את העור בעדינות כדי לחשוף את היםכול. בעזרת מספריים, לחתוך את הגולגולת העורפית בזהירות מהמרכז העליון בקו ישר וכלפי מטה כדי לחשוף את המוח האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, סקופ מתחת למוח לכיוון הקדמי והסר את המוח כולו. מניחים את המוח ב PBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.1) ל 1.17) עבור ארבעה עכברים לפחות. </li></ol> 2. איברים שקילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות בידוד איברים, לשקול כל צינור PBS המכיל ריאות רקמת המוח באמצעות משקל אלקטרוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את ההבדל במשקל על ידי הפחתת המשקל טרום בידוד (PBS בלבד) מן המשקל של הצינור + איברי PBS (ריאות ומוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את כמות תקשורת צריכה resuspend שברי רקמה מפער המשקל המחושב. הערה: ריאות רקמת המוח היא משקל מתוקנן לפי resuspension בתוך 4: יחס רקמות (כרך / WT): 1 מדיה. </li></ol> דור 3. Lung- ואת מוח מדיה אוויר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחולצת סטריליברדס נושא התרבות, להפוך צינורות PBS המכילים ריאות או מוח שלוש פעמים כדי להסיר דם שיורית מאיברים לשאוב PBS המכילים דם. חזור עם קר PBS הטרי עד הפתרון נראה ברור ומובן ללא ראיות דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח ריאות ומוח בצלחות פטרי זכוכית נפרדות 60 מ&quot;מ 2. באמצעות שני להבי אזמל סטרילי, ריאות בשר טחונות או מוח על ידי החיתוך הלוך ושוב מספר פעמים עד שברי רקמה כ ~ 1 מ&quot;מ 3 בגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שברי הרקמה Resuspend בנפח המתאים (נקבע בעבר בשלב 2.3) של בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM): התקשורת F12 בתוספת 1x מרוכז תוספת mitogen ו פניצילין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף רקמת ריאה או המוח מושעה שבר כדי אחד טוב של צלחת 6 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שברי רקמה בתקשורת במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר דגירה, לאסוף מותנה מדיה לכל רקמות further לדלל על ידי הוספה שלושה כרכים מקבילים של תקשורת הטריה צינור חרוטי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 1000 ב מדיה בדילול מותנית עבור כל איבר על 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להסיר שאריות רקמה גדולות. איסוף supernatant התקשורת ולסנן דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברכת מותנית תקשורת מכל איבר (כלומר., ריאות עם ריאות ומוח עם מוח) מעכברים מרובים לתת דין וחשבון על השתנות עכבר אל עכבר. Aliquot ולאחסן מותנה התקשורת ב -80 ° C עד השימוש. </li></ol> דור 4. של מח העצם ממוזג מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף בתרבית רקמה סטרילית, לקצץ רקמה עודפת מהעצם ולהסיר אפיפיזות (חתיכות סוף) מהעצמות במספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות חלל מדולרי 27 ½ מחט G, סומק של עצמות ידי דחיפת 1 מ&quot;ל של PBS דרך מרכז כל עצם. זה יאפשר לך לאסוף תאי סטרומה מח עצם (BMSC) לתוך צינור טרי המכיל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 1,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ולשטוף BMSC פעמים עם PBS. בתאי סטרומה מח עצם Resuspend ב 20 מ&quot;ל של התקשורת צמיחת תאים העצם סטרומה (DMEM: התקשורת F12 בתוספת 1x מרוכז תוספת mitogen, פניצילין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו בסרום עוברי 10% Boven (FBS) ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 10 מ&quot;ל של תאי סטרומה מח עצם resuspended ב בבקבוק T75 אחד. הערה: שלב ותאי צלחת מכל 2 עכברים בכל בבקבוק T75; במשך ארבעה עכברים, שתי צלוחיות T75 נדרשות (כ 1 x 10 7 תאים / בקבוקון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאי סטרומה מח עצם בתקשורת צמיחת תא עצם סטרומה למשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר דגירה, להסיר התקשורת משני T75 צלוחיות והכניסו בבקבוק T75 חדש, תווית הבקבוק הזה כמו &quot;לרחפן Flask&quot;. הוסף מדיה צמיחת תאי העצם סטרומה טריה 2 צלוחיות קודמות דגירה כל 3 צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים מגיעים כ 70% confluency (כ 5 - 7ימים) תאי מעבר. לשם כך, הסר בינוני לשטוף את התאים פעמיים עם PBS (3 מ&quot;ל כל אחד לשטוף). הסר PBS ולהוסיף 3 מ&quot;ל של תמיסת טריפסין / EDTA, הבטחת טריפסין שמכסה את כל