Name: Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: למד טכניקת מיקרו-הזרקה ליצירת דגי stickleback טרנסגניים ועריכת גנום באמצעות Tol2, TALENs ו-CRISPR. שיטה זו מאפשרת בדיקת פונקציית גנים ומגבירים בביולוגיה התפתחותית ואבולוציונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי NIH R01 # DE021475 (CTM), גידול NIH Predoctoral הדרכה גרנט 5T32GM007127 (PAE), וכן מלגת מחקר לתארים מתקדמים NSF (NAE). אנו מודים קווין Schwalbach לביצוע BAC recombineering וזריקות, ניק Donde להפקת הנתונים רצף CRISPR סנגר, וקתרין ליפארי עבור משוב מועיל על פרוטוקול ההזרקה.

<ol><li>Bell, M. A., Foster, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+MA+%22The+Evolutionary+Biology+of+the+Threespine+Stickleback%22">The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback</a>. , Oxford University Press. (1994).</li>
<li>Jones, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+basis+of+adaptive+evolution+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks.</a> Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).</li>
<li>Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+assembly+improvement+and+mapping+convergently+evolved+skeletal+traits+in+sticklebacks+with+Genotyping-by-Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing.</a> G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).</li>
<li>Miller, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+skeletal+evolution+in+sticklebacks+is+controlled+by+additive+and+clustered+quantitative+trait+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci.</a> Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).</li>
<li>Shapiro, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+developmental+basis+of+evolutionary+pelvic+reduction+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks.</a> Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).</li>
<li>Colosimo, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+parallel+evolution+in+sticklebacks+by+repeated+fixation+of+Ectodysplasin+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles.</a> Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).</li>
<li>Chan, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+pelvic+reduction+in+sticklebacks+by+recurrent+deletion+of+a+Pitx1+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer.</a> Science. 327 (5963), 302-305 (2010).</li>
<li>O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recurrent+regulatory+change+underlying+altered+expression+and+Wnt+response+of+the+stickleback+armor+plates+gene+EDA%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA.</a> eLife. , e05290(2015).</li>
<li>Cleves, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+tooth+gain+in+sticklebacks+is+associated+with+a+cis-regulatory+allele+of+Bmp6%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).</li>
<li>Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+developmentally+temporal+quantitative+trait+loci+underlie+convergent+evolution+of+increased+branchial+bone+length+in+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks.</a> Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822(2014).</li>
<li>Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+developmental+genetic+features+underlie+stickleback+gill+raker+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution.</a> EvoDevo. 5 (1), (2014).</li>
<li>Ellis, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+and+genetic+mechanisms+underlie+convergently+evolved+tooth+gain+in+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks.</a> Development. 142, 2442-2451 (2015).</li>
<li>Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+linkage+disequilibrium+and+parallel+adaptive+divergence+across+threespine+stickleback+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).</li>
<li>Hohenlohe, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+genomics+of+parallel+adaptation+in+threespine+stickleback+using+sequenced+RAD+tags%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags.</a> PLoS Genet. 6 (2), e1000862(2010).</li>
<li>McKinnon, J. S., Rundle, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+in+nature%3A+the+threespine+stickleback+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Ecol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Speciation in nature: the threespine stickleback model systems.</a> Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).</li>
<li>Shao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+feedback+effects+on+LH+and+FSH%2C+and+photoperiodic+control+of+reproduction+in+male+three-spined+sticklebacks%2C+Gasterosteus+aculeatus%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).</li>
<li>Katsiadaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-spined+stickleback%3A+an+emerging+model+in+environmental+endocrine+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Int.+J.+Environ.+Physiol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption.</a> Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).</li>
<li>Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+local+immunological+adaptation+of+two+stickleback+ecotypes+by+experimental+infection+and+transcriptome-wide+digital+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis.</a> Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).</li>
<li>Barber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sticklebacks+as+model+hosts+in+ecological+and+evolutionary+parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology.</a> Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).</li>
<li>Erickson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+190+base+pair%2C+TGF-%CE%B2+responsive+tooth+and+fin+enhancer+is+required+for+stickleback+Bmp6+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression.</a> Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).</li>
<li>Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+microinjection+protocol+for+making+transgenic+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Behaviour%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks.</a> Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evo-Devo+and+an+expanding+evolutionary+synthesis%3A+a+genetic+theory+of+morphological+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution.</a> Cell. 134 (1), 25-36 (2008).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Hindorff, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+etiologic+and+functional+implications+of+genome-wide+association+loci+for+human+diseases+and+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).</li>
<li>Fisher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+biological+relevance+of+putative+enhancers+using+Tol2+transposon-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).</li>
<li>Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+transposase+of+the+Tol2+element%2C+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish%2C+and+its+transposition+in+the+zebrafish+germ+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).</li>
<li>Kikuta, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transgenesis+using+Tol2+transposon+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Moleculario+Biology%3A+Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors.</a> Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).</li>
<li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).</li>
<li>Kingsley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+genomic+tools+for+molecular+studies+of+evolutionary+change+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Behaviour%22%5BJournal%5D)">New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks.</a> Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).</li>
<li>Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+approach+for+identifying+distant+regulatory+elements+applied+to+the+Gdf6+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene.</a> Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice.</a> BMC Genomics. 10 (1), 477(2009).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Talbot, J. C., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+CRISPR+pipeline+to+reliably+generate+zebrafish+frameshifting+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles.</a> Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).</li>
<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transposon-Mediated+Gene+Trap+Approach+Identifies+Developmentally+Regulated+Genes+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).</li>
<li>Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+compatible+vectors+for+analysis+of+gene+function+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3-new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3-new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) </a>. , 5th Edition, University of Oregon. Press: Eugene, OR. (2007).</li>
<li>Dale, R. M., Topczewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+evolutionarily+conserved+regulatory+element+of+the+zebrafish+col2a1a%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a.</a> Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+Gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

