Name: RNA טיהור מן intracellularly Grown חיידקי ליסטריה בתאי Macrophage (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: למדו שיטה לבידוד RNA חיידקי מ-Listeria monocytogenes בתוך מקרופאגים ממקור עצם עכברים. הטכניקה מעשירה RNA חיידקי תוך מזעור זיהום מחומצות גרעין של המארח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחקר במעבדת הרשקוביץ נתמך על ידי מענקי 335400 ERC ו-R01A/109048 NIH.

הערה: במהלך הניסוי כולו, תאי מקרופאג מודגרת על 37 מעלות צלזיוס חממת 5% CO 2 כפיית אוויר ונלקחו מתוך האינקובטור רק מניפולציות ניסיון, אשר מבוצעות בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II. עבודה עם L. חיידקי חיידקים הם בהתאם לרמת 2 תקנות בטיחות ביולוגית. Cell 1. הכנת זיהום חיידקים (יום 1 ו -2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 2.0 x 7 מח עצם נגזר 10 תאים מקרופאג (BMDM) על צלחת 145 מ&quot;מ 30 מ&quot;ל התקשורת BMDM + עט סטרפטוקוקוס (טבלה 2). צלחות זרע 3 עבור כל זן חיידקים להיות מנותחות. דגירה לילה בשעה 37 ° C באינקובטור 5% CO 2 נאלץ באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל תרבית חיידקי לילה של wild-type (WT) ל חיידקי 10403S זן ב 10 מיליליטר של עירוי לב המוח בינוני (BHI), ב 30 מעלות צלזיוס חממה סטנדרטית. צינורות תרבות מקום מלוכסנים בלי לרעוד. הערה:תנאי גידול אלה עד להסדיר את הביטוי של הגנים שוטונים, המקדמת זיהום יעיל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני טרום חמים BMDM (ללא אנטיביוטיקה פן-סטרפטוקוקוס) (לוח 2) ופוספט בופר (PBS) ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף monolayer מקרופאג פעמיים עם 25 מ&quot;ל של PBS מחומם מראש להסיר אנטיביוטיקה. הוסף 30 מ&quot;ל בינוני BMDM טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 1.5 מ&quot;ל של תרבית החיידקים לילה עם PBS על ידי צנטריפוגה החיידקים&gt; 14,000 XG דקות 1, השלכת supernatant, ו resuspending חיידקים בעדינות ב 1.5 מ&quot;ל של PBS על ידי pipetting. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק כל צלחת מקרופאג עם 0.5 מ&quot;ל של תרבות הלילה שטף של wild-type L. חיידקים. אם אתה משתמש הצלחות מרובות, להדביק כל דקות צלחת 15 זה מזה. מרווח זמן זה יאפשר קצירה כל צלחת בנפרד בסוף הזיהום. הערה: ריבוי של זיהום (משרד הפנים) הוא assayed ידי ציפוי דילול סדרתיים של תרבית החיידקים המשמשים זיהום על צלחות אגר BHI ויחידות המושבה להרכיב לספור (CFU) לאחר 24 שעות הדגירה של צלחות על 37 מעלות צלזיוס. באמצעות 0.5 מ&quot;ל של WT ל חיידקי להתאמץ תוצאות 10403S בתוך משרד הפנים של ~ 100 (100 חיידקים CFU לכל תא מקרופאג). כשמנתחי חיידקי מוטציות פגומות בצמיחה תאית, גבוה יותר משרד פנים צריך להיחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות 0.5 דגירת שעות ב 37 ° C, לשטוף את התאים הנגועים פעמים עם PBS, להסיר חיידקים פנויים, ולהוסיף 30 מיליליטר מחומם מראש בינוני BMDM. חיידקים מצורפים יפנימו במהלך 0.5 השעות הבאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 1 זיהום hr לכתוב, להוסיף 30 μl של גנטמיצין (1: 1,000 להגיע לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) כדי להרוג חיידקים חוץ תאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את מנגנון הסינון על ידי הצבת ראש מסנן על בקבוק נוזל איסוף עם יציאת ואקום. אז במקום מסנן (0.45 מיקרומטר) על ראש המסנן, ואחריו משפך גליל ולאבטח את החלקים השונים עם ג מתכתמנורה. הכן מים קרים כקרח RNase חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 6 שעות לאחר הדבקה, חיידקי אסיף תאים נגועים כדלקמן. פנקו כל צלחת בנפרד. הערה: בדרך כלל, L. חיידקי משלים 1-יומן של צמיחה במהלך 6 שעות של זיהום בתאים מקרופאג. incubations יותר עלול לגרום לצמיחת יתר של חיידקים ומות תא של מקרופאגים, ואילו תקופות דגירה קצרות יכול לגרום המון חיידקים נמוכים משמעותי. משרד הפנים ואת הזמן של זיהום יכולים להיות שונים כדי להגיע תנאים אופטימליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים נגועים עם PBS פעם. הוסף 20 מ&quot;ל מים RNase ללא קרים כקרח כדי lyse התאים מקרופאג. באמצעות מגרד תא, לגרד את התאים את הצלחת במהירות אך בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים lysed צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. וורטקס למשך 30 שניות. צנטריפוגה ב 800 XG 3 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את supernatant דרך מכשירי סינון באמצעות שואב אבק. בעזרת פינצטה, לגלגל את מסנן ובמהירות ולהעביר אותו 15 מ&quot;ל Coniצינור קאל. צמד להקפיא את הצינורות עם המסננים בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את מנגנון סינון עם מסנן חדש למדגם הבא, כמתואר 1.2.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את המסננים קפואים ב -80 מעלות צלזיוס במשך למחרת. לחלופין, להמשיך ישירות מיצוי חומצות גרעין. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. הפקת חומצות גרעין (יום 3) הערה: בצע את כל המניפולציות עם פתרונות פנול כלורופורם במנדף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1: תערובת 1 של פנול acidified: כלורופורם, 400 μl עבור כל דגימה. מערבבים צינורות נפרדים, ולאחר מכן למשוך את השכבה המימית וכתוצאה מכך על ידי שאיפה. הוסף 40 μl של 10% SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את צינורות המכילים מסנן על קרח כדי לשמור אותם קרים. צינור אחד המכיל מסנן להוסיף 650 μl של אצטט-EDTA (AE) חיץ (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הבאים מהר ככל האפשר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוקף מערבולת הצינור המכיל מסנן כךשמסנן whisks לפריפריה של הצינור ואת החיץ מלא רוחץ את המסנן. תמיד לשמור על צינור קר על ידי הצבת אותו בחזרה על הקרח. הערה: ייתכן שיהיה צורך גם מערבולת הצינור בעוד הפוכה כדי לשטוף את החיידקים באופן מלא את המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עבור כל הצינורות. זה עשוי להיות שימושי כדי לסובב למטה ההשעיה זמן קצר (1 דקות ב 120 XG) בסוף התהליך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חיץ חיידקים המכילים לצינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge המכיל את SDS ותמהיל פנול / כלורופורם (כפי שהוכנו 2.1). חזור על הפעולה עבור כל הצינורות. זה עשוי להיות נחוץ כדי לסובב את הצינורות המכילים מסנן (1 דקות ב 120 XG) שוב כדי לקבל חיץ שיורית מהמסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את כל צינורות 1.5 מ&quot;ל במכשיר מערבולת רב-צינור, מערבולת במלוא המהירות למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצינורות בתוך גוש חום C 65 מעלות במשך 10 דקות. צנטריפוגה במהירות המרבית (&gt; 14,000 XG) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השכבה המימית (כ -400 μl) מכל tUbe לצינור 1.5 מיליליטר חדש המכיל 40 μl של 3 M נתרן יצטט (5.2 pH) ו 1.0 מיליליטר של 100 אתנול%. וורטקס כל צינור ביסודיות. הערה: גליקוגן ניתן להוסיף בשלב זה כדי לשפר להדמיה של הגלולה זרזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הדגימות ב -80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לחלופין, דגירת דגימות ב -20 ° C הלילה. ואז, צנטריפוגה דגימות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות במהירות המרבית (&gt; 14,000 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב את אתנול (שכבה עליונה) מצינור כל. הוסף 500 μl קר 70% אתנול לטעום כל מערבולת ביסודיות. צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות במהירות מרבית (&gt; 1 4,000 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב את אתנול מן צינור אחד. ייבש את הדגימות עבור כ 2 דקות באמצעות מאייד ואקום ללא חום. אל מעל לייבש את הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl מים RNase ללא מדגם זה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. מערבולת ספין למטה בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ריכוז רנ&quot;א tהוא דוגם באמצעות microvolume UV-Vis ספקטרופוטומטר. מצפה לחלץ כ -0.5 - 1 מיקרוגרם של חומצות גרעין לכל צלחת. הערה: משכפל טכני ניתן לשלב בשלב זה. </li></ol> 3. DNase טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התגובה לפי טבלה 1 בתוך שפופרת microfuge. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. להוסיף 450 מים μl RNase ללא ו 500 μl של תערובת פנול-כלורופורם-רשות העתיקות (טבלה 2), שלבים נפרדים על ידי צנטריפוגה במשך 2 דקות במהירות מקסימלית (&gt; 14,000 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את השכבה המימית לצינור חדש ולהוסיף 500 μl תמהיל כלורופורם-רשות עתיקות (טבלה 2), מערבולת שלבים נפרדים על ידי צנטריפוגה 2 דקות במהירות מקסימלית (&gt; 14,000 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השכבה המימית לצינור חדשה ולהוסיף 1 מ&quot;ל של אתנול 50 μl של 3 נתרן אצטט M (pH 5.2). מְעַרבּוֹלֶת. הערה: גליקוגן ניתן להוסיף בשלב זה כדי לשפר להדמיה של הגלולה זרזה. </li><li&gt; דגירה במשך שעה 1 ב -80 ° C. לחלופין, דגירת דגימות ב -20 ° C הלילה. צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות במהירות מקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב את אתנול מן צינור אחד. הוסף 500 μl קר 70% אתנול לטעום כל מערבולת ביסודיות. צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות במהירות מרבית. בזהירות לשאוב את אתנול מן צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את הדגימות עבור כ 2 דקות באמצעות מאייד ואקום ללא חום. אל מעל לייבש את הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 12 μl של RNase ללא מים, דגירה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, מערבולת, ו-למטה ספין. הדגימות מכילות RNA המטוהר, ולשמור אותם על קרח. לחלופין, לפזר רנ&quot;א RNase ללא H 2 O עם 0.1 mM EDTA או חיץ TE (10 מ&quot;מ טריס, 1 mM EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ריכוזים RNA באמצעות microvolume UV-Vis ספקטרופוטומטר. צפה ~ 100 ננוגרם של רנ&quot;א לדגימה (אם משכפל טכני משולבים). הערה: RNA חילוץ על פי פרוטוקול זה מתאים FOניתוח r שעתוק הגנים על ידי מספר רב של טכניקות. אנחנו בדרך כלל להעסיק ניתוח RT-qPCR ללמוד L. חיידקי שעתוק גנים במהלך ההדבקה של תאי מקרופאג 1-4. </li></ol>