פני השטח של הבקבוק. לאחר התאים להרים את הבקבוק (~ 2 - 3 דקות), להפסיק trypsinization תגובה על ידי הוספת 3 מיליליטר תקשורת צמיחת תאי עצם סטרומה). צנטריפוגה 900 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך תקשורת, ותאי resuspend ב 10 מיליליטר של תקשורת צמיחת תאים הטריה עצם סטרומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי ברכה מכל הצלוחיות והמעבר 1: 5 לשלוש צלוחיות T75 חדשות לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר תאים שוב להגיע ל -70%, וחזור על שלב 4.6 וברכה ומעבר לכל התאים החסידים בשנית. Re-צלחת כל התאים ארבע צלוחיות T75 דגירה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תקשורת צמיחת עצם תא סטרומה אמורה לשמש עבור כל השלבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאים מגיעים למפגש, לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף תקשורת אוסף תא עצם סטרומה (DMEM: F12 תקשורת + 1x su mitogen המרוכזpplement + פניצילין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל); 10 מ&quot;ל / T75), ולוודא כי המדיה הזו היא ללא FBS. אסוף התקשורת עצם ממוזג מח 72 שעות מאוחר יותר, לסנן דרך 0.22 מיקרומטר מסנן, בריכה, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, לאשר את הפנוטיפ של תאי סטרומה מבודדים מח עצם (BMSC) באמצעות נוגדנים כנגד SCA-1 עכבר, CD105, CD29, CD73 ו, CD44, באמצעות זרימת תקן cytometry טכניקות כפי שתואר לעיל 13. </li></ol> דור 5. לימפה צומת ממוזגת מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף בתרבית רקמה סטרילית, ללא מרחב צינור PBS המכיל בלוטות הלימפה שלוש פעמים כדי להסיר דם שיורית בלוטות הלימפה לשאוב PBS הדמים. חזור עם קר PBS הטרי עד הפתרון נראה ברור ומובן ללא ראיות דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בלוטות הלימפה ב -60 מ&quot;מ 2 זכוכית בצלחות פטרי. באמצעות שני להבים אזמל סטרילי, בלוטות לימפה בשר טחון על ידי חיתוך הלוך ושוב מספר פעמים עד tissuשברי דואר הם כ 1 מ&quot;מ 3 בגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור חרוטי, שברי הרקמה resuspend ב 10 מ&quot;ל של מכון ממוריאל פארק רוזוול 1640 (RPMI1640) התקשורת השלימו עם פניצילין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל), 5 x 10 -5 M סטרילי β-mercaptoethanol ( 1.75 μl / 500 מ&quot;ל מדיה) ו -10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 900 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ו resuspend כל התאים 30 מ&quot;ל התקשורת. הוסף 5 מ&quot;ל מדיה / היטב צלחת 6-היטב דגירה במשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 7 יום, להשליך התקשורת, לשטוף תאים חסיד עם 5 מ&quot;ל PBS חם ולהוסיף 5 מ&quot;ל התקשורת טרי היטב כל אחד. אפשר לתאים לגדול כדי confluency (כ 5 - 7 ימים), trypsinize, בריכת כל התאים, ומעבר כמתואר בשלב 4.6. Re-צלחת תאים לצלחת 6 באר. חזור על פעולה זו שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלושה קטעים, ולאפשר לתאים לגדול confluency, לשטוף בארות שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף 2 מ&quot;ל / היטב DMEM: F12 + 1xתוספת ו פניצילין mitogen מרוכז (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל), כדי להבטיח את המדיה הזו היא ללא FBS. אסוף התקשורת ממוזג בלוטת לימפה לאחר 72 שעות, בריכה, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, לאשר את הפנוטיפ של תאים סטרומה בלוטת לימפה מבודדים (LNSC) באמצעות נוגדנים כנגד CD45 העכבר gp38, באמצעות זרימה תקן cytometry טכניקות כפי שתואר לעיל 13. </li></ol> 6. שימוש מדיה איברים ממוזגים עבור מבחני Downstream קשורים להתנהגות גרורתי של תאי הסרטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע התקשורת ממוזג האיבר נוצר כמתואר בשלבי 1 - 5, ולהשתמש בו כדי לבצע תא במורד זרם שונה מבחני ביולוגיה מולקולריים כדי לקבוע את השפעתם של גורמים מסיסים הנגזר איבר על ההתנהגות גרורתי של תאים סרטניים. דוגמאות של מבחני תקן (תארו במקום בספרות) כוללות מערכי חלבון 13, מבחני צמיחה הסלולר &lt;sup&gt; 13, הגירה הסלולר מבחני 13, tumorsphere היווצרות 14, ו RT-PCR 15. תקשורת הבסיס המקורית השתמשה כדי ליצור את התקשורת ממוזג איבר (כלומר, בלתי מותנית DMEM:. תקשורת F12 בתוספת 1x מרוכזת mitogen כתוספת פניצילין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) אמור לשמש כביקורת שלילית . </li></ol>