חד-תאי הזרקה עוברת קוצן עבור transgenesis או עריכת הגנום מציג שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, ביחס עוברי דג זברה, הסיסי עוברי קוצן קשה ולעתים קרובות ישבור מחטים. בעיה זו ניתן להתגבר חלקית על ידי שימוש micropipettes זכוכית עבה וחזק וההזרקה בניצב הסיסי (ראה פרוטוקול, איור 2). ההבטחה כי מים כמה שפחות מתווסף עובר (רק מספיק כדי לגרום הסיסי להתנפח ולהרים מן התא) עוזר להפחית קשיות סיסית. הסיסי מתקשה לאורך זמן, כך עובדים במהירות לאחר הרטבת העוברים חשוב. שמירה על העוברים בתא ...

מרכיב בסיסי אחד של הבנה כיצד מגוון ביולוגי המתבקשת הוא לקביעת הבסיסי הגנטי והתפתחותיים של שינויים פנוטיפי התפתחו בטבע. דג עוקצן threespine, Gasterosteus aculeatus, התפתח מודל מצוין לחקר הבסיס הגנטי של אבולוציה. הקוצנים עברו שינויים אבולוציוניים אדפטיבית רבים כמו דגים ימיים יישבו בסביבות מים מתוקים אינספור ברחבי חצי הכדור הצפוני, וכתוצאה מכך מורפולוגיים דרמטי, פיזיולוגיים, ושינויים התנהגותיים 1. בגנום של אנשים מגובה של עשרים ואחד אוכלוסיות קוצן היה רצף והרכיבו, ומפה הצמדה צפיפות גבוהה נוצרה על מנת לשפר יותר את מכלול 2,3. ניסויי מיפוי גנטיים זיהו אזורים גנומית שבבסיס פנוטיפים התפתחו 4 - 6, ובעוד כמה מקרים, התפקידים התפקודיים של גני מועמדים ספציפיים נבדקו 7,8. מספר האזורים גנומית שבבסיס שינויים מורפולוגיים זוהה עם גני מועמדים מבטיחים, אך מועמדים אלו טרם נבדקו מבחינה תפקודית 9 - 12. בנוסף, הקוצנים הם מודלים נפוצים ללימודים של גנטיקה של אוכלוסיות / הגנומיקה 13,14, התפצלות 15, התנהגות 1, אנדוקרינולוגיה 16, ecotoxicology 17, אימונולוגיה 18 ופרזיטולוגיה 19. מחקרים עתידיים בכל אחד מהתחומים הללו ייהנו היכולת לבצע מניפולציות גנטיות תפקודיות הקוצנים. בנוסף מניפולצית רצפי הקידוד שלהם, את התפקידים של גני מועמדים ניתן להעריך על ידי לימוד הרצפים רגולטורית ציס שלהם ועל ידי הגדלה מבחינה תפקודית, קטן, או ביטול הביטוי של גן המועמד. שיטות Microinjection ו transgenesis ב הקוצנים מבוססות היטב 7,8,20 ו בתחילה פותחו באמצעות meganuclease בתיווךשיטה 21 תוארה לראשונה בשנת medaka 22. שיטת microinjection השונה המוצגת כאן כבר אופטימיזציה עבור שניהם transgenesis Tol2 בתיווך ופתחה לאחרונה ריאגנטים עריכת הגנום כולל TALENs ו CRISPRs. שינויי האלמנטים רגולטורית ציס נחשבים קריטי לאבולוציה מורפולוגיים, כמו השינויים רגולטורית ציס יכולים למנוע את ההשלכות השליליות של pleiotropic קידוד מוטציות 23. לכן, בדיקה והשוואת רצפים רגולטורית ציס משוערים הפכה ליעד מרכזי של מספר גדל והולך של מחקרים אבולוציוניים. בנוסף, רוב גרסאות מחלות אנושיות הן גרסאות רגולטוריות 24,25, ומערכות חוליות מודל נדרשים עז ללמוד לתפקד אלמנט רגולטורית ציס וההיגיון. דגים כי לדשן העוברי שלהם כלפי חוץ במספרים גדולים להציע מערכות חוליות רבות עצמה כדי לחקור -regulation cis. מערכת transposon Tol2, שבו foreiDNA GN להיות משולבת בגנום מוקף Tol2 transposase אתרי קישור ושיתוף הזריקו Tol2 transposase mRNA, עובד עם יעילות גבוהה לשילוב בהצלחה פלסמיד בונה לתוך הגנום דגים 26 - 28. בדרך כלל, משפר הפוטנציאל הוא משובטים במעלה הזרם של האמרגן הבזליים (כגון hsp70l 29) ואת הגן כתב ניאון