<ol><li>Lobel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+regulator+CodY+links+Listeria+monocytogenes+metabolism+to+virulence+by+directly+activating+the+virulence+regulatory+gene+prfA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA.</a> Mol Microbiol. , (2014).</li>
<li>Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+analysis+identifies+isoleucine+and+CodY+as+regulators+of+Listeria+monocytogenes+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence.</a> PLoS Genet. 8 , e1002887(2012).</li>
<li>Kaplan Zeevi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+multidrug+resistance+transporters+and+cyclic+di-AMP%2C+which+contribute+to+type+I+interferon+induction%2C+play+a+role+in+cell+wall+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress.</a> J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).</li>
<li>Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophage+excision+activates+Listeria+competence+genes+that+promote+phagosomal+escape+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence.</a> Cell. 150, 792-802 (2012).</li>
<li>World Health Organization WHO. , 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/en/">http://www.who.int/en/</a> (2005).</li>
<li>Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+of+human+listeriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The epidemiology of human listeriosis.</a> Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).</li>
<li>Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+a+multifaceted+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: a multifaceted model.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).</li>
<li>Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+listeria+monocytogenes+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence.</a> Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).</li>
<li>Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+Listeria+monocytogenes+infection%3A+the+intersection+of+bacterial+pathogenesis+and+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity.</a> J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).</li>
<li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).</li>
<li>Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Mycobacterium+tuberculosis+RNAs+synthesized+in+response+to+phagocytosis+by+human+macrophages+by+selective+capture+of+transcribed+sequences+%28SCOTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).</li>
<li>Toledo-Arana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Listeria+transcriptional+landscape+from+saprophytism+to+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence.</a> Nature. 459, 950-956 (2009).</li>
<li>Schnappinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Adaptation+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+Macrophages%3A+Insights+into+the+Phagosomal+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment.</a> J Exp Med. 198, 693-704 (2003).</li>
<li>Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing-based+discovery+of+the+Chlamydia+trachomatis+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).</li>
<li>La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+whole+bacterial+pathogen+transcription+within+infected+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts.</a> FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).</li>
<li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).</li>
<li>Rienksma, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+insights+into+transcriptional+adaptation+of+intracellular+mycobacteria+by+microbe-enriched+dual+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing.</a> BMC Genomics. 16, 34(2015).</li>
<li>Afonso-Grunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+3%27Seq+using+deepSuperSAGE+uncovers+transcriptomes+of+interacting+Salmonella+enterica+Typhimurium+and+human+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells.</a> BMC Genomics. 16, 323(2015).</li>
<li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).</li>
<li>Becavin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+widely+used+Listeria+monocytogenes+strains+EGD%2C+10403S%2C+and+EGD-e+highlights+genomic+variations+underlying+differences+in+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity.</a> MBio. 5, e00969-e900914 (2014).</li>
<li>Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+gamma-interferon+receptor+that+regulates+macrophage+tumoricidal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity.</a> J Exp Med. 160, 55-74 (1984).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה אופטימיזציה עבור בידוד של RNA חיידקי L. חיידקי חיידקים הגדלים intracellularly בתאים מקרופאג. פרוטוקול זה מבוסס על תמוגה תא הפרש וכולל שני שלבים עיקריים להעשרת RNA חיידקים: שקיעת גרעינים מקרופאג באמצעות צנטריפוגה ואוסף מהיר של חיידקים על ידי סינון. צעדים אלה ואחריו הליך מיצוי RNA סטנדרטי. בעוד פרוטוקול זה מתאר טיהור RNA listerial, זה יכול בקלות להיות שונה חיידקים פתוגנים אחרים. למרות שהשיטה מתמקדת טיהור RNA לניתוח תעתיק, העיקרון ששימשו להפרד...

