Name: Denervation כירורגי עורית: שיטה לבדיקת הדרישה עצבה בעכברי מודל של מחלת עור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: למד שיטות לכריתה כירורגית של עצבים בעור עכברים לבחינת השפעתם על הומאוסטזיס ומחלות עור. טכניקות אלה מאפשרות השוואה ישירה בין עור תקין לעור מנוור לחקירת תפקידי העצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לסתיו פיטרסון על הסיוע בצילום עכברים, לדניאל תורסן על הסיוע בעכברים, ולד"ר ניקול וורד ועבד אלמג'יד בלקאדי על הסיוע בניתוק עצבים כירורגי. מחקרים אלה נתמכו על ידי מימון מהמכון הלאומי לדלקת מפרקים ומחלות שרירים ושלד ועור (מענקים R00AR059796 ו-R01AR065409); המחלקה לדרמטולוגיה של אוניברסיטת מישיגן; תוכנית המלגות למדעי הביולוגיה; המרכז לאורגנוגנזה; מרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת מישיגן; וקרן הסרטן ע"ש ג'ון ס. וסוזן ס. מון. S.C.P. נתמך על ידי מימון מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (מענק T32 GM007315). עבודה זו נתמכה גם על ידי תוכנית המחקר הפנימי של ה-NIH, המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן.