כגון EGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת) או mCherry בתוך עמוד השדרה Tol2 והזריקו עם transposase mRNA 26. תצפית ביטוי של כתב הניאון, בין אם עובר מוזרקים או צאצא עם transgenes משולב ביציבות, מספקת מידע על ויסות spatiotemporal של ביטוי גנים מונעת על ידי המשפר המשוער. בניסויים נוספים, משפרי תוקף ניתן להשתמש בכונן ביטוי יתר ספציפי רקמות של גנים של עניין. באשר לניתוח אזורי רגולטורית ציס גדולים, באיכות גבוהה genom בקנה הכנסic ספריות באמצעות כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי (BACS) נבנו עבור שני הקוצנים ימיים מים מתוקים 30. Bács אלה ניתן recombineered להחליף גן עם גן כתב ניאון בהקשר של (kb 150-200) גדול באזור הגנומי 31. כתב הניאון מתבטא אז דפוס spatiotemporal כפי שנקבע על ידי רצפי רגולציה בתוך BAC. עבור מחקרים בדגים, אתרי Tol2 ניתן להוסיף גם את BAC כדי להקל אינטגרציה הגנומי 32,33. בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות כאשר הכלאה באתרו הוא מאתגר מבחינה טכנית, את ההודעה הניאון של BAC יכול לשמש כדי לחקור דפוסי ביטוי גנים, כפי שהוכח לחלבון קוצן עצם המוךפו&quot;גנטי שהולך 6 (Bmp6) 20. בנוסף, דפוסי ביטוי ניאון אדם יכול להיות במעקב לאורך זמן, אשר לא יכול להיות מושלם עם הכלאה באתרה. Bács יכול לשמש גם כדי להוסיף additionaעותק l של אזור גנומי כדי להגדיל את המינון של גן של עניין. לצורך המחקר של תפקוד הגן, עריכת הגנום הוא השדה המתרחב בפיצוץ, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר שינויים ממוקדים אל רצפי הגנום במגוון רחב של אורגניזמים 34. מפעיל דמוי תמלול nucleases מפעיל (TALENs) הם nucleases מודולרי, ספציפית רצף מבודד במקור פתוגנים צמח יכול להיות מהונדסים בדיוק להיקשר ישירות רצף גנומי של בחירה וליצור גדיל כפול לשבור 35,36. באשכולות בקביעות interspaced חזרות palindromic קצר (CRISPR) / מערכות CAS נמצאו במקור חיידקים להשתמש RNA מדריך ואת החלבון Cas9 כדי ליצור הפסקה ברצף ה- DNA היעד משלים מדריך 37. התיקון בדיעבד של הפסקת הגדיל הכפולה שיצרה שתי TALENs ו CRISPRs לעתים קרובות משאיר אחריו כניסה קטנה או מחיקה, אשר יכול לשבש את הפונקציה של רצף היעד35-37. בשנת הקוצנים, שימשו TALENs לשבש ביטוי גנים על ידי מיקוד משפר 20, ושניהם TALENs ו CRISPRs יצרו בהצלחה מוטציות קידוד רצפים (נתונים שלא פורסמו). פרוטוקול מפורט עבור הדור של CRISPRs לשימוש דג הזברה יכול לשמש כקו מנחה לפתח CRISPRs עבור הקוצנים 38. מהונדס וניסויי עריכת הגנום דורשים מבוא של חומצות גרעין לתוך עובר חד-תאי שהופרה זה עתה. על ידי הצגת כלי transgene או הגנום עריכת בשלב מוקדם של התפתחות, מספר תאי הבת מניפולציות גנטיות בעובר מוגדל. עובר מוזרק אז מוקרנים חזותיים עבור קרינה או הוקרנתי מולקולרי עבור שינויים בגנום. אם תאי תורם germline ממוקדים בהצלחה, את הגן או המוטציה יכול להיות עברה על קבוצת משנה של צאצאים, גם כאשר הקטלניות לאחר הזרקה היא גבוהות. דג הפסיפס ניתן outcrossed אוintercrossed וצאצאיהם הוקרנו לשחזר את אללים מוטנטים או transgene משולב ביציבות של ריבית. פרוטוקול זה מתאר שיטות להכנסת transgenes ריאגנטים עריכת הגנום לעוברי קוצן חד-תאים וניטור עבור שינויים גנומיים מוצלחים.

