צעד אחד טיהור זיהוי תכונות חומרים שלילית של

המטרה הכללית של טהרה זו היא להפיק חלבון ומפעיל נויטרופילים של Helicobacter pylori, או HP-NAP, בצורתו הטבעית ברמת טוהר גבוהה ובניצחון גבוה, באמצעות כרומטוגרפיית אצווה במצב שלילי עם שרף חילוף יונים מסוג di-ethyl amino-ethyl. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לטהר את HP-NAP בצורתו הטבעית בשלב אחד, בטוהר גבוה ובניצחון גבוה. טהרה שלילית של HP-NAP מתחילה בהליך קישור באצווה, שבו פראקציית החלבון המסיס מליזאטים של חיידקים מתווספת לשרף DEAE.

התערובת מדגירת כדי לאפשר לחלבונים השלמים להיקשר לשרף. לאחר מכן, HP-NAP הנמצא בחלק שאינו קשור מופק באמצעות סרכזוגה או זרימה בכבידה. המשמעויות של טכניקה זו הן טיפול מונע ביחס של 10:1 ופרוגנוזה של מחלות הקשורות ל-Helicobacter pylori, כמו גם טיפול בסרטן.

בשל התכונות האימונוגניות והאימונומודולטוריות של HP-NAP. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקלו בקושי, מכיוון ש-HP-NAP נוטה להצטבר בקלות במהלך הסטריליזציה.

את הפרוצדורה תדגים Zhi-Wei Hong, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו. בעבודה בטמפרטורה של 4 °C, נשעה 50 milliliters של תרחיף התאים שהוכן כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, בתוך 20 milliliters של Tris-buffer עם מלח נמוך ב-pH 9.0, בתוספת תערובת מעכבי פרוטאז. קריטי לשמור על הדגימה בטמפרטורה של 4 °C כדי לאפשר לפרוצדורה למנוע אגרגציה של חלבונים.

יש להפר את התאים הבקטריאליים על ידי העברת התרחיף הבקטריאלי דרך הומוגניזטור בלחץ גבוה הפועל בטווח של 15,000 עד 20,000 PSI, שבע פעמים, בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר השגת הליסאטים, יש לסבב אותם באופן מיידי בצנטריפוגה. העבירו את הדגימות ההומוגניות למבחנה לצנטריפוגה.

סבב מיד את ליזאט התאים בצנטריפוגה אולטרה במהירות של 30,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת, כדי להפריד בין הפракציות החלבון המסיס והבלתי מסיס. לאחר הסבב, העבר את העלייה, המהווה את פракציית החלבון המסיס, לכלי כימי (beaker). מדוד את ריכוז החלבון של פракציית החלבון המסיס בשיטת Bradford באמצעות ערכה מסחרית, תוך שימוש ב-bovine serum albumin כסטנדרט, בהתאם להוראות היצרן.

לאחר מכן, הוסף 177.6 µL של HCl נורמלי אחד ל-20 mL של פראקציית החלבון המסיס כדי להתאים את ערך ה-pH שלו מ-pH 9.0 ל-pH 8.0. הוסף לתמיסת החלבון Tris-HCl בריכוז 20 mM, pH 8.0, וסודיום כלוריד בריכוז 50 mM, כדי להגיע לריכוז חלבון סופי של 0.5 mg/mL. כדי להכין 15 mL של שרף DEAE, השהה 0.6 g של אבקה יבשה של שרף DEAE ב-30 mL של באפר Tris-HCl בטמפרטורת החדר למשך יום אחד לפחות.

סבוב את שרף הניקוי בצנטריפוגה במהירות של 10,000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ולאחר מכן הסר והשלך את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, הוסף 15 milliliters של Tris-HCl buffer. לאחר חזרה על שלבי הצנטריפוגה והסספנסיה ארבע פעמים נוספות, אחסן את 15 milliliters של השרף שהשקיע בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

בעבודה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, הוסיפו 45 milliliters של החלבונים המסיסים שהוכנו למיליליטרים של שרף והעבירו לכלי כימי בנפח של 100 milliliters עם מוט ערבוב. ערבבו את תמיחת החלבון והשרף באמצעות פלטת ערבוב בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לאחר מכן, שפכו את תמיחת החלבון והשרף לתוך עמודה מפלסטיק או מזכוכית המצוידת בברז מעצור, והניחו לשרף לשקוע תחת השפעת כוח המשיכה.

פתחו את הברז כדי לאפשר לתמיסת החלבון לזרום דרך העמודה בזרימה בכבידה עד שגובה הנוזל בעמודה יהיה מעט מעל לשרף. אספו את התסנן כחלק הבלתי קשור המכיל את החלבון המפעיל נויטרופילים המטוהר. הוסיפו 15 milliliters של בופר Tris-HCl קר מאוד לעמודה.