כל הנהלים המתואר בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם לתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת מישיגן היחידה לרפואת חיות מעבדה. 1. להשרות שחלוף עכברים הערה: Gli1 TM3 (cre / ERT2) Alj / J זן העכבר (Gli1-CreERT2) 13 מאפשר מיקוד של שחלוף הנגרמת טמוקסיפן כדי TD epithelia. לחצות זן זה עם B6.129S4-GT (ROSA) 26Sor tm1Sor / עכברים הכתב J (LacZ) 22 כדי ליצור Gli1; ​​חיות LacZ לדמיין תאים TD ידי כל הר מכתים להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון טמוקסיפן לריכוז של 12.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בשמן תירס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 1.5 מ&quot;ל, להוסיף עד 20 מ&quot;ג טמוקסיפן גבישי, ולאחר מכן 1 מ&quot;ל של שמן תירס. בתוקף ידביק את הצינור כדי מערבל מערבולת, מערבולת ברציפות על ההגדרה הגבוהה ביותר ב RT עד טמוקסיפן נמס לגמרי (2-4 שעות), כפיאושר על ידי בחינת הצינור תחת מיקרוסקופ לנתח עבור בהעדר חלקיקי טמוקסיפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון צינור 15 מ&quot;ל ו לדלל את טמוקסיפן לריכוז סופי של 12.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​עם שמן תירס נוספים. מערבב על ידי vortexing הפתרון הצמיג עבור 30 שניות נוספות. אחסן את הפתרון הזה עד 1 שבוע ב 4 ° C בחושך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את הפתרון טמוקסיפן intraperitoneally לתוך Gli1; ​​עכברים LacZ, בהיקף של 200 μl לכל 20 גרם של משקל גוף העכבר עבור מנה טמוקסיפן יעיל של 2.5 מ&quot;ג משקל העכבר 20 גר &#39;. </li></ol> 2. ביופסיות עור קציר הערה: בהתאם הניסוי, ביופסיות עור הקציר כמה ימים עד שבועות לאחר אינדוקציה טמוקסיפן. לכל הניתוחים, בצע פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח מכרסם, כולל שימוש בכפפות סטריליות, לובש נטו מסכה או שיער כירורגית, ומכסה את החיה עם וילון ניתוח סטרילי במהלך ההליך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10x ההרדמה המניות על ידי ערבוב 90 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קטמין ו -6.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​xylazine במים. לדלל זה פתרון המניות 01:10 לתוך PBS סטרילי רק לפני השימוש, ולאחסן ב RT בחושך במשך עד 8 חודשים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להרדים עכברי משאיפת isoflurane, החל ריכוז גז של 4% עם חמצן כדי להרדים את החיה באופן מלא, ולאחר מכן לאחר מכן הורדה זה ל 1-2% למשך ההליך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את חומר ההרדמה intraperitoneally במינון של 200 μl לכל משקל גוף 20 גרם העכבר. בדוק כי בעל החיים הגיעו המטוס התקין של הרגעה ידי assay קמצוץ בוהן, ולאשר כי לב ושיעורי נשימה הם נורמליות (כ 600 פעימות ו -160 נשימות לדקה, בהתאמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש גוזז חשמלי להסרת השיער מהאתר של ביופסיה על הגב בחזרה העור, נזהר שלא ניק או ניזק לעור הבסיסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את האתר כירורגית על ידי מנגב את הגילוחתחום ד בכיוון הקדמי אל האחורי באמצעות מגבונים בבטאדין ואלכוהול. ודא כי כל קטעי השיער יוסרו מהאתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התווה את אתר הביופסיה באמצעות טוש שחור, למקם את החיה על כרית חימום באזור כירורגית ספטית, ומכסי וילון ניתוח סטרילי (למטרות הדגמה, וילון סטרילי הושמט כדי להגדיל את נראות). הערה: כדי להשיג סעיפים אורכים של זקיקי שיער, בקצה הארוך יותר של הביופסיה (לקצה להיות מחולק עבור היסטולוגיה, ~ 1 סנטימטר) צריך לרוץ לכיוון קדמי-אחורי (במקביל לכיוון של זקיקי שיער), parasagital כדי קו האמצע הגבה (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אזמל # 11 סטרילי לבצע כריתה בעובי מלאה לאורך האזור המסומן מבלי לפגוע fascia שהרירי הבסיסי. הערה: רקמת העור נכרת כולל את האפידרמיס, הדרמיס, שומן תת עורי ו מִרפָּד carnosus. הדימום הוא בדרך כלל מינימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרדד tהוא נכרת מדגם עור על מגבת נייר יבשה, הדרמיס בצד למטה, לקצץ משם מגבת נייר העודפת, ולאחסן את המדגם בקור PBS עד שעה 1 אם מדגמים אחרים צריכים להיאסף. כאשר מוכן, המשך צעדים 3.1 או 3.2 לעבד דגימות היסטולוגיה, או שלב 4 עבור מכתים כל הר β-galactosidase (LacZ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר לסגור את אתר הביופסיה באמצעות 6-0 תפרי ניילון, דפוס קטע פשוט במרווחים בערך זה מזה 3 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תחזרו עכברים שעברו ניתוח לתוך באותו הכלוב כמו בעלי חיים אחרים עד לאחר החלמה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג חיות מיד לאחר הניתוח עד שהם להכרתו, וגם על בסיס יומי עד אזור הניתוח הגליד, בדרך כלל תוך שבוע 1. השתמש במשככי כאבים על פי הנחיות לטיפול ולשימוש חיה מוסדיות המיועדות אם עכברים להפגין סימנים של כאב או מצוקה. סר תפרים בתוך 7-10 ימים לאחר ניתוח. הערה: במידת הצורך, להכין פתרון כאבים על ידי דילול carprofen (50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​solut המניותיון) 1: 100 במים סטריליים. להזריק את תת עורי פתרון בין השכמות ליד בעורפו, במינון של 200 μl לכל משקל גוף 20 גרם (5 מ&quot;ג / משקל גוף העכבר ק&quot;ג). </li></ol> 3. דוגמאות תהליך עבור היסטולוגיה הערה: כדי לתקן ולעבד את רקמת נכרת, השתמש באחת השיטות שלהלן, בהתאם ליישום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור דגימות היסטולוגית-מוטבע פרפין, לתקן את העור בפורמלין 3.7% ב PBS O / N ב RT ולאחסן באתנול 70% לתקופה של עד 2 שבועות. הסר את מגבת נייר לפני להטבעה לתוך פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקת דגימות היסטולוגית קפוא, להטביע את הרקמה paraformaldehyde 4% קר PBS ולנער בעדינות במשך שעה 1. הסר את הפתרון ולשטוף את המדגם עם 3 שינויים של PBS, בערך 5 דקות כל אחד. לאחר מכן, להטביע את המדגם ב סוכרוז 30% ב PBS cryoprotect הרקמה ( &quot;טביעת סוכרוז&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם רעד O / N עדין על 4 מעלות צלזיוס. למחרת, להסיר את גרר נייראל לקצץ משם רקמת שומן עודף מצד העור של העור. הטמע הרקמה ישירות לתוך אוקטובר ולאחסן את הגוש הקפוא ב -80 מעלות צלזיוס. הערה: לאחר חתך, או פרפין או דגימות קפואות יכול להיות מוכתם על ידי אימונוהיסטוכימיה לזהות TDS, תאי מרקל והעצבים באמצעות נוגדנים נגד קראטין 17, קראטין 8 ו neurofilament, בהתאמה, כפי שתואר לעיל 5,19. </li></ol> 4. דוגמאות דמיינו ידי כל הר LacZ מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון מכתים X-gal. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב monobasic פוספט 0.94 גרם נתרן, ו dibasic פוספט נתרן 2.6 גרם ב 250 מ&quot;ל של מים סטריליים. התאם ל- pH 7.3. כדי זה, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של 1 M מגנזיום כלוריד, 0.528 גרם של פרוציאני אשלגן, ו 0.412 גרם של ferricyanide אשלגן. הוסף 250 μl של גליקול octylphenyl-פוליאתילן 125 מ&quot;ג של deoxycholate. פתרון הבסיס יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 50x המנייה X-gal solutiעל ידי הוספת dimethylformamide לבקבוק X-gal המניות לייצר פתרון 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל. אחסן את הפתרון הזה ב -20 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני השימוש, לדלל המניה X-gal פתרון 1:50 לתוך פתרון בסיס X-gal לייצר פתרון מכתים. עבור ביופסיות קטנות (&lt;1 סנטימטר 2), aliquot 1-2 מיליליטר של תמיסת מכתים לדגימה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן במדגם העור שנאספו שלב 2.7 בתמיסה המכילה glutaraldehyde 2% paraformaldehyde / 0.2% ב PBS קר למשך 30 דקות, רועד בעדינות על הקרח. עבור ביופסיות קטנות (&lt;1 סנטימטר 2), להשתמש 1-2 מיליליטר של תמיסה מקבעת לדגימה. הערה: לחילופין, לתקן דגימות paraformaldehyde 2-4% בלבד, או ב glutaraldehyde 0.5% בלבד. תנאי קיבעון אופטימלי תלוי הרקמה, מידת הביטוי LacZ ויישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון מקבע, ולשטוף דגימות עם 3 שינויים של PBS, 5 דקות כל אחד, על שייקר ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מגבת נייר מתחת מדגם וחותכים ממנו excesזה רקמה שומן מצד העור של העור על ידי אחיזת השומן עם מלקחיים בוטים הזמירה במספריים לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול המדגם בתמיסה מכתים X-gal, לדגור על 37 מעלות CO / N. LacZ הביטוי יהיה גלוי כמו כתם כחול תחת מיקרוסקופ לנתח (איור 1 ב). הערה: אם עוצמת האות חלשה, להחליף את הפתרון המכתים למחרת וחזור על דגירת O / N. אם מכתים הרקע הוא אינטנסיבי מדי, לצמצם את הזמן של מכתים, או דגירה המדגמת ב RT במקום 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון מכתים ולשטוף את דגימות 3 שינויים של PBS המכיל DMSO 3% למשך כ 5 דקות, רועד בעדינות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות 2-3 שינויים של אתנול 70% במשך 5 דקות כל אחד. חנות דגימות באתנול 70%. </li></ol> 5. denervation כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה כמו בשלב 2.2 ו לגלח את עור הגב כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את אזור הניתוח of העור בחזרה את השימוש במגבונים בבטאדין ואלכוהול, ולכסות את חיה עם וילון ניתוח סטרילי (למטרות הדגמה, הושמט וילון סטרילי כדי להגדיל את הנראות). שמור על חמי החיה באמצעות כרית חימום תוך שפעל באזור כירורגית ספטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך באמצעות אזמל # 11 סטרילי לאורך קו האמצע הגב מבסיס הצוואר בערך 0.5 ס&quot;מ מעל הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בוטים, לשקף את העור בעדינות בצד השמאל מן האגף לדמיין את הרקמה הבסיסית מן רפידות שומן גלימה ליד הצוואר כדי בדיוק מעל הגפיים האחוריים. הערה: עצבי עורית הגבו להופיע שערות לבנות כמו זה לנסוע caudally דרך fascia השקוף של הקיר בתא המטען לפני ביצוע עיקולים חדים והזנת רקמת החיבור הרופפת מתחת לפני העור (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים Ultra- בסדר תחת מיקרוסקופ אור לנתח, להסיר את העצבים באופן בלעדי מצד שמאל של אנימהl ממוקם באתרים אנטומיים T3-12 ידי מריטת מאיפה העיקול מגזרים בכותל המטען לאתרים כניסתם לתוך העור (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחי אוריינט אנכיים ולהסיר את העצבים תוך כדי אחיזה כ 0.5 סנטימטרים מתחת לאתרי העיקול שלהם ומושכים כלפי מעלה, גורם חוצפה למתוח ולהפריד מן הרקמה הסובבת (איור 2 ג - ה). היזהר, כדי למנוע פקיעת כלי דם סמוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עד שכל העצבים המשתרעים קיר בתא המטען על העור יוסרו. אין לשבש את העצבים בתוך fascia הצפופה של הקיר בתא המטען. שמור על הרקמות לחות לאורך כל ההליך על ידי יישום טיפות התקופתי של תמיסת מלח סטרילית 0.9%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להסיר עצבים ידי אחיזת קצוות הפרוקסימלי ליד הקיר בתא המטען עם מלקחיים הוא גזרה במספריים בסדר. לאחר מכן, לנתק את הקצוות הדיסטלי ליד העור (איורים 2F - H). לבסוף, להסיר את intervening מגזרים עצבים (2I איור). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל העצבים מן דש העור נחשף שלב 5.4. סיבים אלו מהווים סניפים המרוחקים של עצבים עורית הגבה ומופיעים כמו שערות לבנות הסתעפות הממוקמת באופן ספוראדי בתוך רקמת חיבור בצד העור של דש העור (2J ומספרים - K). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר אלה סניפים בסדר, למקם את המלקחיים בסדר בערך במקביל אל פני שטח עורי, לתפוס את העצבים למרוט כלפי מעלה כדי למנוע שיבוש כלי דם ניקוב העור. המשך עד שכל העצבים הגלויים הוסרו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דיסקציה בוטה, לשקף את העור בצד ימין של חתך קו אמצע הגב, אבל לא להסיר את העצבים. זה ישמש את שליטת דמה מופעלים הנגדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר לאורך קו האמצע הגב בדפוס קטע פשוט כדי לסגור את החתך. לפקח על בעלי חיים בזמן תהליך ההחלמה-אופר פוסטatively כפי שהוכח בעבר (שלבים 2.8-10). סר תפרים בתוך 7-10 ימים לאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי תפקודי להעריך עד denervation יציבה עד מספר שבועות לאחר ניתוח, להסיר את השיער מן העור הגבה באמצעות גוזז חשמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לדקור את שטח העור denervated באמצעות מחט המזרק, ושים לב אם מגיבה החיה, בדרך כלל על ידי רעדה או לסובב את הראש שלה. אם אזור העור כבר denervated ביציבות, החיה תפגין נמוכה, אם בכלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות טוש שחור, המתאר את השטח של תשובה, כמו גם שטח של גודל ומיקום דומים בצד הדמה הנגדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף ביופסיות מאתרים אלה כמו שלבים 2.1-2.9 לניתוח. הערה: לחלופין, הגבה כולו בחזרה העור, כוללים אזורי denervated ו דמה מופעל, ניתן להסיר כסיד יחיד עבור מכתים כל הר, בדומה כמתואר שלב 4. </li></ol>