<table><tbody><tr><td>סטריאומיקרוסקופ עם טרנסתאורה</td><td>Leica</td><td>S6e/KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור ידני</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>MM33</td><td>Marzhauser M33 מיקרומניפולטור</td></tr><tr><td>מערכת אינדקציה בלחץ</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>יחידת לחץ אחורית</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מחזיק מיקרופיפטה</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק בסיס מגנטי</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>בסיס</td><td></td>מגנטי</tr><tr><td>מתג רגל</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>צלחת ברזל (בסיס מגנטי)</td> <td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>בוער / חום Micropipette</td><td>Puller Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות העברה חד פעמיות</td><td>פישר</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>0.5% פנול אדום ב-DPBS</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P0290</td><td>עוקב הזרקה</td></tr> <tr><td>#5 מלקחיים, ביולוגי דומוקסל&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>לשבירת מחט</td></tr><tr><td>צנצנת אחסון מיקרופיפטה</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>מחזיקה מחטים</td></tr><tr><td>6 אינץ', 6 שיניים לאינץ' מסור קיר גבס גבס</td><td>Lenox</td><td>20571 (S636RP)</td> <td>להחזיק ביצים להזרקה</td></tr><tr><td>13 ס"מ x 13 ס"מ צלחת זכוכית</td><td>כל חנות לחומרי בניין-נימי</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>זכוכית בורוסיליקט, 1.0 מ"מ OD/0.58 מ"מ ID&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-F4</td><td>*זכוכית קשה יותר מאשר נימי הזרקת דג זברה</td></tr><tr><td>150 x 15 מ"מ צלחת פטרי</td><td>פישר</td><td>FB0875714</td><td>להעלות עוברי סטיקלבק</td></tr><tr><td>35 מ"מ x 10 מ"מ צלחת פטרי</td><td>פישר</td><td>08-757-100A</td><td>חנות ביצים לפני הזרקה</td></tr><tr><td>מיידית מלח אוקיינוס</td><td>מיידי אוקיינוס מיידי</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין מתאנסולפונאט / MS-222</td><td>ווסטרן כימיקל בע"מ</td><td>MS222</td><td>הרדמת דגים / המתת חסד</td></tr><tr><td>ערכת שעתוק Sp6</td><td>אמביון</td><td>AM1340</td><td>לתמלול של TALENs וטרנספוזאז mRNA</td></tr><tr><td>RNערכת ניקוי קלה</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>לטהר טרנספוזאז או TALEN</td></tr><tr><td>RNA Qiaערכת ניקוי PCR מהירה</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>לנקות פלסמידים עבור הזרקת</td></tr><tr><td>פרוטאינאז K 20 מ"ג/מ"ל</td><td>אמביון</td><td>AM2546</td><td>להכנת DNA</td></tr><tr><td>ערכת נוקלאובונד BAC 100</td><td>קלונטק</td><td>740579</td><td>להכנת BAC DNA</td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>פולימראז</td><td>פישר</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen PlasmidPlus ערכת Midi</td><td>Qiagen</td><td>12943</td><td>מכילה מאגר שטיפת אנדוטוקסין</td></tr><tr><td>מיצוי ג'ל QIAQuick</td><td>Qiagen</td><td>28704&nbsp;</td><td>לריצוף מוטציות המושרות</td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: איזואמיל אלכוהול</td><td>סיגמא</td><td>P2069-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>אתנול (דרגת ביולוגיה מולקולרית)</td> <td>סיגמא</td><td>E7023-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>סיגמא</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>50x Tris-אצטט-EDTA מאגר</td><td>ThermoFisher</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>0.5-10 Kb סולם</td> <td>RNAThermoFisher</td><td>15623-200</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop&nbsp; ספקטרופוטומטר</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>10x</td><td>PBS ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus DNA סולם</td><td>ThermoFisher</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>צינור PCR 12 רצועות</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1113</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection עבור עריכת transgenesis ו הגנום ב הקוצנים threespine