<ol><li>Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2015.</a> CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organ+microenvironment+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The organ microenvironment and cancer metastasis.</a> Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).</li>
<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li>
<li>Kennecke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+behavior+of+breast+cancer+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Metastatic behavior of breast cancer subtypes.</a> J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Ewing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+Diseases%3A+A+Treatise+on+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors.</a> Am J Med Sci. 176 (2), 278(1928).</li>
<li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast.+1889%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889.</a> Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).</li>
<li>Weiss, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comments+on+hematogenous+metastatic+patterns+in+humans+as+revealed+by+autopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy.</a> Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).</li>
<li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).</li>
<li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).</li>
<li>Chu, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-Derived+Factors+Mediate+Breast+Cancer+Cell+Migration+through+CD44+Receptor-Ligand+Interactions+in+a+Novel+Ex+Vivo+System+for+Analysis+of+Organ-Specific+Soluble+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins.</a> Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).</li>
<li>Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).</li>
<li>Deepak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+PCR%3A+Revolutionizing+Detection+and+Expression+Analysis+of+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes.</a> Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).</li>
<li>Hammerschmidt, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+mesenteric+lymph+node+cells+are+essential+for+the+generation+of+gut-homing+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo.</a> J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Baddoo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+murine+bone+marrow+by+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection.</a> J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).</li>
<li>Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFurger%2C+KA+%22Curr+Mol+Med%22">Curr Mol Med</a>. 1 (5), 621-632 (2001).</li>
<li>Radisky, E. S., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+as+breast+cancer+drivers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).</li>
<li>Radisky, E. S., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).</li>
<li>Radisky, E. S., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+induction+of+breast+cancer%3A+inflammation+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Endocr+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion.</a> Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).</li>
<li>Kakinuma, T., Hwang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines%2C+chemokine+receptors%2C+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis.</a> J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).</li>
<li>Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemokines and cancer.</a> Int J Cancer. 119 (9), 2026-2029 (2006).</li>
<li>Schlesinger, M., Bendas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+cell+adhesion+molecule-1+%28VCAM-1%29--an+increasing+insight+into+its+role+in+tumorigenicity+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis.</a> Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).</li>
<li>Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+endocrine+resistance+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anticancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Autophagy and endocrine resistance in breast cancer.</a> Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).</li>
<li>Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+%28IR%29+and+insulin-like+growth+factor+receptor+1+%28IGF-1R%29+signaling+systems%3A+novel+treatment+strategies+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer.</a> Med Oncol. 31 (1), 805(2014).</li>
<li>Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+role+of+vascular+endothelial+growth+factor+pathway+in+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis.</a> Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).</li>
<li>Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+functional+TSLP+receptors+mitigates+Th2+polarization+and+the+establishment+and+growth+of+4T1+primary+breast+tumours+but+has+different+effects+on+tumour+quantities+in+the+lung+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain.</a> Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).</li>
<li>Chambers, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+in+tumor+metastasis%3A+new+concepts+from+intravital+videomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy.</a> Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).</li>
<li>Chiang, A. C., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of metastasis.</a> N Engl J Med. 359 (26), 2814-2823 (2008).</li>
<li>Gupta, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+site-specific+metastasis+genes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying site-specific metastasis genes and functions.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).</li>
<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).</li>
<li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).</li>
<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).</li>
<li>Psaila, B., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metastatic+niche%3A+adapting+the+foreign+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The metastatic niche: adapting the foreign soil.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).</li>
<li>Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+factors+secreted+by+mesenchymal+stromal+cells+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair.</a> J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