<ol><li>Magnon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomic+nerve+development+contributes+to+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression.</a> Science. 341, 1236361(2013).</li>
<li>Zhao, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denervation+suppresses+gastric+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Denervation suppresses gastric tumorigenesis.</a> Sci Transl Med. 6, 115(2014).</li>
<li>Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenic+inflammation+and+the+peripheral+nervous+system+in+host+defense+and+immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogenic inflammation and the peripheral nervous system in host defense and immunopathology.</a> Nat Neurosci. 15, 1063-1067 (2012).</li>
<li>Gautron, L., Elmquist, J. K., Williams, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+control+of+energy+balance%3A+translating+circuits+to+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neural control of energy balance: translating circuits to therapies.</a> Cell. 161, 133-145 (2015).</li>
<li>Peterson, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cell+carcinoma+preferentially+arises+from+stem+cells+within+the+hair+follicle+and+mechanosensory+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within the hair follicle and mechanosensory niches.</a> Cell Stem Cell. 16, 400-412 (2015).</li>
<li>Ostrowski, S. M., Belkadi, A., Loyd, C. M., Diaconu, D., Ward, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+denervation+of+psoriasiform+mouse+skin+improves+acanthosis+and+inflammation+in+a+sensory+neuropeptide-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Cutaneous denervation of psoriasiform mouse skin improves acanthosis and inflammation in a sensory neuropeptide-dependent manner.</a> J Invest Dermatol. 131, 1530-1538 (2011).</li>
<li>Ward, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+neurotoxin+A+decreases+infiltrating+cutaneous+lymphocytes+and+improves+acanthosis+in+the+KC-Tie2+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Botulinum neurotoxin A decreases infiltrating cutaneous lymphocytes and improves acanthosis in the KC-Tie2 mouse model.</a> J Invest Dermatol. 132, 1927-1930 (2012).</li>
<li>Roggenkamp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+nerve+fibers+modulate+keratinocyte+growth+via+neuropeptide+signaling+in+an+innervated+skin+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epidermal nerve fibers modulate keratinocyte growth via neuropeptide signaling in an innervated skin model.</a> J Invest Dermatol. 133, 1620-1628 (2013).</li>
<li>Riol-Blanco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+sensory+neurons+drive+interleukin-23-mediated+psoriasiform+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nociceptive sensory neurons drive interleukin-23-mediated psoriasiform skin inflammation.</a> Nature. 510, 157-161 (2014).</li>
<li>Zanchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+toxin+type-A+for+the+treatment+of+inverse+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Eur+Acad+Dermatol+Venereol%22%5BJournal%5D)">Botulinum toxin type-A for the treatment of inverse psoriasis.</a> J Eur Acad Dermatol Venereol. 22, 431-436 (2008).</li>
<li>Farber, E. M., Lanigan, S. W., Rein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+psychoneuroimmunology+in+the+pathogenesis+of+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cutis%22%5BJournal%5D)">The role of psychoneuroimmunology in the pathogenesis of psoriasis.</a> Cutis. 46, 314-316 (1990).</li>
<li>Dewing, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remission+of+psoriasis+associated+with+cutaneous+nerve+section%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Remission of psoriasis associated with cutaneous nerve section.</a> Arch Dermatol. 104, 220-221 (1971).</li>
<li>Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve-derived+sonic+hedgehog+defines+a+niche+for+hair+follicle+stem+cells+capable+of+becoming+epidermal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 552-565 (2011).</li>
<li>Liao, X. H., Nguyen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+expression+of+Lgr6+is+dependent+on+nerve+endings+and+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epidermal expression of Lgr6 is dependent on nerve endings and Schwann cells.</a> Exp Dermatol. 23, 195-198 (2014).</li>
<li>Lumpkin, E. A., Marshall, K. L., Nelson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+touch%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of touch.</a> J Cell Biol. 191, 237-248 (2010).</li>
<li>Maricich, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merkel+cells+are+essential+for+light-touch+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Merkel cells are essential for light-touch responses.</a> Science. 324, 1580-1582 (2009).</li>
<li>Reinisch, C. M., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+touch+dome+in+human+skin+is+supplied+by+different+types+of+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The touch dome in human skin is supplied by different types of nerve fibers.</a> Ann Neurol. 58, 88-95 (2005).</li>
<li>Doucet, Y. S., Woo, S. H., Ruiz, M. E., Owens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+touch+dome+defines+an+epidermal+niche+specialized+for+mechanosensory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The touch dome defines an epidermal niche specialized for mechanosensory signaling.</a> Cell Reports. 3, 1759-1765 (2013).</li>
<li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Hedgehog+signaling+maintains+stem+cell+renewal+in+the+sensory+touch+dome+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Neural Hedgehog signaling maintains stem cell renewal in the sensory touch dome epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112, 7195-7200 (2015).</li>
<li>English, K. B., Van Norman, D. K. -V., Horch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chronic+denervation+in+type+I+cutaneous+mechanoreceptors+%28Haarscheiben%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Effects of chronic denervation in type I cutaneous mechanoreceptors (Haarscheiben).</a> Anat Rec. 207, 79-88 (1983).</li>
<li>Burgess, P. R., English, K. B., Horch, K. W., Stensaas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+in+the+regeneration+of+type+I+cutaneous+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patterning in the regeneration of type I cutaneous receptors.</a> J Physiol. 236, 57-82 (1974).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-71 (1999).</li>
<li>Wright, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atoh1%2B+progenitors+maintain+the+Merkel+cell+population+in+embryonic+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atoh1+ progenitors maintain the Merkel cell population in embryonic and adult mice.</a> J Cell Biol. 208, 367-379 (2015).</li>
<li>Kumar, A., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+dependence+in+tissue%2C+organ%2C+and+appendage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration.</a> Trends Neurosci. 35, 691-699 (2012).</li>
<li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+reveals+nerve-dependent+and+independent+roles+on+mammalian+hind+limb+tissue+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis reveals nerve-dependent and independent roles on mammalian hind limb tissue maintenance and regeneration.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111, 9846-9851 (2014).</li>
<li>Ueno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+corneal+stem%2Fprogenitor+cells+on+ocular+surface+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Dependence of corneal stem/progenitor cells on ocular surface innervation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 867-872 (2012).</li>
<li>Westphalen, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+intestinal+tuft+cells+serve+as+colon+cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells.</a> J Clin Invest. 124, 1283-1295 (2014).</li>
<li>Uhmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hedgehog+receptor+Patched+controls+lymphoid+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The Hedgehog receptor Patched controls lymphoid lineage commitment.</a> Blood. 110, 1814-1823 (2007).</li>
<li>Lau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+gene+deletion+in+sensory+ganglia+using+a+tamoxifen-inducible+Advillin-Cre-ERT2+recombinase+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-Cre-ERT2 recombinase mouse.</a> Mol Pain. 7, 100(2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עצבים לשרת פונקציות חיוניות לא רק תחושה, אלא גם בפיתוח איבר יונק, בשמירה ובחידוש 13,24-27. כפי עצבים היו מעורבים לאחרונה בהפרעות עור מגוונות, הטכניקות המתוארות כאן יכולות לשמש כדי לחקור את דרישת העצבוב במגוון דגמי המחלה בבעלי החיים. למעשה הטכניקה denervation חד-צדדית מאפשרת השוואה ישירה של העור או עם העצבים שלא ניזוקו או שיבשו מאותו עכבר. זה מספק בקרה פנימית אידיאלית כדי לפצות על הבדלים חי אל-חיה, עם הנתונים הבאים מנתחת עשיית שימוש של מבחן t מזווג. <p class="jove_co...