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

דג עוקצן threespine התפתח כמערכת רבה עצמה כדי לחקור את הבסיס הגנטי של מגוון רחב של מורפולוגיים, פיסיולוגי, פנוטיפים התנהגותיים. פנוטיפים המגוונים להפליא שהתפתחו כמו אוכלוסיות ימיות להסתגל לסביבת מים מתוקה אינספור, בשילוב עם היכולת לחצות צורות ימיות מים מתוקים, לספק מערכת החולייתנים נדירה בם גנטיקה יכולה לשמש כדי למפות אזורי גנומית שליטה התפתחה תכונות. משאבי גנומי מצוינים זמינים כעת, הקלה לנתיחת גנטיקה מולקולרית של שינויים התפתחו. בעוד ניסויי מיפוי ביצירת רשימות של גני מועמדים מעניינים, מניפולציות גנטיות פונקציונליות נדרשות לבחון את התפקידים של גנים אלה. ויסות גנים ניתן ללמוד עם פלסמידים BACS כתב מהונדסים משולבים לתוך הגנום באמצעות מערכת transposase Tol2. פונקציות של גנים מועמדים ספציפיים ואלמנטים רגולטורית ציס ניתן להעריך על ידי גרימת ממוקדמוטציות עם Talen ו CRISPR / Cas9 ריאגנטים עריכת הגנום. כל השיטות דורשות החדרת חומצות גרעין לעוברי קוצן חד תא מופרה, משימה שנעשתה מאתגר ידי סיסי העבה של עוברת קוצן ואת blastomere הקטנה ורזה יחסית. כאן, פרוטוקול מפורט עבור microinjection של חומצות גרעין לעוברי קוצן מתואר ליישומים מהונדסים הגנום עריכה ללמוד ביטוי גנים ותפקוד, כמו גם טכניקות כדי להעריך את ההצלחה של transgenesis ולשחזר קווי יציבה.

עבור transgenes גן הכתב כי יש פעילות משפרת, זריקה מוצלחת תגרום ביטוי ספציפי, סלולארי של transgene (איור 4 א, ​​4C). דגים מוזרקים לאחר מכן ניתן outcrossed לייצר קווי יציבה (דוגמא קו BAC יציב שמוצג באיור 4B). הזרקת DNA לעוברי קוצן בדרך כלל תוצאות קטלניות גבוהה בהרבה RNA לבד. זה אופייני לראות עד 50% (לפעמים אפילו יותר) קטלני או מום (ראה האיור 4D - F, 4I)</stro...