חיידקים פתוגנים תאיים ─ חיידקים גורמי מחלות זיהומיות מסוגלים לגדול והתחילו להתרבות תאים בתוך צבאות האדם ─ הם דאגה בריאותית משמעותית ברחבי העולם 5. כדי לפלוש לשכפל בתוך תאים יונקים, פתוגנים תאיים רכשו מנגנוני ארסיות מתוחכמים גורמים. בעוד מנגנונים אלה הם יסוד את היכולת לגרום מחלה, אנו יודעים מעט מאוד על רגולצית הדינמיקה שלהם. מאז פרופילי ביטוי גנים של חיידקי גדלי תקשורת נוזלת אינם משקפים את הסביבה בפועל בתוך תאי מארחים, יש צורך הולך וגדל transcriptome המנתח של חיידקים הגדלים נישות התאיות שלהם. ניתוחים כאלה ייאפשרו הפיענוח של עיבודים ספציפיים חיידקים מופעלים על ידי המארח יעזרו לזהות מטרות חדשות עבור עיצוב טיפולי. ניתוח transcriptome של חיידקים גדלו intracellularly הוא מאתגר מאוד מאז RNA יונק במספרם RNA חיידקים ידי בפי עשרה לפחות. בכתב היד הזה, אנו מתארים שיטה ניסיונית לבודד RNA חיידקים מחיידקי חיידקים ליסטריה גדלו בתוך תאי מקרופאג בעכברים. רנ&quot;א החילוץ יכול לשמש כדי לחקור עיבודים תאיים ומנגנונים ארסיים של חיידקים פתוגניים על ידי טכניקות שונות של ניתוח שעתוק, כגון RT-PCR, RNA-seq, microarray וטכנולוגיות מבוססות הכלאה אחרות. ל חיידקים הוא הגורם הסיבתי של ליסטריה בבני אדם, מחלה עם ביטויים קליניים מיקוד אנשי מדוכאי חיסון בעיקר, קשישים ונשים בהריון 6. זה הוא פתוגן התאי פקולטטיבי גראם חיובי כי פולש מגוון רחב של בתאי יונק כי שמשו במשך עשרות שנים כמודל באינטראקציות מארח הפתוגן לומד 7. לאחר הפלישה, הוא שוכן בתחילה בתוך vacuole או phagosome (במקרה של תאים phagocytic), שממנו הוא חייב לברוח לתוך tהוא לארח cytosol התא כדי לשכפל. מספר גורמים ארסיים הוכחו לתווך בתהליך הבריחה, ובעיקר המוליזין יוצרים הנקבובי, Listeriolysin O (LLO) ושני 8 נוסף phospholipases. ב cytosol החיידקים משתמשים במכונות פילמור אקטין המארח כדי להניע את עצמם על סיבי אקטין בתוך התא להתפשט מתא לתא (איור 1). כל הגורמים הארסיים הגדולים של L. חיידקי מעורבי פלישה, הישרדות שכפול תאיים, מופעלים על ידי רגולטור תעתיק ארסיות מאסטר, PrfA. 8-10. בעשור האחרון, מספר מחקרים שנערכו על ידינו ואחרים יישמו בהצלחה שיטות לניתוח transcriptome של חיידקים גדל intracellularly בתוך התאים המארחים 2,11-15. שתי גישות עיקריות משמשות להפריד RNA חיידקים מ-RNA המארח אשר מבוססים על: 1) עשרה סלקטיבית של RNA חיידקים ו -2) בידוד RNA על ידי diffeתמוגה התא rential. הגישה הראשונה מתבססת על כלת תוסף של תמציות RNA סכו למולקולות רנ&quot;א יונקות (למשל באמצעות ערכות זמינות מסחרי) או ללכוד סלקטיבית של רצפים עבדו בקטריאלי (סקוטים) 11. הגישה השנייה מתבססת על תמוגה הפרש של חיידקים ותאי מארח, שבו תאי המארחים הם lysed בעוד תאים חיידקיים נותרו על כנן. תאים חיידקיים אז מופרדים lysate התא המארח, בדרך כלל על ידי צנטריפוגה, ואת RNA מופק באמצעות טכניקות סטנדרטיות. הבעיה העיקרית בגישה זו היא כי יחד עם החיידקים השלמים, גרעיני תאים לארח גם מבודדים, ובכך הכנות RNA עדיין מכילות RNA היונק. אחת דרכים להתגבר על בעיה זו היא להפריד חיידקים שלמים מגרעיני תאי מארחים באמצעות צנטריפוגה הפרש, אבל פרוצדורה בדרך כלל לוקחת זמן שדווח על החשש משינויי פרופיל ביטוי גנים במהלך חילוץ. במאמר זה אנו מציגים ba משופרת ומהירהפרוטוקול חילוץ cteria RNA, אשר מבוסס על גישת תמוגה הפרש תא. ראשית, L. חיידקים נגועים בתאי מקרופאג הם lysed עם מים קרים. לאחר מכן, גרעינים מקרופאג יוסרו על ידי צנטריפוגה קצר וחיידקים שלמים נאספים במהירות על מסננים, שממנו RNA הוא מבודד באמצעות מיצוי פנול-SDS חמים של חומצות גרעין חיידקים.