גרורה היא תהליך מורכב שבאמצעותו סדרה של אירועים הסלולר היא בסופו של דבר אחראי על גידול פלישת רקמות ומרוחק ההקמה 4,30,31. מערכת מודל vivo לשעבר המוצגת כאן יכולה להיות מנוצלת כדי ללמוד שני היבטים חשובים של התקדמות גרורתי: ביות תאים סרטנית או הגירת איבר מסוים ( &quot;להגיע לשם&quot;) וגידול האיבר ( &quot;גדלתי שם&quot;). מחקרים רבים בעבר התמקדו בזיהוי מאפיינים מולקולריים מפתח הקשורים לתאי הסרטן עצמם שתורמים לתהליך הגרור. לדוגמא, עבודה שנעשתה על ידי הקבוצה של ג&#39...

סרטן השד הוא הסרטן שאובחן הנפוץ ביותר אצל נשים ואת הסיבה המובילה השנייה של מקרי מוות הקשורים לסרטן 1. שיעור התמותה הגבוה של סרטן השד הוא בעיקר בשל כישלון הטיפול קונבנציונלי להמתיק ולחסל מחלה גרורתית; כ -90% ממקרי המוות מסרטן הן בשל גרורות 2. הבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס של המפל גרורתי היא בעל חשיבות עליונה בפיתוח תרופה יעילה הוא מוקדם סרטן השד בשלב מאוחר. מחקרים שנערכו בעבר סייעו להבהיר את האופי הרב השלבים של גרורות סרטן שד ההיפותיזה הוא התוצאה של שתי התקדמות סרטן הגרורות תלויה במידה רבה על אינטראקציות בין תאים הסרטניים מארח הסביבה 3. תצפיות קליניות הראו כי סרטן רב להציג כמיהות איברים, כלומר., הנטייה גרורה ספציפי מועדפת organs.In את הרשויותדואר של סרטן השד, המחלה של מטופל בדרך כלל מתפשטת או גרורות עד 5 אתרים מרכזיים, כולל העצם, ריאות, בלוטה לימפה, כבד, ומוח 4-6. תאוריות רבות פותחו כדי להסביר את התהליך הזה, אבל רק מעטים מהם עמדו במבחן הזמן. התיאוריה של גרורות של יואינג, הציע בשנת 1920, שיערו thatthe חלוקת גרורות נבע אך ורק גורמים מכניים; לפיו תאים סרטניים מבוצעים בכל הגוף על ידי דפוסי זרימת דם פיסיולוגי מוגדרים נורמלים פשוט לעצור במיטת הנימים הראשונה שהם נתקלים 7. לעומת זאת, השערת 1889 &quot;זרע ואדמה&quot; של סטיבן פאג&#39;ט הציעה אינטראקציות מולקולריות נוספות היו אחראי ההישרדות והצמיחה של גרורות, לפיו תאים סרטניים ( &quot;זרעים&quot;) יכולים רק להקים לעצמם microenvironments איבר proliferatein המייצרים גורמים מולקולריים מתאימים ( &quot;אדמה &quot;) 8. כמעט מאה שנה מאוחר יותר, לאונרד וייס תחתלקח מטה-אנליזה של נתוני נתיחה שפורסמו בעבר ואשר תחזיתו של יואינג שגידולים גרורתי רבים שהתגלו בעת הנתיחה נמצאו בפרופורציות הצפויות כי יהיה צפויות אם נקבעו כמיהות איבר גרורתי ידי דפוסי זרימת דם לבד. עם זאת, ב manyinstances היו גרורות פחות או יותר נוצר באתרים מסויימים, יהיה צפוי על ידי גורמים מכניים המוצע של יואינג 9. חשבונות אלה והתיאוריות מראים כי microenvironments איבר מסוים לשחק תפקיד קריטי בדפוסי ההפצה והצמיחה הבאה והישרדות של סרטן רב, כוללים סרטן השד. מאמצי מחקר בעבר התמקדו בעיקר על גורמים שהתקבלו תאים סרטניים תרומתם כמיהות האיבר שנצפו גרורות סרטן השד 10-12, מחקר קטן אולם יש גורמים בחנו נגזרים microenvironment האיבר שעשויה לספק נישה נוחה להקמהשל גרורות סרטן השד. זאת במידה רבה על האתגרים הטכניים של לימוד מרכיבי המיקרו-סביבת האיבר במבחנה. המאמר הנוכחי מתאר מערכת מודל מקיף לשעבר vivo לחקר השפעת רכיבים מסיסים של קשרי לימפה, עצמות, ריאות, והמוח על התנהגות גרורתי של תאי סרטן שד אנושיים. מחקרים קודמים תוקפים מערכת מודל זה על ידי ההוכחה כי שורות תאי סרטן השד שונות להציג התנהגות ממאיר תא אונליין ספציפי איבר ספציפי בתגובת תקשורת ממוזג איבר שמתאים שלהם in vivo גרורתי 13 פוטנציאליים. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי לזהות ולהעריך גורמים מסיסים ספציפיים הנגזר איבר שעשוי לשחק תפקיד בהתנהגות גרורתי של שד וסוגים אחרים של תאים סרטניים, כוללים השפעות על צמיחה, הגירה, הגבעולי התנהגות, ביטוי גנים, כמו גם זיהוי שלמטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות לסרטן. זוהי מערכת מודל vivo לשעבר הראשון, שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את ההתנהגות גרורתי איבר ספציפי בפירוט כדי להעריך את התפקיד של גורמים מסיסים הנגזרות איבר נהיגה לתהליך של גרורות סרטן.