מניפולציות מהונדסות ועריכה הגנום הן קריטיים עבור תפקודית בדיקות התפקידים של גנים ואלמנטים רגולטורית cis. הנה פרוטוקול microinjection מפורט עבור הדור של שינויים גנומיים (כולל מבנים transgene כתב ניאון בתיווך Tol2, TALENs, ו CRISPRs) מוצג לגבי דגים המודל המתהווה, עוקצן threespine.

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

המטרה הכוללת של טכניקת מיקרו-הזרקה זו היא להפיק דגי סטיקלבק (stickleback) טרנסגניים וערוכים גנומית כדי לבחון תפקוד של גנים ומגבירים (enhancers). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בגנטיקה התפתחותית ואבולוציונית, כגון האופן שבו גנים ומגבירים פועלים ליצירת דפוסי גוף. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מפיקה ביעילות דגים טרנסגניים לצורך אנליזה גנטית פונקציונלית.לאחר הכנת שני הפלסמידים וה-mRNA בהתאם לפרוטוקול הכתוב, משוך לפחות ארבעה מחטים של מיקרופיפטה מזכוכית בורוסיליקט. אחסן אותם בצורה אנכית בתוך צנצנת אחסון לקפילרות, כאשר הקצוות החדים פונים כלפי מטה. כדי להפריה עד מאה ביצי של דג הסטיקלבק (stickleback), הוסף 50 µL של תמיסת זרע והשתמש בקצה פיפטה כדי לערבב בעדינות, על מנת להבטיח שכל הביצים הופרו.בזמן העבודה על קרח, מלאו שוב לפחות שלוש מחטים על ידי פיפוט של 0.5 µL מתמיס ההזרקה אל הקצה התמים של המחט והמתינו לניקוזו. בינתיים, הדליקו את תאורת התעלה (transillumination) של מיקרוסקופ הדיסקציה והניחו פלטת זכוכית בגודל 13 cm² על בסיס התאורה של המיקרוסקופ, כשמעליה מוצב להב מסור גבס באורך 15 cm. כווןו את המסור בניצב למכשיר ההזרקה, כאשר השקעים פונים לכיוון מחזיק המחטים, ולאחר מכן הדליקו את תיבת הבקרה וודאו שהלחץ מכוון לכ-175 kPa.הגדירו את משך ההזרקה ל-180 milliseconds. לאחר מכן, שחררו את מחזיק המחט, הכניסו מחט מלאה למחזיק עד שתרגישו בהתנגדות של מחזיק הגומי, והדקו את מחזיק המחט עד להידוק ידני. לאחר מכן, כווננו את זווית המחט לכ-45 מעלות.השתמשו בבקרים של המיקרו-מניפולטור כדי לכוון את המחט כך שהקצה שלה יהיה ממורכז בשדה הראייה. הגדילו את התצוגה להגדלה של כ-40x ומקדמו את המיקוד לקצה המחט, שאינו אמור לגעת בזכוכית שמתחתיו. בעזרת פינצטה עדינה (watchmaker's forceps), אחזו בקצה המחט במרחק של שני עד שלושה רוחבי פינצטה מהקצה, ושברו בעדינות את הקצה בזווית של 60 מעלות.לאחר מכן, לחצו מספר פעמים על דוושת ההזרקה כדי לבדוק אם המחט שבורה. לאחר מספר לחיצות, טיפות אדומות זעירות צריכות להתחיל לצאת מהקצה. השתמשו בפיפטת העברה חד-פעמית כדי להניח מספר טיפות של מי דגי הסטיקלבק (stickleback) על לוחות הזכוכית.הנמיקו בעדינות את המחט אל תוך המים, ולאחר מכן הגבירו את לחץ הגב עד שזרם חלש של נוזל ורוד יצא מהמחט. משכו את המחט חזרה רחוק ככל האפשר כדי שלא תיפגע במהלך הכנת העוברים. כ-25 דקות לאחר ההפריה, השתמשו בשני קצות פיפט של 10 µL כדי להוציא חמישה עד 10 עוברים מהמקבץ ולהעבירם לפלטת הזכוכית.בעזרת טיפי הפספטה, הפרידו בעדינות את העוברים לשקעים בודדים בלהב המסור, תוך נקיטת זהירות כדי לא לדקור את העוברים. לאחר מכן, בעזרת פספטת העברה, הוסיפו מספיק מי דג ה-stickleback כדי לכסות את העוברים. לאחר שלוש עד חמש שניות, הסירו את רוב המים והשאירו רק נפח קטן המכסה כל עובר.התחילו עם העובר הרחוק ביותר, ההליקו עם פלטת הזכוכית ובצעו זום על העובר כך שימלא כ-25 אחוזים משדה הראייה. הורידו את המחט אל שדה הראייה, ולאחר מכן השתמשו בקצה פיפטה של 10 µL כדי לסובב בעדינות את העובר לצורך זיהוי הבלסטומר, בליטה מוגבהת של ציטופלזמה, גרגירית וצהבהבה מעט, בחלקו העליון של החלמון. סובבו את העובר כך שהבלסטומר יהיה בניצב ישיר לקצה המחט.