<table><tbody><tr><td>ליסטריה מונוציטוגנס 10403S</td><td></td><td></td><td>20</td></tr><tr><td>מקרופאגים שמקורם במח עצם שהוכנו מעכברים</td><td></td><td></td> נקבות C57B/<td>6 21</td></tr><tr><td>H2O, RNAse free</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td>ניתן להשתמש במים שטופלו ב-DEPC</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Gibco</td><td>11360-088</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-מרקפטואתנול</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוק</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח-PBS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>עירוי לב מוח (BHI)</td> <td>Merckmillipore</td><td>1104930500</td><td></td></tr><tr><td>פנול pH רווי 4.3</td><td>פישר</td><td>BP1751I-400</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>פישר</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>איזו-אמיל אלכוהול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td>W302406</tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>SDS 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>Merck Millipore</td><td>1070174000</td><td></td></tr><tr><td>37 & deg; C, 5% CO2 אינקובטור אוויר מאולץ</td><td>Thermo Scientific</td><td>דגם 3111</td><td></td></tr><tr><td>מגרדי תאים</td><td>Nunc</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>Kontes מחזיק זכוכית למסנני 45 מ"מ</td><td>פישר</td><td>K953755-0045</td><td></td></tr><tr><td>MF-Millipore מסננים 45&nbsp; מ"מ, 0.45&nbsp; ומיקרו; m</td><td>Merck Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>מערכת SpeedVac Thermo</td><td>Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>דגם G560E</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>145 מ"מ כלי תרבית תאים</td><td>Greiner</td><td>639 160</td><td></td></tr><tr><td>1.7 מ"ל שפופרות, ללא RNase</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>30 מעלות; חממת C</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>65 & deg; בלוק חום C</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; צנטריפוגה שולחנית C</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סטריליות, 25 מ"ל</td> שפופרות <td>גריינר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלקון, 50 מ"ל</td><td>גריינר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חנקן</td><td></td><td></td><td></td> נוזלי</tr></tbody></table>