<table><tbody><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>Thermo Scientific (Nunc)339652</td><td></td> <td>שמור על סטרילי</td></tr><tr><td>1x מי מלח עם חוצץ פוספט</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td> שמור על <td></td></tr><tr><td>עכברים עירומים</td> סטריליים <td>Harlan Laboratories</td><td>Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu</td><td>לשימוש בגיל 6 - 12 שבועות</td></tr><tr><td>כרית קצף פוליסטירן</td><td>N/A</td><td>N/A N/A</td><td>ניתן להשתמש במכסה המושלך (~ 4 x 8 אינץ' או יותר) של מיכל משלוח קצף פוליסטירן למטרה זו. לעקר על ידי ניגוב באתנול.</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11050-10</td><td>שמור מספריים סטריליים</td></tr><tr><td></td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14058-11</td><td>שמור על</td></tr><tr><td>רפידות גזה</td> סטריליות <td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-246069</td><td>שמור סטרילי</td></tr><tr><td>60 מ"מ2 צלחות פטרי זכוכית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CLS7016560</td> שמור על <td></td></tr><tr><td>להבי אזמל</td> סטריליים <td>פישר סיינטיפיק</td><td>S95937A</td><td>שמור על DMEM סטרילי</td></tr><tr><td>: F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td>חם ב 37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש, יש לשמור על סטרילי&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Mito + Serum Extender</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td>מכונה "תוסף מיטוגן מרוכז" בכתב היד. שמור על</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין סטרילי (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>שמור על</td></tr><tr><td>מכון הזיכרון רוזוול פארק סטרילי 1640 (RPMI 1640)</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש, יש לשמור על סטרילי&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051-500ML</td><td>שמור על</td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין/EDTA</td> סטרילית <td>ThermoFisher Scientific</td><td>R-001-100</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש, יש לשמור על סטרילי&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחות תרבית רקמות 6 בארות</td><td>Thermo Scientific (Nunc)140675</td><td></td> <td>שמור על סטרילי</td></tr><tr><td>0.22 &mu; מסנני מזרק</td><td>m Sigma-Aldrich</td><td>Z359904</td> שמור על <td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית רקמות T75</td> סטריליות <td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>178905</td><td>שמור על</td></tr><tr><td>Transwells</td><td>סטרילי Sigma-Aldrich</td><td>CLS3464</td><td>שמור על סטרילי, השתמש לבדיקות נדידה</td></tr><tr><td>נגד עכבר Sca-1</td><td>R& D Systems</td><td>FAB1226P</td><td>לשימוש ב-10 ומיקרו; l/106 תאים</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD105</td><td>R& D Systems</td><td>FAB1320P</td><td>לשימוש ב-10 ומיקרו; l/106 תאים</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD29</td><td>R& D Systems</td><td>FAB2405P-025</td><td>שימוש ב-10 ומיקרו; l/106 תאים</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD73</td><td>R& D Systems</td><td>FAB4488P</td><td>לשימוש ב-10 ומיקרו; l/106 תאים</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD44</td><td>R& שימוש</td><td>ב-D Systems MAB6127-SP</td><td>ב-0.25 ומיקרו; g/106 תאים</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD45</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>שימוש ב-5 ומיקרו; l/106 תאים</td></tr><tr><td>נגד עכבר gp38</td><td>eBioscience</td><td>12-5381-80</td><td>שימוש ב-10 ומיקרו; l/106 תאים</td></tr><tr><td>&בטא;-מרקפטואתנול&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M6250&nbsp;</td><td>שמור על סטרילי</td></tr><tr><td>מערכי חלבונים</td><td>RayBiotech Inc.</td><td>AAM-BLM-1-2</td><td>השתמש במערך אחד לכל תנאי מדיה (כולל בקרה שלילית), בשלוש עותקים</td></tr></tbody></table>

דור של איברים ממוזגים מדיה ויישומים עבור לימוד השפעות איבר ספציפי על התנהגות סרטן שד גרורתי

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

סרטן השד שולח גרורות לבלוטות הלימפה, העצם, הריאות, המוח והכבד בחולי סרטן השד. מאמצי מחקר קודמים התמקדו בזיהוי גורמים הטבועים בתאי סרטן השד האחראים לדפוס גרורתי נצפה זה (המכונה טרופיזם איברים), אולם הרבה פחות ידוע על גורמים הקיימים באיברים ספציפיים התורמים לתהליך זה. זה נובע בחלקו מהיעדר מערכות מודל במבחנה המסכמות במדויק את המיקרו-סביבה של האיברים. כדי לטפל בכך, הוקמה מערכת מודל ex vivo המאפשרת לחקור גורמים מסיסים הקיימים במיקרו-סביבות איברים שונות. מודל זה מורכב מיצירת מדיה מותנית מאיברים (בלוטת לימפה, עצם, ריאה ומוח) המבודדים מעכברים עירומים אתימיים רגילים. מערכת המודל אומתה על ידי הוכחה כי קווי תאים שונים של סרטן השד מציגים התנהגות ממאירה ספציפית לקו התא וספציפית לאיבר בתגובה למדיה מותנית באיברים התואמת את הפוטנציאל הגרורתי שלהם in vivo. ניתן להשתמש במערכת מודל זו כדי לזהות ולהעריך גורמים מסיסים ספציפיים שמקורם באיברים שעשויים למלא תפקיד בהתנהגות הגרורתית של תאי שד וסוגים אחרים של תאים סרטניים, כולל השפעות על גדילה, נדידה, התנהגות דמוית גזע וביטוי גנים, כמו גם זיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות לסרטן. זוהי מערכת המודל הראשונה ex vivo שניתן להשתמש בה כדי לחקור בפירוט התנהגות גרורתית ספציפית לאיבר ולהעריך את תפקידם של גורמים מסיסים שמקורם באיברים ספציפיים בהנעת תהליך הגרורות הסרטניות.

<html> הדור של מדיה איברים ממוזג דיאגרמה סקירה / סכמטי של התהליך של בידוד איברי דור התקשורת המותנה מוצג באיור 1, עם דימויים מצולמים נציג של ההליך שמוצג באיור 2. יצוין כי כאשר בפרוטוקול זה היה ראשון בפיתוח, כבד נכלל בניתוח שלנו כי זה אתר משותף של גרורות סרטן השד. עם זאת, בשל הכמות הגדולה של פרוטאזות ...

