Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

המטרה הכוללת של טכניקת מיקרו-הזרקה זו היא ליצור דגי סטיקלבק טרנסגניים וערוכים גנום כדי לבחון את תפקוד הגנים והמשפרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בגנטיקה התפתחותית ואבולוציונית כגון כיצד גנים ומשפרים מתפקדים ליצירת דפוס גוף. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת ביעילות דגים טרנסגניים לניתוח גנטי פונקציונלי.

לאחר הכנת אגרה שני פלסמידים ו-mRNA על פי פרוטוקול הטקסט, משוך לפחות ארבע מחטי מיקרופיפטה מזכוכית בורוסיליקט. יש לאחסן אנכית בצנצנת אחסון נימית שהקצוות החדים פונים כלפי מטה. כדי להפרות עד מאה ביציות סטיקלבק, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת זרע והשתמש בקצה פיפטה כדי לערבב בעדינות כדי להבטיח שכל הביציות מופרות.

תוך כדי עבודה על קרח, יש למלא לפחות שלוש מחטים על ידי הזרמת 0.5 מיקרוליטר של תמיסת הזרקה לקצה הקהה של המחט ולאפשר לה להתנקז. בינתיים, הפעל את נורית הטרנס-הארה עבור המיקרוסקופ המנתח והנח לוחית זכוכית בגודל 13 סנטימטר מרובע על בסיס אור המיקרוסקופ עם להב מסור גבס בגודל 15 ס"מ על גבי לוחית הזכוכית. כוון את המסור בניצב למנגנון ההזרקה כשהשקעים פונים לכיוון מחזיק המחט ולאחר מכן הפעל את תיבת הבקרה וודא שהלחץ מוגדר לכ-175 קילופסקל.

הגדר את משך ההזרקה ל-180 אלפיות השנייה. לאחר מכן שחרר את מחזיק המחט, ולאחר מכן הכנס מחט מלאה לתוך המחזיק עד שניתן להרגיש את ההתנגדות של מחזיק הגומי והדק את מחזיק המחט עד שהוא מהודק באצבע. לאחר מכן כוונן את זווית המחט לכ-45 מעלות.

השתמש בפקדי המיקרומניפולטור כדי לכוונן את המחט כך שהקצה יהיה מרוכז בשדה הראייה. התקרב להגדלה של כ-40x והתמקד בקצה המחט, שלא אמור לגעת בזכוכית שמתחת. בעזרת מלקחיים של שען, אחוז בקצה המחט ברוחב שניים עד שלושה מלקחיים מהקצה ושבור בעדינות את הקצה בזווית של 60 מעלות.

לאחר מכן לחץ על דוושת רגל ההזרקה מספר פעמים כדי לבדוק אם המחט שבורה. לאחר כמה הקשות, טיפות אדומות זעירות אמורות להתחיל לצאת מהקצה. השתמש בפיפטה חד פעמית כדי להניח כמה טיפות מים על צלחת הזכוכית.

הורד בעדינות את המחט למים, ואז הגביר את הלחץ האחורי עד שזרם קלוש של נוזל ורוד יוצא מהמחט. משוך את המחט ככל האפשר כדי שלא תיפגע בזמן הכנת העוברים. כ-25 דקות לאחר ההפריה, השתמש בשני קצות פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי להוציא חמישה עד 10 עוברים מהמצמד ולהעביר לצלחת הזכוכית.

בעזרת קצות הפיפטה, הפרד בעדינות את העוברים לשקעים בודדים של להב המסור בזהירות ולא לנקב את העוברים. לאחר מכן, בעזרת פיפטת העברה, הוסיפו מספיק מים כדי לכסות את העוברים. לאחר מכן, לאחר שלוש עד חמש שניות, הסר את רוב המים והשאיר רק נפח קטן המכסה כל עובר.

התחילו עם העובר הרחוק ביותר, החליקו את לוחית הזכוכית והתקרבו לעובר כך שהוא ימלא כ-25 אחוז משדה הראייה. הורד את המחט לשדה הראייה, ולאחר מכן השתמש בקצה פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי לסובב בעדינות את העובר כדי לזהות את הבלסטומר, בליטה מגורענת, מעט צהובה, מוגבהת של ציטופלזמה בחלק העליון של החלמון. סובב את העובר כך שהבלסטומר יהיה בניצב ישירות לקצה המחט.