במהלך השנים האחרונות חלה הערכה הולכת וגוברת להשפעת העצבים על מחלות שאינן נחשבות בדרך כלל לנוירופתיות קלאסיות1-4. בעור, עדויות ניסיוניות עדכניות הצביעו על כך שעצבים תחושתיים יכולים לווסת פתולוגיות מגוונות החל מפסוריאזיס ועד לסרטן5-9. זה הוכח באמצעות טכניקות כמו ניתוק עצבים כירורגי ועיכוב פרמקולוגי של תפקוד עצבי במכרסמים. במקרה של פסוריאזיס, מחקרים אלה סיפקו מסגרת מכניסטית להבנת מדוע פלאק פסוריאזי אנושי נסוג בעקבות אובדן תפקוד עצבי7,10-12.
עצבים עוריים יכולים גם להשפיע על ביטוי גנים13,14 והם קריטיים לחישה מכנית בעור רגיל15. בפרט, אפיתל כיפת מגע (TD) מורכב מטלאי של תאי אפידרמיס עמודיים בסמיכות לתאי מרקל נוירואנדוקריניים המועצבים על ידי הסתגלות איטית של סיבי עצב מסוג 1 (SA1)16-18. TDs מתווכים תחושת מגע קלה והוכח שהם מציגים פעילות מסלול קיפוד5,19. תחזוקת TD תלויה בעצבוב20,21, מכיוון שהעצבים מפרישים ליגנדים של קיפוד כדי לקיים TDs תקינים ותאי מרקל הקשורים אליהם19. בנוסף, עצבוב מקדם היווצרות גידול תלוי קיפוד מאפיתל TD5. יחד, מחקרים אלה מחזקים את הרעיון שאינטראקציות מולקולריות מורכבות המתרחשות בין עצבים לתאים הסובבים בנישה שלהם חיוניות לפיזיולוגיה תקינה של TD כמו גם למחלות.
כדי לחקור את אופי האינטראקציות הללו, אנו מתארים כאן סדרה של טכניקות in vivo למניפולציה של ביטוי גנים ב-TD, כמו גם לקצירת ביופסיות עור להדמיית TD לאחר מעקב אחר שושלת. לבסוף, אנו מתארים נהלים לביצוע ניתוק עצבים כירורגי חד צדדי, שבו עצבים מוסרים מצד אחד של עור הגב של העכבר, תוך השארת הצד הנגדי שלם כבקרה פנימית מזויפת. מספר שבועות לאחר הניתוח, משווים עור מנותק עצבים ועור דמה כדי להעריך את השינויים המתרחשים בעת כריתת עצבים. למרות שטכניקות אלה מתוארות בהקשר של TDs נורמליים, הליך ניתוק העצבים שימש לבחינת הדרישה לעצבים במודלים של עכברים של פסוריאזיס6, ריפוי פצעים13 וגידול5. לבסוף, מכיוון שהעור פתוח לביופסיות חוזרות, זה מספק הזדמנות לעקוב אחר גורלם ארוך הטווח של תאים מסומנים או להעריך את התקדמות המחלה על פני מספר נקודות זמן.