rna טיהור מן intracellularly grown<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בתאי macrophage

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

ניתוח הטרנסקריפטום של פתוגנים חיידקיים במהלך זיהום ביונקים הוא כלי רב ערך לחקר גנים וגורמים המתווכים זיהום. עם זאת, בידוד RNA חיידקי מתאים או רקמות נגועות הוא משימה מאתגרת, מכיוון ש-RNA של יונקים שולט בעיקר בליזאטים של תאים נגועים. כאן אנו מתארים שיטה אופטימלית לבידוד RNA של חיידקי ליסטריה מונוציטוגנס הגדלים בתוך תאי מקרופאגים שמקורם במח העצם. עם ההדבקה, התאים עוברים ליזה קלה ומסוננים במהירות כדי להשליך את רוב החלבונים וה-RNA המארח, תוך שמירה על חיידקים שלמים. לאחר מכן, RNA חיידקי מבודד באמצעות מיצוי פנול-SDS חם ואחריו טיפול ב-DNase. ה-RNA המופק מתאים לניתוח שעתוק גנים במספר טכניקות. שיטה זו מיושמת בהצלחה במחקרינו על ויסות הגנים של ליסטריה מונוציטוגנס במהלך זיהום של תאי מקרופאגים 1-4. ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כדי לחקור פתוגנים חיידקיים וסוגי תאים אחרים.