כתב יד זה מתאר מערכת מודל ex vivo המורכבת ממדיה מותנית איברים שמקורה בבלוטת הלימפה, העצם, הריאה והמוח של עכברים. ניתן להשתמש במערכת מודל זו כדי לזהות ולחקור גורמים מסיסים שמקורם באיברים והשפעותיהם על טרופיזם האיברים וההתנהגות הגרורתית של תאים סרטניים.

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לייצר מצעים מותנים (conditioned media) באמצעות קשרי לימפה, עצמות, ריאות ומוחות של עכברים, כדי לזהות ולבחון גורמים מסיסים שמקורם באיברים והשפעתם על ההתנהגות המטסטטית של תאי סרטן. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המטסטזיס, כגון: כיצד גורמים ספציפיים לאיבר משפיעים על צמיחת תאי סרטן, נדידתם וביטוי הגנים שלהם? טכניקה זו מספקת פלטפורמה פשוטה של ex vivo המייצגת גורמים מסיסים in vivo הספציפיים לאיבר, המשפיעים על הפנוטיפ וההתנהגות של תאי סרטן.כדי לבודד את קשרי הלימפה, התחילו בהנחת עכבר בן שבועיים עד שנים-עשר שבועות על פד קצף פוליסטירן תחת מ𒇃 תרביות סטרילי, וקבעו את הגפיים במצב פתוח. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה ובמספריים כדי לבצע חתך קו אמצע בעור הבטן, מהאיבריים המיניים ועד לפה. לאחר מכן, גררו בעדינות את העור מהשרירים הבטניים והצמידו אותו למשטח הניתוח בעזרת סיכות.הסר בזהירות את קשרי הלימפה מהעור, מהשומן ומהכלי הדם באמצעות מספריים, והנח את הקשרי הלימפה ב-30 milliliters של PBS קר במיסב קרר תוך כדי השליפה. לאחר איסוף כל קשרי הלימפה, השתמש בפינצטה ובמספריים כדי לחתוך בזהירות את דופן הבטן החשופה בתנועה כלפי מעלה דרך העצם הסטרנום, ובכך לחשוף את חלל בית החזה. חתוך את הסרעפת.הרימו את הריאות מלמטה, וחתכו את הרקמה שמתחתיהן לכיוון הקנה. לאחר מכן, העבירו את הריאות למכל חדש עם PBS קר בקרח. ניתן להסיר את הלב מהריאות במהלך שלב זה או לפני שקילת האיברים.כדי לקצור את עצמות הרגליים, הנח את העכבר במצב שכיבה על הבטן, וגזור את העור לרוחב הגב התחתון מצד לצד. לאחר מכן, השתמש בחתיכת גזה סטרילית כדי לתפוס את פלג הגוף העליון ואת העור מעל הרגליים וכפות הרגליים. בעזרת אותה חתיכת גזה, החזק את הרגל התחתונה תוך כדי שבירה זהירה של מפרק הקרסול של אחת הרגליים, וקלף את העור מעל המפרק באופן פרוקסימלי לכיוון הברך.לאחר מכן, בעזרת מספריים, הסירו את הטיביה (shins bone) ממפרק הברך והניחו את עצם הרגל ב-PBS קר בקרח. לאחר קציר הטיביה השנייה, החזיקו את הפמור (femur) במקומו בעזרת פינצטה והשתמשו במספריים כדי לחתוך ולהסיר את רקמת השריר שמסביב. לאחר מכן, הניחו את עצם הרגל ב-PBS קר בקרח.כדי לקצור את המוח, השתמשו בחתיכת גזה סטרילית חדשה כדי לתפוס את הראש, והסירו בעדינות את העור באמצעות מספריים ופינצטה כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי להסיר בזהירות את עצם העורף (occipital bone) מהמרכז העליון של הגולגולת בקו ישר כלפי מטה כדי לחשוף את החלק האחורי של המוח. לאחר מכן, תוך כדי גריפה מתחת לרקמה לכיוון החלק הקדמי של הגולגולת, העבירו את המוח השלם לתוך PBS קר מאוד.כדי להכין את המצע המותנה מהריאות, הפכו את המבחנות עם רקמת הריאה שלוש פעמים כדי להסיר דם ששאר באיברים. לאחר מכן, החליפו את נוזל השטיפה ב-PBS קר וטרי וחזרו על הפעולה עד שהסלין יהיה נקי מדם. בשלב הבא, העבירו את הריאות לצלחית פטרי מזכוכית בגודל 60 square millimeter עבור כל עכבר, והשתמשו בשני להבי סכין מנתחים סטריליים כדי לקצוץ את הרקמות באמצעות חיתוכים חוזרים הלוך ושוב.כאשר חלקי הרקמה הם בגודל של כ-מילימטר מעוקב אחד, השהו שוב את החלקים בנפח המתאים של מצע DMEM:F12 בתוספת אנטיביוטיקה, והדגרירו את הרקמות בבאר אחת של פלטת שש בארות לכל עכבר בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וחמישה אחוזי CO2. לאחר 24 שעות, העבירו את כל התוכן של כל באר למבחנות קוניות של 50 milliliter בנפרד, ודללו את המצע המותנה עם שלושה נפחים שווי ערך של מצע DMEM:F12 רענן לכל מבחנה. סובבו את המבחנות בצנטריפוגה כדי להסיר שאריות גדולות של רקמה.