פורמינג Polymersomes ענק בגודל שימוש Rehydration ג'ל בסיוע

המטרה הכוללת של שיטת החזרת נוזלים בסיוע ג'ל היא ליצור בחוזקה שלפוחיות פולימר ענקיות חד-צדדיות שלמות שבהן ניתן לשלוט בקלות על התפלגות גודל השלפוחית. שיטה זו מציעה אלטרנטיבה חזקה להיווצרות שלפוחיות פולימר, שניתן להשתמש בהן כדי לחקור את התכונות הפיזיקליות של הממברנה ולאחר מכן לשלב את השלפוחיות הללו ביישומים ביו-הנדסיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לייצר בקלות מאות שלפוחיות פולימר ענקיות שלמות הרבה יותר מהר ובצורה פחות אינטנסיבית מאשר טכניקות מסורתיות.

לכן, הרעיון לכך עלה כאשר למדנו על טכניקת החזרת הנוזלים בעזרת ג'ל ליצירת שלפוחיות שומנים ענקיות. עם זאת, השיטות הנוכחיות שלנו ליצירת פולימרים ענקיים הן מאתגרות ולעתים קרובות מניבות תשואה נמוכה, ולכן החלטנו להשתמש במתודולוגיה זו כגישה חלופית. התחל את הכנת תמיסת הפולימר על ידי ערבוב חמישה מיליגרם של קופולימר דיבלוק PEO-PBD במיליליטר אחד של כלורופורם בבקבוקון זכוכית עד להמסה מלאה.

הוסף תמיסה של חמישה מיליגרם למיליליטר של פולימר וכלורופורם ותמיסה של מיליגרם אחד למיליליטר של ליפיד וכלורופורם עם תווית פלואורסצנטית לבקבוקון חדש עד לקבלת ריכוז סופי של 99.5 מול אחוז פולימר ו-0.5 אחוז שומן. כדי למזער את האידוי, העבירו את תמיסת הפולימר לבקבוקון אטום עם מכסה עמיד לכלורופורם, ואחסנו אותו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. כדי להתחיל בהכנת סרט אגרוז, הוסף 50 מיליליטר מים ו -0.5 גרם אגרוז רגיל לבקבוק ארלנמאייר בנפח 250 מיליליטר.

מרתיחים דקה אחת בעזרת מיקרוגל. לפני שתמשיך, יש לקרר את תמיסת האגרוז לטמפרטורה שבין 65 ל-75 מעלות צלזיוס כדי למנוע הידבקות לקויה או גושים. לאחר מכן, חתכו את הקצה של קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר והשתמשו בו כדי לזרוק 300 מיקרוליטר מתמיסת האגרוז על פתק כיסוי זכוכית מרובע של 25 מיליליטר.

תוך כדי לבישת כפפות, החזק את קצה החלקת הכיסוי ופזר את האגרוז באופן שווה על פני כל המשטח באמצעות הקצה הארוך של קצה פיפטה נוסף של 1000 מיקרוליטר. הנח את הכיסוי עם הצד כלפי מעלה על פרפילם ודגר אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. המשך על ידי פיפטינג של 30 מיקרוליטר מתמיסת הפולימר שהוכנה בעבר על החלקת הכיסוי המצופה בסרט אגרוז.

החזק את קצה החלקת הכיסוי באצבעות עטויות כפפות ופזר את תמיסת הפולימר על סרט האגרוז בתנועה סיבובית באמצעות הקצה הארוך של מחט בגודל 18. סיים על ידי הנחת הצד הפולימרי של החלקת הכיסוי כלפי מעלה בצלחת פטרי מפלסטיק בתוך מייבש ואקום. פנה את המייבש למשך שעה לפחות כדי להסיר שאריות ממס.

ליצירת פולימזומים, תחילה הדביקו כיסוי היטב לצד הפולימרי של החלקת הכיסוי המצופה על ידי לחיצה עדינה עד שנוצר אטימה הדוקה. לאחר מכן, הוסף 200 עד 500 מיקרוליטר של תמיסת התייבשות לתא. לאחר מכן, הניחו מגבון מעבדה מגולגל רטוב לאורך הקצה הפנימי של צלחת פטרי מזכוכית ליצירת תא לחות.

מניחים היטב את החלקת הכיסוי עם המכסה המודבק לתוך הכלי ומכסים אותו במכסה. מכסים את צלחת הפטרי בנייר כסף כדי למזער את הלבנת הצילום ולאחר מכן מניחים אותה על פלטה חמה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות להשלמת היווצרות פולימרזום. כדי להתחיל בתהליך הדמיית FRAP, הנח את החלקת הכיסוי עם הכיסוי המודבק היטב על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד במעבה מתכוונן.