מערכת המודל מוצגת באיור 1 וכוללת תאי מקרופאג נגועים ל חיידקי חיידקים, אשר לשכפל cytosol מקרופאג. איור 2 מייצגים את מערך הניסוי. איור 3 מייצג תוצאות אופייניות של ניתוח RT-qPCR כגון גנים ארסיים במהלך WT ל חיידקי צמיחה מקרופאגים בהשוואה לצמיחת BHI הבינוני מעבדה עשירה. התוצאות מראות רמות השעתוק של שני גורמים ארסיים גדולים של L. חיידקים; hly קידוד רעלן LLO ו ACTA קידו...

כאן אנו מתארים שיטה לבידוד RNA חיידקי ליסטריה מונוציטוגנס הגדלים בתוך מקרופאגים של עכברים. ניתן להשתמש בטכניקה זו עם פתוגנים תוך-תאיים אחרים ותאי מארח של יונקים.

RNA טיהור מן intracellularly Grown<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בתאי Macrophage

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק RNA מחיידקים הגדלים תוך-תאיים בתוך תאי מקרופאג. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפתוגנזה החיידקית, כגון, מהם הגורמים בגנים שחיידקים מפעילים כדי לתווך זיהום? היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מעשירה באופן משמעותי את ה-RNA החיידקי תוך מזעור זיהום של חומצות גרעין מהמארח.את הפרוצדורה תדגים אנה פסהצ'נק, סטודנטית לדוקטורט מהמעבדה שלי. כדי להכין תאים להדבקה חיידקית, ביום הראשון, השתמשו בצלחות של 145 מילימטר כדי לזרוע 2×10⁷ מקרופאגים המופקים ממוח העצם, או תאי BMDM, ב-30 מיליליטר של מצע BMDM בתוספת Pen/Strep. דגרו בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 באינקובטור עם זרימת אוויר למשך לילה.בצע הזרעה של תרבית חיידקים של *L.monocytogenes* מסוג wild type לתוך 10 milliliters של מצע brain heart infusion, או BHI. הנח את המבחנות באינקובטור במצב נטוי והדגר בטמפרטורה של 30 degrees Celsius ללא ניעור למשך לילה. למחרת, חמם מראש מצע BMDM ללא אנטיביוטיקה ו-PBS לטמפרטורה של 37 degrees Celsius.לאחר מכן, השתמש ב-25 milliliters של PBS חם כדי לשטוף את שכבת המקרופגים פעמיים להסרת האנטיביוטיקה, לפני הוספת 30 milliliters של מצע BMDM טרי לתאים. בשלב הבא, שטוף את תרבית ה-L.monocytogenes שהודגרה למשך לילה על ידי סבוב של 1.5 milliliters של החיידקים בצנטריפוגה. לאחר מכן, הש

rna-purification-from-intracellularly-grown-listeria-monocytogenes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מאמר זה מתאר שיטה בידוד וטיהור של...

טיהור vacuoles הפתוגן מ<em&gt; הלגיונלה</em&gt; נגועים phagocytes

מקור: Jung, A. L. et al., שלפוחיות הממברנה החיצונית של Legionella pneumophila: בידוד וניתוח הפוטנציאל הפרו-דלקתי שלהם על מקרופאגים. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את הטיפול המקדים במקרופאגים עם שלפוחיות הממברנה החיצונית של לגיונלה פנאומופילה (OMVs) כדי לבחון את השפעתם על שכפול חיידקים. על ידי שינוי האיתות החיסוני של המארח, OMVs הופכים את המקרופאגים למתירניים יותר לזיהום. ספירת מושבות גבוהה יותר בתאים שטופלו, בהשוואה לתאים שלא טופלו, מצביעה על כך ש-OMV מקדמים שכפול של L. pneumophila בתוך...

בדיקת שכפול לגיונלה פנאומופילה במקרופאגים שטופלו מראש בשלפוחיות הממברנה החיצונית

מקור: סיגל, נ., ואחרים. טיהור RNA מ-Listeria monocytogenes תוך-תאית בתאי מקרופאג'.  J. Vis. Exp. (2016).הסרטון הזה מדגים את הבידוד של חיידקים פתוגניים פנימיים ממקרופאגים נגועים שמקורם במח עצם (BMDMs). חיידקים מורשים להיצמד לתאי המארח, וחיידקים לא מחוברים נשטפים. לאחר ההפנמה, מוסיפים אנטיביוטיקה לחיסול חיידקים שאינם מופנמים. תאי המארח עוברים ליזה, צנטריפוגה, והסופרנטנט מסונן כדי ללכוד את החיידקים על נייר סינון, שמוקפא במהירות ומאוחסן לשימוש נוסף.