לאחר מכן, רכזו את המדיית המותנית דרך מסנן מזרקה של 0.22 מיקרון אל תוך מבחנה קונית אחת בנפח 50 מיליליטר. כדי להפיק מדיום מותנה של מחול השומן, העבירו את העצמות תחת מנדף תרביות רקמה סטרילי, וגזרו את הרקמה העודפת מהעצם. השתמשו במספריים כדי להסיר את האפיפיזות.לאחר מכן, השתמשו במחט במידה 27.5 כדי לשטוף 1 ml של PBS דרך החלל המוחהי (medullary cavity) של כל עצם לתוך מבחנה המכילה PBS טרי. כאשר כל תאי הסטרומה של מח העצם נאספו, שטפו את התאים שלוש פעמים ב-PBS. לאחר השטיפה האחרונה, השהו מחדש את המשקע ב-20 ml של מצע גידול לתאי סטרומה של עצם, מועשר ב-10% fetal bovine serum, והשתילו 10 ml של תאים לכל בקבוק T75.כאשר התאים הגיעים לכ-70% התלכדות (confluency), שטפו את התרביות פעמיים עם 3 milliliters של PBS. לאחר מכן, נתקו את התאים באמצעות 3 milliliters של תמיסת 0.025% trypsin/EDTA, תוך הקפדה שהטריפסין יכסה את כל שטח הבקבוק. לאחר שתי עד שלוש דקות, עברו את התגובה האנזימטית עם 3 milliliters של מצע גידול לתאי סטרומה של עצם, ורכזו את התאים בשפופרת של 50 milliliters.סבבו את התאים במערכת צנטריפוגה. לאחר מכן, השעיו שוב את המשקע ב-10 milliliters של מצע טרי. כעת, העבירו את התרביות ביחס של אחת לחמש לשלושה בקבוקי T75 חדשים, עד להגעה ל-70% confluency.לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS כפי שהודגם כעת, והזינו את התרביות במדיום לאיסוף תאי סטרומה של עצם ללא סרום, בתוספת מיטוגן ואנטיביוטיקה, למשך 72 שעות. לאחר היום השלישי לתרבית, אספו את המדיומים יחד דרך מסננת של 0.22 מיקרון. תאי הסטרומה אמורים להיות דבוקים בתרבית, כאשר בתרביות של תאי סטרומה מקשרי לימפה תצופה מורפולוגיה מוארכת ופיברובלסטית, ובתרביות של תאי סטרומה ממחית העצם תופיע מורפולוגיה קטנה ועגולה יותר.ניתוח באמצעות ציטומטריה של זרימה מאשר כי תאי הסטרומה של קשרי הלימפה הם ברובם שליליים ל-CD45 וחיוביים ל-gp38. תאי סטרומה של מחול השתבץ צריכים להיות חיוביים ל-CD-44 ו-CD-29, חיוביים באופן חלש ל-CD-105 ו-Sca-1, ושליליים ל-CD-73. תאי סרטן שד אנושיים עם רקעים גנטיים שונים מראים דפוסי נדידה וצמיחה שונים כלפי תנאים של איברים ספציפיים.לדוגמה, בניסוי מייצג זה, גרסת ה-231-BoM בעלת זיקה לעצם נודרת באופן מועדף למצע מותנה של מחית עצם לעומת מצעים מותנים של מוח וריאה. באופן דומה, גרסת ה-231-LM2 בעלת זיקה לריאה נודרת באופן מועדף למצע מותנה של ריאה לעומת מצעים מותנים של מחית עצם ומוח. יתרה מכך, ניתוח RT qPCR מדגים כי חשיפת תאי סרטן השד parental MDA-MB-231 למצע מותנה של עצם או ריאה גורמת לוויסות חיובי (up regulation) של הגנים הקשורים לגרורות ספציפיות לעצם או לריאה של תאי סרטן השד in vivo.לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים את השגת הרקמות והכנת המצע המותנה תוך שעתיים עד שלוש שעות, במידה שהן מבוצעות כראוי. שלבי התרבית המשנית בימים הבאים אורכים בין 15 ל-30 דקות ליום. בעת ביצוע הליכים אלו, חשוב לזכור לשמור על סטריליות מלאה של כל הרכיבים.בעקבות הפקת המדיום המותנה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון מערכי חלבונים (protein arrays), בדיקות צמיחה ונדידה של תאים, יצירת תאומי גידול (tumorsphere formation) ו-RT-PCR, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע להשפעת גורמים ספציפיים לאיבר על התנהגות תאי סרטן. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מחקר סרטן השד לחקור התנהגות גרורתית ספציפית לאיבר במערכת מודל ex vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד להפיק מדיומים מותנים באמצעות עצמות, ריאות ומוחות של עכברים.יש לזכור כי עבודה עם כלי ניתוח חדים עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש בטכניקת ניתוח מדויקת וזהירה, בעת ביצוע הליך זה.

generation-organ-conditioned-media-applications-for-studying-organ

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מתאר שיטה ליצירת מדיום מותנה באיבר הנגזר מכבד העכבר. מערכת מודל זו יכולה לשמש לזיהוי ומחקר של גורמים מסיסים שמקורם באיברים והשפעתם על טרופיזם איברים והתנהגות גרורתית של תאים סרטניים.