לאחר מכן, בחר ערכת מסננים המבוססת על השומן הפלואורסצנטי המשמש וכדי לדמות את הפולימזומים על המשטח העליון של החלקת הכיסוי באמצעות מטרת שמן פי 100. כדי לאפיין את נזילות הממברנה באמצעות FRAP, התמקד תחילה בפולימרזום, ולאחר מכן סגור את מעבה המיקרוסקופ לצמצם קטן וודא שקצוות הפולימר נמצאים בתוך שדה התמונה. לאחר מכן, הגדל את חשיפת המצלמה, הסר את כל מסנני הצפיפות הנייטרלית ואפשר לאזור העניין לצלם אקונומיקה למשך 30 עד 60 שניות.

לבסוף, כבה את המנורה ופתח את הקבל במלואו. צמצם את החשיפה להגדרות ההתחלה וצלם תמונות כל 30 שניות למשך שלוש דקות. פתח את תוכנת ניתוח התמונה במחשב המיקרוסקופ וטען את התמונות שנרכשו של הפולימזומים.

הגדר את קנה המידה למדידה על ידי פתיחת התפריט הנפתח ניתוח ובחירה באפשרות הגדר קנה מידה. הזן את יחידות הכיול המתאימות עבור מרחק בפיקסלים, מרחק ידוע ויחידת אורך, ולאחר מכן בחר אישור. לאחר מכן, השתמש בארגז הכלים של הקו וצייר קו המשתרע על קוטר הפולימר שנבחר.

מדוד את קוטר הפולימר על ידי פתיחת התפריט הנפתח ניתוח ובחירה במדידה. כדי לסייע בניתוח, השתמש ב-Control plus D כדי להדפיס את קו המדידה על התמונה לפני המעבר לפולימר הבא. המשך למדוד פולימזומים באמצעות ההליך לעיל והוסף כל מדידה לחלון הנתונים עד להשלמתה.

לבסוף, שמור את הנתונים על-ידי לחיצה על קובץ ושמירה בשם.לחץ על שמור בחלון שנפתח ולאחר מכן פתח את קובץ התוצאות כגיליון אלקטרוני כדי לנתח את הנתונים. פולימרים שנוצרו מסרטי פולימר PEO-PBD שהתייבשו מחדש עם חוצצים שונים צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. התמונות מראות שהפולימרים אינם הומוגניים בגודלם בתנאי ההתייבשות השונים עם קוטר בדרך כלל מתחת ל-10 מיקרומטר.

תמונות אפיפלואורסצנטיות של פולימרים שנוצרו במים בטמפרטורות שונות מראות שככל שטמפרטורת ההתייבשות עולה, נוצרים פולימרים גדולים יותר. חושבו הקוטרים הממוצעים של יותר מ-100 פולימרים שנוצרו במים בטמפרטורות שונות של התייבשות. ב-24 מעלות צלזיוס, הקוטר הממוצע היה 2.93 מיקרומטר, וגדל עד ל-14.04 מיקרומטר ב-70 מעלות צלזיוס.

לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך כשעה אם היא מבוצעת כהלכה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על הפולימזומים בתמיסה כל הזמן. ודא שהכיסוי מחובר היטב להחלקת הכיסוי כדי למנוע דליפה של תמיסת ההתייבשות וייבוש הפולימזומים.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות כגון מיקרוסקופ אלקטרונים כדי להבין תכונות מבניות נוספות של הפולימזומים. טכניקה זו סוללת את הדרך למחקר בביולוגיה סינתטית ובביו-הנדסה לחקור פולימרים כחלופה חזקה וניתנת להתאמה כימית לממברנות שומנים למחקר וממשק אביוטי ביוטי, מחקר אספקת תרופות ומערכות פרוטו-תאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור פולימרים ענקיים באמצעות החזרת נוזלים בעזרת ג'ל, לכוונן את הגודל הכולל של השלפוחיות ולאפיין את שלמות הממברנה שלהן.

אל תשכח שעבודה עם כלורופורם או האגרוז והמחטים עלולה להיות מסוכנת. שימו לב היטב בעת ביצוע הליכים אלה. נקוט באמצעי זהירות כגון עבודה במכסה אדים והשתמש במשקפי מגן וכפפות בכל עת.