בידוד חיידקים פתוגניים תוך-תאיים מתאי מארח נגועים

מקור: סיגל, נ., ואחרים. טיהור RNA מ-Listeria monocytogenes תוך-תאית בתאי מקרופאג'. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון הזה מדגים חילוץ RNA מליסטריה מונוציטוגנס שבודדה ממאקרופאגים נגועים בעכברים. הפרוטוקול שומר על RNA, מפרק תאים באמצעות פנול-כלורופורם וחום, ומפריד RNA באמצעות צנטריפוגה. מלח ואתנול, בשילוב עם דגירה קרה, מקדמים את השקיעת RNA. ה-RNA המתקבל לוכד ביטוי גנים המושר על ידי המארח, וחושף אלימות חיידקית ואסטרטגיות הסתגלות.

חילוץ RNA מליסטריה מונוציטוגנס שנקטף ממאקרופאג'ים של עכברים נגועים

בסרטון זה אנו מכמתים מונוציטוגנים ליסטריה מונוציטוגנים תוך-תאיים וחוץ-תאיים, חיידק פתוגני תוך-תאי, בעקבות הדבקתם במקרופאגים בתרבית במבחנה באמצעות ציטומטריית זרימה.

ניתוח ציטומטריית זרימה של מונוציטוגנים ליסטריה חוץ-תאיים תוך תאיים ומתפתחים במבחנה

מאמר זה מתאר שיטה חדשה לזיהום אוראלי של עכברים...

הילוכים אוראלי של<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בעכברים באמצעות בליעה של מזון מזוהם

המקרופאגים כבר מזמן מוכרים כמרכיב קריטי של תגובות חיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. הפיצוץ האחרון של ידע הנוגע להיבטים אבולוציוניים, גנטיים, והביוכימי של האינטראקציה בין מקרופגים וחיידקים חידש את תשומת לב מדעית למקרופאגים. מאמר זה מתאר שיטה להבדיל מקרופאגים ממח העצם של עכבר.

מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

חיידקי ליסטריה הוא פתוגן חיידקים גראם חיובי משמש לעתים קרובות כמודל עיקרי לחקר טפילות תאית. הדמיה מאוחר L. חיידקי לשלבי זיהום בהקשר של מסכי RNA התערבות קטנים מאפשר למחקר העולמי של מסלולים הסלולר נדרשים לזיהום חיידקים של תאי מארח יעד.

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים<em&gt; חיידקי ליסטריה</em

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות להעברה יעילה של קווי תאי מקרופאגים של עכברים עם siRNAs באמצעות מערכת המעבורת Amaxa Nucleofector 96-well, לעורר את המקרופאגים עם ליפופוליסכריד ולנטר את ההשפעות על ייצור ציטוקינים דלקתיים.

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

כאן, אנו מתארים את טיהור pneumophila הלגיונלה (pneumophila L.) שלפוחית הקרום החיצוני (OMVs) מתרבויות נוזלי. שלפוחית ​​מטוהרים אלה משמשות לטיפול מקרופאגים לנתח פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם.

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

אנו מתארים שני מבחני במבחנה, ויוו זיהום זה יכול לשמש כדי לנתח את פעילותם של גורמי קידוד המארח.

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

למדו שיטה לבידוד RNA חיידקי מ-Listeria monocytogenes בתוך מקרופאגים ממקור עצם עכברים. הטכניקה מעשירה RNA חיידקי תוך מזעור זיהום מחומצות גרעין של המארח.

RNA טיהור מן intracellularly Grown

גלה סרטונים נוספים