מדיום מותנה איברים: יצירת תווך מתאי איברים שנקטפו למחקרי סרטן גרורתי

תרבית תאים ראשונית באמצעות organoids רקמה שלמה מספקת מערכת מודל המחקה את המיקרו-הסביבה רב-התאית בגוף חי. פיתחנו מודל סרום ללא עיקרי רקמת האפיתל שד תרבות המנציח שושלות מעורבות תרבית תאים ותערוכות מובחנות מורפולוגיה, ללא הפרעה רקמה האנזימטית. organoids השד בר-קיימא ל&gt; 6 חודשים.

אינו אנזימטית, תרבות רקמות סרום ללא נגעי שד טרום פולשני לדור ספונטני של Mammospheres

פרוטוקולים מתוארים ללימוד הגירה של תאי סרטן השד, התפשטות והתנחלות במערכת מודל explant רקמת עצם אנושית.

שיטות לExplants רקמות Culturing עצם ירך האדם ללמוד התיישבות תאי סרטן השד גרורתי של הנישה

אורגנואידים פיתח מבלוטות החלב של העכבר היו לקרינה מאופיין להעריך תכונות אפיתל ואינטראקציות עם תאים חיסוניים. ניתן להשתמש באורגנואידים הניתנים לקרינה כדי להעריך טוב יותר את האינטראקציות של תאי התא שעלולות להוביל לגיוס תאי גידול ברקמה נורמלית שניתן לקרינה.

צמיחה ואפיון של אורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב

אנו מראים שיטה של נקרופסי וניתוח של מודלים של סרטן הערמונית העכבר, התמקדות בניתוח גידול בערמונית. פרוטוקול צעד אחר צעד עבור דור של גידול בבלוטת הערמונית העכבר מוצג גם.

הדור של אורגנואידים גידול מ מהונדסים גנטית עכבר מודלים של סרטן הערמונית

פרוטוקול להפקת האנושי הראשי אורגנואידים רירית הרחם המורכבים של תאים אפיתל וסטרומה ולשמור מאפיינים של רקמת רירית הרחם היליד מוצג. פרוטוקול זה מתאר שיטות מרכישת רקמת הרחם לעיבוד היסטולוגית של אורגנואידים רירית הרחם.

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

בלוטת החלב היא מבנה מחודד, המורכב מיואפיתל חיצוני ותאי אפיתל הפנים הפנימיים. המוצג הוא פרוטוקול להכין אורגנואידים. באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית שיטה יעילה זו מאפשרת לחוקרים לטפל באופן נפרד בשני סוגי תאים אלה כדי לחקור שאלות הנוגעות לתפקידם בצורת בלוטת החלב ובתפקוד.

הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

כתב היד מתאר מתודולוגיה להקמה וכן ניטור גדילה אורכי של גרורות ריאה ספונטניות מגידולי שד בהזרקה אורתוטופית, הניתנת להתערבות בכל שלבי המפל הגרורתי.

ב Vivo הדמיה למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

פרוטוקול זה דן בגישה ליצירת אורגנואידים אפיתליאליים מרקמת חלב ראשונית נורמלית וגידולית באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. יתר על כן, הוראות כלולות עבור תרבית תלת מימדית, כמו גם הדמיה immunofluorescent של אורגנואידים משובצים.

הפקה והדמיה של אורגנואידים עכבריים ואפיתל אנושי מרקמת חלב רגילה וגידולית ללא מעבר

פרוטוקול מפורט מסופק כאן לקביעת אורגנואידי שד אנושיים מכריתות גידולי שד שמקורם במטופל או מרקמת שד רגילה. הפרוטוקול מספק הוראות מקיפות שלב אחר שלב לגידול, הקפאה והפשרה של אורגנואידי שד אנושיים שמקורם במטופלות.

הקמה ותרבות של אורגנואידי שד שמקורם במטופל

למד כיצד לייצר מדיה מותנית מאיברי עכברים לחקר גורמים מסיסים המשפיעים על התנהגות תאי סרטן שד גרורתיים. שיטה זו מאפשרת לחקור השפעות ספציפיות לאיבר על צמיחה והגרה של תאי סרטן במודל ex vivo.

דור של איברים ממוזגים מדיה ויישומים עבור לימוד השפעות איבר ספציפי על התנהגות סרטן שד גרורתי

גלה סרטונים נוספים