<table><tbody><tr><td>רפידות הכנה לאלכוהול</td><td>PDI</td><td>B339</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed (קסילזין)</td> <td>Lloyd</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן, אנטי קרטין 8</td><td>מחקרים התפתחותיים Hybridoma Bank</td><td>TROMA-I</td><td>נוגדן חולדות, שימוש בריכוז 1:500</td></tr><tr><td>נוגדן, אנטי קרטין 17</td><td>Cell Signaling</td><td>#4543</td><td>נוגדן ארנב, שימוש בריכוז 1:1,000</td></tr><tr><td>נוגדן, אנטי-נוירופילמנט</td><td>איתות תאים</td><td>C28E10</td><td>נוגדן ארנב, שימוש בריכוז 1:500</td></tr><tr><td>רפידות הכנה בטדין Medline</td><td></td><td>MDS093917</td><td></td></tr><tr><td>קרפרופן (רימדיל)</td> <td>Zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קוצץ נטען אלחוטי</td><td>גוזם Wahl</td><td>דגם 8900</td><td></td></tr><tr><td>שמן תירס</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>שימוש בריכוז 1:1,000</td></tr><tr><td>דאוקסיכולט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>קרם אפילציה</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>דימתילפורמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>319937</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge עט</td><td>וקטור מעבדות</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>קטמין HCl</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו כיסוי זכוכית</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו שקופיות</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>10% פורמלין ניטרלי חוצץ</td><td>VWR</td><td>BDH0502-4LP</td><td></td></tr><tr><td>6-0 תפרי ניילון</td><td>DemeTECH</td><td>NL166012F4P</td><td></td></tr><tr><td>אוקטילפניל-פוליאתילן גליקול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. תרכובת</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Pottasium ferrocyanide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Pottasium ferricyanide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>טמוקסיפן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים במיוחד</td><td>Dumont</td><td>0103-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Roche</td><td>10 651 745 001</td><td>להמיס בדימתילפורמיד ליצירת מלאי פי 50 לפני השימוש</td></tr></tbody></table>