הורידו את המחט תוך הפעלת לחץ איטי ואחיד כדי לחדור את ה-corion ולהחדיר את המחט אל הציטופלזמה, מבלי לדחוף אותה דרך החלון התחתון של החלמון. לחצו על דוושת הרגל שלוש עד ארבע פעמים לצורך ההזרקה, כך שבולוס אדום עם קצוות מפוזרים מעט ימלא כ-1/8 מקוטר הציטופלזמה. שימוש במחט חדה הממוקמת בניצב ל-corion יקל על שלב זה.הגבלה של כמות המים המוספים תסייע בשמירה על רכות הקוריון. ולבסוף, התמקדות בציטופלזמה תגדיל את הסבירות לקבלת בעל חיים טרנסגני. השתמש בבקרים של המיקרו-מניפולטור כדי להסיג את המחט, ובאמצעות טיפ של פיפט של 10 microliter, החזק את העובר במידה והוא נדבק למחט.לאחר נסיגת המחט, החלק את לוחית הזכוכית כדי ליישר את העובר הבא עם המחט וחזור על ההזרקה. כאשר כל העוברים הוזרקו, השתמש בפיפט העברה שקצהו גזור כדי להוסיף מים ללוחית. לאחר מכן, השתמש בפיפט העברה כדי לאסוף את העוברים ולהניחם בצלחת פטרי בנפח 150 millimeter המלאה במי stickleback.דגרו את העוברים בטמפרטורה של 18 degrees Celsius. יום אחד לאחר ההזרקה, שפכו בעדינות את מי הדגים והחליפו אותם במים טריים. בדקו אם ישנם עוברים מתים או מעוותים והסירו אותם כדי למנוע זיהום.כפי שמוצג כאן, עבור טרנסגנים בעלי פעילות מעצימה (enhancer), הזרקה מוצלחת מובילה לביטוי תאי ספציפי של הטרנסגן. לדוגמה, בסנפירים החזיים והחצאיים ובמיתר הגב (notochord). ניתן להכליא את הדגים המוזרקים כדי להפיק שושלות יציבות, כגון שושלת יציבה זו המניעה ביטוי של GFP בלב העוברי ארבעה ימים לאחר ההפריה.עבור מחזק (enhancer) פעיל, 40 עד 50 אחוזים מהעוברים יראו ביטוי של טרנסגן ספציפי לרקמה, לדוגמה, בסנפירים החציוניים והחזיים. עד 100 אחוזים מדגי דגים מדור F0 חיוביים ל-GFP המבטאים טרנסגנים של פלסמיד toll two מייצרים צאצאים טרנסגניים. עם זאת, אחוז הצאצאים הנושאים את הטרנסגן משתנה במידה ניכרת, מפחות מאחוז אחד ועד 72 אחוזים.שמירה של עוברים מוזרקים חיוביים ל-GFP בלבד מגבירה בדרך כלל את יעילות ההעברה. רק עד 10 אחוזים מעוברי דגי הקוצים (stickleback) שהוזרקו שוב ב-F0 מראים פלואורסצנציה ברקמות הצפויות. בנוסף, שיעור ההעברה של הזרקות חוזרות (backs) נמוך יותר מזה של מבני פלסמיד.כאשר רק עד 14 אחוזים מדגי דבקר (sticklebacks) שנסרקו העבירו את הגן הלאה. בניגוד ליעילות הנמוכה של טרנסגנזיס הפוך, ל-70 עד 100 אחוזים מהדגים שהוזרקו talons יש נגעים פסיפסיים (mosaic lesions). כאן, אמפליקון PCR לא חתוך בכל אחד מהעוברים המוזרקים מעיד על כך שחלק מהתאים בכל עובר נושאים נגעים בלוכס המטרה.ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה במעט יותר משעה עבור מקבץ של 100 עוברים, אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ניסיון ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי נדרשים תרגול וסבלנות כדי לשפר את הטכניקה ואת שיעור ההישרדות של העוברים. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לדפוסי ביטוי מפורטים של מחזקים (enhancers).בנוסף, ניתן לגדל דגים שעברו עריכה גנומית בהכלאות כדי לחקור פנוטיפים הנובעים ממוטציות מושראות. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הגנטיקה האבולוציונית וההתפתחותית לחקור את הוויסות והתפקוד של גנים בדגי סטיקלבק (sticklebacks). לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ההזרקה לעוברי סטיקלבק לצורך טרנסגנזה ועריכה גנומית.