פתח שוב את הברז כדי לאפשר לתמיסת השטיפה לזרום דרך העמודה בzרימה מכבידה, עד שגובה הנוזל בעמודה יהיה מעט מעל לשרף. אסוף את הנוזל שעבר כפרקציית השטיפה. חזור על השטיפה עם תמימה קרה (בטמפרטורת קרח) ארבע פעמים נוספות כדי לאסוף את פרקציונות השטיפה הנוספות.

לאחר מכן, הוסיפו לעמודה 15 milliliters של 20 millimeter Tris-HCl pH 8.0, one molar sodium chloride קר מאוד. אספו את הנוזל העובר (flow through) כפרקציות אלוציה כפי שנעשה קודם לכן. חזרו על שלבי האלוציה ארבע פעמים נוספות כדי לאסוף את פרקציות האלוציה הנוספות.

השפעת ה-pH על המסיסות של HP-NAP בליסאט של E.coli מוצגת כאן. כמות ה-HP-NAP שזוהתה בפרקציה המסיסה זו עלתה באופן ניכר ב-pH 7.5 עד 9.5. HP-NAP רקומביננטי שוחזר כמעט במלואו בפרקציה המסיסה עם ליסיס התאים ב-pH 9.0.

כאן מוצגת השפעת ה-pH על ניקוי שלילי של HP-NAP רקומביננטי שהובע ב-E.coli באמצעות שרפי DEAE במצב אצומה (batch). ב-pH 8.0, כמות קטנה בלבד של HP-NAP הייתה נוכחת בפרקציית האלוציה. כמות ה-HP-NAP שהייתה נוכחת בפרקציות הבלתי קשורות הייתה הגבוהה ביותר ב-pH 8.0.

כמות החלבונים האופטימלית שהועמסה על שרף ה-DEAE היא 1.5 milligrams של חלבון לכל milliliter של שרף, כדי להשיג קיבולת מקסימלית של השרף לספיגת השבבים מ-E.coli. ב-pH 8.0, מעט מאוד חלבונים מלבד HP-NAP בצורתו הטבעית התאוששו בפרקציה הלא-קשורה (unbound fraction) תוך שימוש בשרפי DEAE במצב אצווה (batch mode). רמת הטוהר של HP-NAP הייתה גבוהה מ-95 percent.

ה-HP-NAP המנוקה מתקפל למולטימר בעל מבנה שניוני של אלפא-הליקס (alpha-helix), כפי שנחשף על ידי כרומטוגרם של ג'ל-פילטרציה וספקטרום של דיכרואיזם מעגלי ב-UV רחוק. בדיקת כימילומינצנציה תלוית-לומן מעלה כי ה-HP-NAP המנוקה מסוגל לעורר ייצור של מיני חמצן רהאקטיביים על ידי נויטרופילים. לאחר השליטה בטכניקות אלו, ניתן לבצען בתוך חמש שעות אם הן מבוצעות כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן טיהור HP-NAP פונקציונלי בצורתו הטבעית, בנשוא גבוה ובדרגת טוהר גבוהה, באמצעות כרומטוגרפיה במצב שלילי (negative mode batch chromatography) עם DEAE ושרף חליפין. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בתמיסות חוצץ (buffers) ב-pH המתאים בשלב העיקר של הכרומטוגרפיה. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר ניסינו ליישם גישות כרומטוגרפיות אחרות במקום סינון כדי לטהר את ה-HP-NAP בצורתו הטבעית.

למרות ששיטה זו תוכננה כדי למשוך HP-NAP רקומביננטי המבוטא ב-E.coli, ניתן ליישמה גם במערכות ביטוי בקטריאליות אחרות כגון per-sida sep-tidas. הדגמה ויזואלית של מדד זה היא קוד מהיר.

בנוסף, שלבי העיקור והכרומטוגרפיה באצוות הם קשים ללמידה, מכיוון ששלבים אלו חייבים להתבצע בטמפרטורה של 4 °C ללא כל עיכוב בזמן. אם חלבון המיועד לניקוי מתאים לניקוי בכרומטוגרפיה בשינוי (exchange chromatography) במצב שלילי, ניתן להתאים פרוצדורה זו כנקודת התחלה לפיתוח תהליך ניקוי.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום המחקר הקליני לבחון את האפשרות של שימוש ב-HP-NAP בטיפול בסרטן, כמו גם את פיתוחם של חיסונים, תרופות ואבחון למחלות הקשורות ל-Helicobacter pylori.