denervation כירורגי עורית: שיטה לבדיקת הדרישה עצבה בעכברי מודל של מחלת עור

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

עצבים סומטוסנסוריים עוריים מתפקדים כדי לזהות גירויים מגוונים הפועלים על העור. בנוסף לתפקידיהם החושיים המבוססים, מחקרים אחרונים הציעו כי עצבים עשויים גם לווסת הפרעות עור כולל אטופיק דרמטיטיס, פסוריאזיס וסרטן. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לבדיקת הדרישה לעצבים בשמירה על איבר מכני-סנסורי עורי, כיפת המגע (TD). באופן ספציפי, אנו דנים בשיטות לתיוג גנטי, קציר והדמיה של TDs על ידי צביעה שלמה, ולביצוע ניתוק עצבים כירורגי חד צדדי על עור הגב האחורי של העכבר. יחד, ניתן להשתמש בגישות אלה כדי להשוות ישירות את המורפולוגיה של TD וביטוי גנים בעור מנותק עצבים כמו גם בעור המופעל על ידי דמה מאותה חיה. ניתן גם להתאים שיטות אלה בקלות כדי לבחון את הדרישה לעצבים במודלים של פתולוגיה של העור בעכברים. לבסוף, היכולת לדגום שוב ושוב את העור מספקת הזדמנות לעקוב אחר התקדמות המחלה בשלבים ובזמנים שונים לאחר התחלתה.

על ידי עכברי יצירה להביע טמוקסיפן-מושרת Gli1-CreERT2 ו אלל כתב LacZ, אפשר לדמיין epithelia TD ולעקוב אחר גורלם של תאים אלה לאורך זמן. הליך denervation כולו בדרך כלל ניתן להשלים בתוך 1 hr לכל עכבר וצריך לגרום למצוקה מינימאלית לחיה. המחקרים הקודמים שלנו הראו כי עצבים חיוניים לשמירה הן TDs רגיל וכן תאי קרטין 8 + מרקל הקשור...

מאמר זה כולל פרוטוקולים מפורטים לתיוג גנטי של עור עכבר, ניתוק עצבים כירורגי, ביופסיית עור והדמיה של אפיתל מסומן על ידי צביעת β-גלקטוזידאז שלמה. ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי לבדוק את הדרישה לעצבים במודלים של עכברים בעלי עור רגיל ופתולוגי.