microinjection-for-transgenesis-genome-editing-threespine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

מקור: Chen, S., et al., Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Newborn Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את ההזרקה הסטריאוטקסית של וקטור ויראלי המקודד Cre recombinase וחלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP לתוך הסטריאטום של גור עכבר מהונדס גנטית כדי להשיג מניפולציה גנטית על ידי כריתת קלטת STOP עם אגף loxP, הפעלת חלבון פלואורסצנטי אדום או RFP כמדווח.

מיקרו-הזרקה סטריאוטקטית של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית בסטריאטום גור עכבר

ג'ין-מיקוד mutagenesis ניתן כיום במגוון רחב של אורגניזמים באמצעות טכניקות עריכה הגנום. הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול mutagenesis גן ממוקד באמצעות מפעיל שעתוק כמו nucleases המפעיל (TALENs) ב Astyanax mexicanus, זן של דגים הכולל דגי שטח cavefish.

הגנום עריכה<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; שימוש תמלול Activator דמוי מפעיל nucleases (TALENs)

Microinjection של ביציות העכבר משמש בדרך כלל עבור transgenesis קלאסי ( כלומר, שילוב אקראי של transgenes) ו CRISPR בתיווך גישור המיקוד. פרוטוקול זה סוקר את ההתפתחויות האחרונות microinjection, עם דגש מיוחד על בקרת איכות אסטרטגיות genotyping.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

פרוטוקול microinjection פשוטה ויעילה לעריכה ג'ין ב ערוץ שפמנון עוברי באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 מוצג. ב פרוטוקול זה, מדריך RNAs, חלבון Cas9 היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. פרוטוקול זה אומתה על ידי לדפוק שני גנים הקשורים החיסון ערוץ שפמנון.

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של...

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

כאן, פרוטוקול מוצג לייצר והאחורי CRISPR/Cas9 הגנום מנוקאאוט דגים חשמליים. מפורטים בפירוט הינם דרישות הביולוגיה המולקולרית, הרבייה והטיפול בשני הצדדים, ובטכניקות הזרקה ושיטות הזרקת הCas9 המושרה ביותר.

השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה להזרקת עוברי קרציות. הזרקת עובר היא הטכניקה המועדפת למניפולציה גנטית ליצירת קווים מהונדסים.

טכניקת הזרקת עוברים לעריכת גנים בקרצייה שחורת הרגליים, Ixodes scapularis

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיקרו-הזרקה של זיגוטה של CRISPR-Cas9 ודנ"א של תורם כדי לייצר ביעילות קלטות גנים ועכברים פלוקסים.

מיקרו-הזרקה של זיגוטה ליצירת קלטות גנטיות ואללים של פלוקס בעכברים

למד טכניקת מיקרו-הזרקה ליצירת דגי stickleback טרנסגניים ועריכת גנום באמצעות Tol2, TALENs ו-CRISPR. שיטה זו מאפשרת בדיקת פונקציית גנים ומגבירים בביולוגיה התפתחותית ואבולוציונית.

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

גלה סרטונים נוספים