הורד את המחט תוך הפעלת לחץ לאט ואחיד כדי לנקב את הקוריון ולהכניס את המחט לציטופלזמה מבלי לדחוף אותה דרך החלמון הבסיסי. לחץ על דוושת כף הרגל שלוש עד ארבע פעמים כדי להזריק כך שבולוס אדום עם קצוות מפוזרים מעט ימלא בערך 1/8 מקוטר הציטופלזמה. מחט חדה בניצב לקוריון תקל על שלב זה.

הגבלת כמות המים שנוספה תעזור לשמור על הקוריון רך. ולבסוף, התמקדות בציטופלזמה תגדיל את הסבירות להשיג בעל חיים טרנסגני. השתמש בפקדי המיקרומניפולטור כדי למשוך את המחט, ועם קצה הפיפטה של 10 מיקרוליטר, החזק את העובר אם הוא נדבק למחט.

לאחר החזרת המחט, החלק את לוחית הזכוכית כדי ליישר את העובר הבא עם המחט וחזור על ההזרקה. לאחר שכל העוברים הוזרקו, השתמש בפיפטת ההעברה כשהקצה חתוך כדי להוסיף מים לצלחת. לאחר מכן השתמש בפיפטה להעברה כדי לאסוף את העוברים ולהניח אותם בצלחת פטרי בגודל 150 מילימטר מלאה במי סטיקלבק.

דגירה על העוברים בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס. יום לאחר ההזרקה יש לשפוך בעדינות את מי הסטיקלבק ולהחליף במים מתוקים. בדוק אם יש עוברים מתים או מומים והסר כדי למנוע זיהום.

כפי שמוצג כאן, עבור טרנסגנים בעלי פעילות משפרת, הזרקה מוצלחת מביאה לביטוי תאי ספציפי של הטרנסגן. לדוגמא, בסנפירי החזה והחציון והנוטוכורד. לאחר מכן ניתן להצליב דגים מוזרקים כדי לייצר קווים יציבים כמו קו יציב אחורי זה המניע את ביטוי ה-GFP בלב העוברי ארבעה ימים לאחר ההפריה.

עבור משפר פעיל, 40 עד 50 אחוז מהעוברים יראו ביטוי טרנסגנים ספציפי לרקמה, למשל, בסנפירי החציון והחזה. עד 100 אחוז מדגי ה-F0 החיוביים ל-GFP המבטאים שני טרנסגנים של פלסמיד מייצרים צאצאים טרנסגניים. עם זאת, אחוז הצאצאים הנושאים את הטרנסגן משתנה מאוד בין פחות מאחוז אחד ל-72 אחוזים.

הצלת עוברים מוזרקים חיוביים ל-GFP בדרך כלל מגדילה את יעילות ההעברה. רק עד 10 אחוזים מעוברי הסטיקלבק שהוזרקו בחזרה מראים פלואורסצנטיות ברקמות הצפויות. בנוסף, קצב ההעברה של הגב נמוך מזה של מבני פלסמיד.

כאשר רק עד 14 אחוז מהסטיקלבקים המוקרנים משדרים את הגב. בניגוד ליעילות הנמוכה של טרנסגנזה אחורית, ל-70 עד 100 אחוז מהדגים המוזרקים עם ציפורניים יש נגעי פסיפס. כאן אמפליקון PCR לא חתוך בכל אחד מהעוברים המוזרקים מצביע על כך שחלק מהתאים בכל עובר נושאים נגעים במיקום המטרה.

לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך קצת יותר משעה עבור מצמד של 100 עוברים אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שנדרשים תרגול וסבלנות כדי לשפר את הטכניקה ואת הישרדות העוברים. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לענות על שאלות נוספות לגבי דפוסים מפורטים של ביטוי משפר.

כמו כן, ניתן לגדל דגים ערוכים בגנום כדי לחקור פנוטיפים הנובעים ממוטציות מושרות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הגנטיקה האבולוציונית וההתפתחותית לחקור את הוויסות והתפקוד של גנים בסטיקלבק. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להזריק עוברי סטיקלבק לטרנסגנזה ועריכת גנום.