Denervation כירורגי עורית: שיטה לבדיקת הדרישה עצבה בעכברי מודל של מחלת עור

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון את השפעתם של עצבים על עור תקין ועור פתולוגי. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של עור תקין, כגון האם עצבים עוריים משפיעים על ההומאוסטזיס ועל מחלות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשוות בין דגימות עור שלמות לדגימות עור ללא עיצוב עצבי (denervated) מאותו בעל חיים.הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית, שכן עלול להיות קושי בזיהוי העצבים ובהסרתם תוך גרימת נזק מינימלי לרקמות הסובבות. ראשית, הרדימו את העכבר ובדקו באמצעות צביטה בבוהן כי הוא הגיע לרמת הסדציה המתאימה. כמו כן, ודאו כי העכבר מפגין נשימה ודופק תקינים.כעת הניחו את בעל החיים על משטח חימום באזור ניתוח סטרילי. בעזרת מכונת תספורת חשמלית, הסירו בזהירות את הפרווה מהצד הגבי (דורסלי) ממנו תילקח הביופסיה. לאחר מכן, נגבו את האזור הגולח באמצעות Betadyne ומגבונים עם אלכוהול.ודאו שכל גזירי השיער הוסרו מהאתר. כעת סמנו את גבולות אתר הביופסיה באמצעות טוש שחור. כדי לקבל חתכים אורכיים של זקיקי שיער, הקצה הארוך של הביופסיה צריך להיות מכוון בכיוון קדמי-אחורי (anterior to posterior), במקביל לקו האמצע הגבי (dorsal midline).באמצעות סכין מנתחים, בצעו כריתה בעובי מלא ללא פגיעה בפסיה השרירית שמתחתיה. הדימום הוא בדרך כלל מינימלי. דגימת הביופסיה צריכה לכלול את האפידרמיס, הדרמיס, השומן התת-עורי ואת ה-panniculus carnosus.שטחו את דגימת העור שהוצאה על נייר סופג יבש, כאשר צד הדרמיס פונה כלפי מטה. גזרו את עודפי נייר הסופג, ואשמרו את הדגימה ב-TBS קר למשך עד שעה אם יש צורך באיסוף דגימות נוספות. חזרו לעכבר, ותפרו את מקום הביופסיה באמצעות תפרי nylon 60 במרווחים של כ-3 מילימטרים.לאחר מכן, יש להשגיח על העכבר בכלוב התאוששות עד שיחזור להכרה. יש להשתמש במשככי כאבים בהתאם להנחיות המוסדיות שנקבעו לטיפול בבעלי חיים, ולפעול על פי ההנחיות הללו אם העכבר נראה במצוקה. תוך שבעה עד 10 ימים מהניתוח, יש להסיר את התפרים.המשיכו בעיבוד הביופסיות לצורך היסטולוגיה או צביעת whole-mount. הרדימו את בעל החיים, גלחו את כל העור הגבי, ונקו את האזור באופן דומה להליך הביופסיה. כעת, בצעו חתך באמצעות סכין מנתחים סטרילית לאורך קו האמצע הגבי, מבסיס הצוואר ועד למרחק של כחצי סנטימטר מעל הזנב.באמצעות פינצטה קהה סטרילית, הרחיקו בעדינות את העור מהצד השמאלי הרחק מהשוק כדי לחשוף את הרקמה שמתחתיה, החל מכריות השומן של השכמה ליד הצוואר ועד למעלה מהגפה האחורית. כעת זהו את העצב העורי הגבי (dorsal cutaneous nerve) תחת מיקרוסקופ סטריאו. אלו נראים כחוטים לבנים הנעים לכיוון הזנב (caudally) דרך הפציה השקופה של דופן הגו, לפני שהם מבצעים פנייה חדה ונכנסים לרקמה החיבורית הרפויה שמתחת לעור.בשלב הבא, בעזרת פינצטה עדינה במיוחד, הסר את העצבים אך ורק מהצד השמאלי של החיה, הממוקמים באתרים אנטומיים T3 עד T12, על ידי תלישתם מהנקודה שבה המקטעים שלהם מתכופפים בדופן הגו עד לאתרי כניסתם לעור. כוון את הפינצטה בצורה אנכית ואחז בעצבים כחצי סנטימטר מתחת לאתרי הכיפוף שלהם. לאחר האחיזה, משוך כלפי מעלה כדי לגרום לעצבים להימתח ולהיפרד מהרקמה הסובבת אותם לצורך הסרתם.הימנעו מפגיעה בכלי דם סמוכים. הקפידו לשמור על הרקמה לחה לאורך כל הפרוצדורה באמצעות הגבלה תקופתית של טיפות תמיסת saline 0.9%.בשלב הבא, הסירו כל עצב מתוך מקשרית העור החשופה. סיבים אלו מהווים את הענפים הדיסטליים של העצב העורי הגבי, והם נראים כחוטים לבנים ומסועפים הממוקמים באופן ספורדי בתוך הרקמה החיבורית בצד הדרמי של מקשרית העור. כדי להסיר ענפים דקים אלו, מקמו את הפינצטה במקביל בקירוב לפני השטח הדרמי, תפסו את העצב ומשכו אותו כלפי מעלה.הסר את כל העצבים הגלויים באופן זה. אין לנקב את כלי הדם ואת העור. במהלך שלב זה, חשוב להימנע מקרע של כלי דם סמוכים.אם מצאתם עצב עם כלי דם סמוך, עקבו אחריו עד לאזור שבו אין כלי דם סמוך והסירו אותו באמצעות תלישה. כעת, שחררו את העור בצד ימין של החתך בקו האמצע הגבי, אך אל תסירו עצבים כלשהם. אזור זה ישמש כביקורת ניתוח דמה (sham) בצד הנגדי.לבסוף, תפרו את פצע החיתוך של בעל החיים ועקבו אחריו לאחר הניתוח כפי שנעשה קודם לכן. מאוחר יותר, כדי לאשר את האובדן היציב של העצבים, שבועות לאחר הניתוח, דקרו בעדינות את האזור שעבר דנרבציה (denervation) באמצעות מחט תת-עורית סטרילית. שימו לב אם בעל החיים מגיב, בדרך כלל על ידי רעד או סיבוב ראשו.אם אזור העור עבר דנרווציה יציבה, בעל החיים יפגין תגובה מועטה או לא יפגין תגובה כלל. בצעו ביופסיות של העור מאזור חסר התגובה ומצד השם (sham) הנגדי כדי לקבל דגימות ניסוייות וביקורת תואמות. מהביופסיות, חשוב לדגום מספר חתכים היסטולוגיים כדי לזהות הבדלים פוטנציאליים בשכיחות או במורפולוגיה של כיפות מגע (touch domes) בין הדגימות של השם לאלה שעברו דנרווציה.זן עכברי ה-glebe one cree ERT2 מאפשר תכווין של רקומבינציה גנטית המושרה על ידי טמוקסיפן לאזורים בעור המציגים פעילות גבוהה של מסלול hedgehog, כגון אפיתל של כיפות המגע (touch dome epithelia). עכברים אלו הורחבו עם עכברי abolaxi reporter כדי להדמיא את אפיתל כיפות המגע. ה-Nodes חיוניים לשמירה הן על כיפות מגע נורמליות והן על תאי מרקל (Merkel cells) הקשורים אליהן.הדבר מודגם ניסויית על ידי אובדן הדרגתי של המורפולוגיה התקינה של כיפת המגע (touch dome), וכן אובדן של תאים ששקעו keratin eight בעקבות דנרבציה (denervation). עצבים חיוניים גם לקידום סיגנל של hedgehog בכיפת המגע, כפי שניטור על ידי ביטוי של Glebe one cree ERE2, וצביעת home-mount beta collective sided מעור תקין (sham) ומעור שעבר דנרבציה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו יש לבצע כריתה כירורגית של עצבי העור הגביים (dorsal cutaneous nerves) כדי לבחון אם עצבים אלו מעורבים בתפקוד תקין של העור או אם הם מווסתים מחלה.ברגע שהטכניקה תשלט, ניתן לבצעה באופן שגרתי ואמין תוך גרימת עקה מינימלית לבעל החיים. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות כגון צביעה פלואורסצנטית של חומצות אמינו כדי לאשר האם העצבים הוסרו לחלוטין מהעור, והאם ביטוי הגנים הושפע.

