הזרקה של תאים syngeneic Murine מלנומה מנת לקבוע את פוטנציאל גרורתי שלהם בתוך הריאות

גרורות ממלאת תפקיד משמעותי באלימות הסרטן, ומהווה כ-90% ממקרי המוות. אנו מדווחים על פרוטוקול למודל מלנומה גרורתית בעכברים השימושי לקביעת יעילותם של חומרים טיפוליים כנגד תופעה קלינית זו.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שיטה לייצור גידולים גרורתיים בשישה עכברים שחורים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונותרפיה כמו כיצד סוכני מחקר משפיעים על התגובה החיסונית בריאות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בגרורות ניסוי.

אז התוצאות אמינות ועקביות יחסית. כדי להתחיל, הניחו תרביות של תאי מלנומה B16-BL6, שאמורים להיות בכ- 70% מפגש, במכסה מנוע סטרילי. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של 05% טריפסין EDTA לכל מנה והשאירו את התאים למשך דקה.

לאחר שאיבת תמיסה זו, המשך להוסיף מיליליטר טריפסין לכל צלחת, ואז החזר את התאים לחממה. לאחר 10 דקות, העבירו את התאים למכסה מנוע סטרילי והוסיפו ארבעה מיליליטר של מדיום RPMI ללא סרום לכל צלחת. לאחר מכן אוספים את התאים בעזרת פיפטה ממונעת סטרילית.

כדי לפרק גושים שעלולים לסתום את מחט הפליטה, לחץ את קצה הפיפטה על תחתית הצלחת והוציא את התאים. לאחר חזרה על תהליך זה מספר פעמים, יש לזכור את התאים ולהעביר אותם לצינור חרוטי של 15 מיליטר. לאחר מכן הסר דגימה של תרחיף התאים, הכנס אותה להמוציטומטר וקבע את צפיפות התא.

באותה מידה הקצה את מתלה התא לארבעה צינורות של 15 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינורות, ולאחר מכן שפכו את הסופרנטנט. המשך לתייג כל אחד מהצינורות בצפיפות תאים שונה - 0, 0.063, 0.125, 0.25 או 0.5 מיליון תאים למיליליטר.

לאחר מכן הוסף נפח מתאים של RPMI ללא סרום לכל חרוט כדי לייצר את הריכוזים הסופיים הללו. אשר את צפיפות התאים הרצויה באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, הקצו 500 מיקרוליטר מכל תרחיף לצינורות מסומנים של 1.8 מיליליטר המונחים על קרח.

לאחר הכנת כל מתלי התאים B16-BL6, בחר עכבר. החזק אותו בזנב, הנח את החיה מאחור תחילה לתוך מרסן. כאשר פלג הגוף העליון של העכבר נמצא בתא הראשי וזנבו מחוץ למנגנון, המשך למשוך את החיה לכיוון קצה המסנן.

לאחר מכן, הכנס את בוכנת הריסון והמשך לדחוף את הבוכנה עד שהעכבר מאובטח. לאחר שהחיה נמצאת במקומה, סובב את העכבר ב-90 מעלות כך שאחד מוורידי הזנב הצדדיים פונה כלפי מעלה. לאחר מכן השתמש בפד אלכוהול כדי לנקות במרץ את צד זנב העכבר שבו הווריד נראה ביותר.

כדי להתכונן להזרקה, אספו תחילה 300 מיקרוליטר מתוך 0.5 מיליון תאים לתרחיף מיליליטר למזרק. לאחר מכן, הוציאו בועות מהמזרק על ידי היפוכו, הזזת צידו ודחיפה של הבוכנה. לאחר הסרת הבועות, הוציאו את תרבית התאים כדי להניב נפח סופי של 250 מיקרוליטר במזרק.

המשך להאריך את זנב העכבר ביד הלא דומיננטית. החזק אותו כך שהאצבע המורה תרים את הקצה הפרוקסימלי של הזנב והאגודל ילחץ על החלק הדיסטלי. בעזרת היד הדומיננטית, הכנס את המחט לווריד לכיוון הקצה הדיסטלי של הזנב בזווית דקה כלפי מטה.

לאחר מכן הכנס את המחט הלאה, והתאם אותה כך שתתאים לזווית וריד הזנב. לאחר החדרת המחט כסנטימטר אחד לווריד הזנב, התחל לדחוף את הבוכנה תוך החזקת המזרק יציב. עצור כל דימום על ידי החזקת גזה כנגד מקום הכניסה.

לאחר פליטת תרחיף התאים, הסר את המחט מהווריד והשליך אותה. לאחר מכן, הסר את הבוכנה מהמסננת והנח את העכבר בכלוב מקבל. פרוטוקול זה נועד לזהות את המספר האופטימלי של תאי B16-BL6 להזרקה כדי ליצור מודל שימושי של מלנומה גרורתית.

מוצגים כאן מוקדי ניסוי המסומנים על ידי חיצים שנוצרו בריאות שבועיים עד שלושה לאחר הזרקת חמש צפיפויות תאים שונות. כאשר הוזרקו 500,000 תאים למיליליטר, המוקדים כיסו לחלוטין את הריאות. בדוגמה המוצגת כאן, נספרו 102 מוקדים.

לעומת זאת, הריאות היו מכוסות רק בדלילות במוקדים כאשר הוזרקו 62,500 תאים למיליליטר או 125,000 תאים למיליליטר. בהתאמה, צפיפויות אלה הביאו לספירת מוקדי ריאה של 1 ו-17. בשיטה זו נקבע כי הריכוז האופטימלי של תאים להזרקה הוא 250,000 תאים למיליליטר.

צפיפות זו הביאה לריאות עם כ-65 מוקדים, מספר שבו האיברים לא היו מכוסים לחלוטין ולא כוסו בדלילות רבה מדי על ידי מוקדים. ספירה נוספת של נתונים אלה בגרף מדגימה קשר ליניארי בערך בין מוקדי ריאות וצפיפות תרבית תאים מעל 125,000 תאים למיליליטר כפי שמוצג כאן. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משעה, מספר העכברים תלוי, אם מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון ההליך, חשוב לזכור לנסות ולהזריק מספר שווה של תאים לכל עכבר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מתן תרופות, כדי לענות על שאלות כמו כיצד טיפולים פוטנציאליים משפיעים על מספר מוקדים שנוצרו. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרי סרטן לחקור את מרכיבי הסרטן הגרורתי במלנומה בשישה עכברים שחורים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לאסוף ולהכין תאי B16-BL6, לרסן עכברים, להכין מחטים ולהזריק מספר שווה של תאים לכל וריד זנב. אל תשכח שעבודה עם תרבית ומחטים של יונקים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון הימנעות ממקלות מחט ולבישת ציוד מגן.