cutaneous-surgical-denervation-method-for-testing-requirement-for

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פגיעה נחסך עצב מודל החיה מתואר כאן כמו במודל של עכברים של כאב נוירופטי היקפי הבאים denervation חלקית של עצב השת ידי lesioning הענפים השוקה משותף עצב peroneal, עוזבים את העצב sural שנותרו ללא פגע. שינוי ההתנהגות הנובעים allodynia מכני לכמת ידי חוטים פון פריי.

פגיעה ניצלו עצב (SNI) דגם Allodynia מכונות המושרה עכברים

סרטון זה מדגים בדיקת תפקוד עצבי תחושתי במודל עכבר על ידי ניתוק כירורגי של צד אחד והשארת הצד השני כבקרה. התגובה לגירוי מכני מאשרת את תפקידם של העצבים התחושתיים.

בדיקת תפקוד עצבי תחושתי במודל עכבר מעוכב כירורגי

מודל חיתוך רוחב העצב הטיביאלי הוא מודל נסבל היטב, אימות, ושחזור של ניוון שרירים שלד. הפרוטוקול כירורגית המודל מתואר והפגין בC57Black6 עכברים.

חיתוך רוחב עצב הטיביאלי - מודל סטנדרטי לניוון שרירים שלד מושרה denervation בעכברים

כאב נוירופטי הוא תוצאה של פגיעה או מחלה המשפיעה על מערכת החושית. "מודל השרוול" בכאב עצבי בעכברים מורכב מההשתלה של שרוול פוליאתילן סביב הסניף הראשי של העצב השת. אלודיניה מכאנית נבדקה באמצעות חוטי פון פריי.

דגם השת עצב איזוק של כאב נוירופתי בעכברים

אנו מציגים פרוטוקול כירורגי המפרט כיצד לבצע אקסוטומיה של חתך או ריסוק על עצב הפנים בעכבר. ניתן להשתמש באקסוטומיה של עצב הפנים כדי לחקור את התגובה הפיזיולוגית לפגיעה עצבית ולבדוק טכניקות טיפוליות.

Axotomy פנים עצב של עכברים: דגם לחקר תגובת Motoneuron לפגיעה

מחקר זה יוצר מודל ניסיוני של נוירופתיה טהור סיבים קטנים עם resiniferatoxin (RTX). מנה ייחודית של RTX (50 µg/kg) היא אופטימלית לפיתוח מודל נוירופתיה סיבים קטנים המחקה מאפייני המטופל יכול לעזור לחקור את המשמעות nociceptive המולקולרי שבבסיס כאב נוירופתי.

הקמת מודל העכבר של נוירופתיה סיבים קטנים טהור עם אגוניסט Ultrapotent פוטנציאלי קולטן ארעי Vanilloid סוג 1

הניתוח המותאם הוא שיטה פשוטה למודל פגיעה עצבית חסכנית של עכבר או חולדה הדורשת רק קשירה אחת וחתך אחד כדי לפגוע הן בעצבים הפרוניאליים והן בעצבים הסוראליים.

מודל שונה של פגיעה עצבית ניצלת של כאב נוירופתי בעכברים

קשירת עצבים סיאטית חלקית גורמת לכאב נוירופתי כרוני מתמשך, המאופיין בתגובות מוגזמות לגירויים תרמיים ומכניים. מודל עכברי זה של כאב נוירופתי משמש בדרך כלל לחקר טיפולים חדשניים לניהול כאב. מאמר זה מתאר בפירוט את ההליך הכירורגי לשיפור התקינה והשחזור.

קשירת עצבים סיאטית חלקית: מודל עכברי של כאב נוירופתי כרוני לחקר ההשפעה האנטינוסיצפטיבית של טיפולים חדשניים

כתב יד זה מציג פרוטוקול להסרה כירורגית של תאי עצב סימפתטיים מותניים פוסט-גנגליונים מעכבר. הליך זה יאפשר מספר רב של מחקרים שמטרתם לחקור את התפקיד של עצבוב סימפתטי במטרות רקמות דיסטליות.

כריתת סימפתטומיה מותנית כירורגית בעכברים

פרוטוקול זה מציג מודל חולדה הניתן לשחזור באמצעות עצבים תחושתיים כדי לחקות כאבי נוירומה אנושיים ולהעריך טיפולים כירורגיים, ומציע כלי רב ערך למחקר נוירומה תרגומית.

מודל מכרסם כירורגי חדשני לחקר אפשרויות טיפול בכאב נוירומה באמצעות עצבוב שרירים ממוקד דרך העצב הספנוס

למד שיטות לכריתה כירורגית של עצבים בעור עכברים לבחינת השפעתם על הומאוסטזיס ומחלות עור. טכניקות אלה מאפשרות השוואה ישירה בין עור תקין לעור מנוור לחקירת תפקידי העצבים.

Denervation כירורגי עורית: שיטה לבדיקת הדרישה עצבה בעכברי מודל של מחלת עור

גלה סרטונים נוספים