הפקת DNA-RNA סימולטני החוף משקעים וכימות של 16S rRNA גנים תעתיקי ידי בזמן אמת PCR

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחלץ DNA ו-RNA בעלי תפוקה גבוהה ואיכות גבוהה ממשקעים ימיים חופיים ולאחר מכן לכמת גנים ותעתיקים של RNA ריבוזומלי 16S. שיטה זו המתארת מיצוי DNA ו-RNA ממשקעים ימיים ואחריה PCR כמותי היא צעד מפתח בניתוח המולקולרי של שפע ומגוון מיקרוביאלי בסביבה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לחלץ DNA ו-RNA מאותה דגימה אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בה לניתוח במורד הזרם, כגון PCR כמותי.

ידגימו את ההליך ד"ר אנריקו טאטי מ-NUI Galway, ודאנקן סוויני, דוקטורנט מאוניברסיטת אסקס. כדי לחלץ DNA ו-RNA ממשקעים חופיים לאחר הכנת חומרים נטולי RNA ואיסוף דגימות משקעי חוף על פי פרוטוקול הטקסט, העבירו 0.5 גרם משקעים לצינור חרוזים של שני מיליליטר. הוסף לצינור 500 מיקרוליטר של מאגר פוספט CTAB ו-500 מיקרוליטר של פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל והפוך חמש עד 10 פעמים כדי להומוגניזציה של הדגימה.

מערבולת במלוא המהירות במשך 2.5 דקות לפני שהיא מסתובבת ב-16, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, במכסה אדים, מחלצים את השכבה המימית העליונה ומעבירים אותה לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי חדש של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הניחו את הדגימות על קרח והוסיפו 500 מיקרוליטר של כלורופורם קר כקרח: אלכוהול איזואמיל.

לאחר מכן הפוך את הצינור מספר פעמים עד שנראה תחליב וצנטריפוגה כמו קודם. במכסה אדים, מחלצים את השכבה המימית העליונה ומניחים בצינור סטרילי חדש של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, כדי לזרז את חומצות הגרעין, הוסף שני נפחים של תמיסת נתרן כלורי 30% PEG וערבב היטב.

דגרו על קרח במשך שעתיים, או השאירו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימות ב-16,000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. בעזרת מיקרופיפטה, הסר בעדינות את הסופרנטנט, והקפד לא להפריע לגלולה.

השאירו כ-10 מיקרוליטר של תמיסת PEG בצינור והוסיפו מיליליטר אחד של אתנול קר כקרח 70%. לאחר סיבוב הדגימה, השתמש במיקרופיפטה כדי להסיר לאט את האתנול, הקפד לא לגעת בגלולה. לאחר מכן צנטריפוגה למשך חמש שניות והסר את שאריות האתנול

הניחו לגלולה להתייבש באוויר במשך חמש דקות לפני השימוש ב-50 מיקרוליטר מים שטופלו על ידי DEPC כדי להשעות אותה מחדש. יש ליטר דגימה של 15 מיקרוליטר ל-DNA ו-30 מיקרוליטר ל-RNA. הצעד הקריטי ביותר הוא להבטיח שכדור ה-DNA/RNA לא נעקר בזמן הסרת הסופרנטנט ולא נשאר שאריות אתנול לפני השעיית הגלולה במים, מכיוון שמעכב תגובה מולקולרית במורד הזרם.

כדי לעכל את ה-DNA בדגימת ה-RNA, הוסף שלושה מיקרוליטרים של מאגר DNase I ו-1.5 מיקרוליטר של DNase I ל-30 מיקרוליטר חומצת גרעין. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מערבבים את מגיב ההפעלה של DNase על ידי מערבולת למשך 30 שניות.

לאחר מכן הוסיפו לדגימה 4.8 מיקרוליטר מהתמיסה ודגרו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, ומדי פעם הקישו על תחתית הצינורות כדי לערבב את התמיסה. לאחר סיבוב הדגימה, העבירו את הסופרנטנט המכיל RNA לתוך צינור חדש, תוך הקפדה לא להעביר את המשקעים. כדי לבדוק את איכות ה-RNA, יש לדלל שני מיקרוליטרים של RNA, אחד מכל 10, על ידי הוספת 18 מיקרוליטר של מים נטולי יונים סטריליים ללא RNase.

בתגובות PCR נפרדות, הוסף מיקרוליטר אחד של דילול מסודר או אחד ל-10 של RNA לצינור PCR סטרילי של 0.5 מיליליטר. בעקבות הטבלה בפרוטוקול הטקסט, הוסף את רכיבי תגובת ה-PCR כדי להגביר את גן ה-RNA הריבוזומלי 16S. כלול בקרה חיובית, בקרת מעכב PCR ובקרה שלילית.

לאחר מכן הפעל את תגובות ה-PCR באמצעות פרמטרי ההגברה הבאים. כדי ליצור cDNA גדיל ראשון מ-RNA, הוסף את ריאגנטים לתגובה לצינור PCR של 0.2 מיליליטר בהתאם לפרוטוקול הטקסט. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר מכן הניחו את הדגימות על קרח למשך דקה אחת לפחות לפני הדגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, הוסף את הריאגנטים בטבלה המפורטת כאן מפרוטוקול הטקסט ודגירה בחום של 55 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות. לאחר מכן השבת את התגובה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר יצירת תקני DNA ו-RNA עבור qPCR על פי פרוטוקול הטקסט, יש להפשיר דגימות DNA ו-cDNA סביבתיות, תקנים וריאגנטים של qPCR על קרח. לדלל את תקני חומצות הגרעין ולהכין אחד מכל 10 דילולים של ה- DNA וה- cDNA הסביבתי ממסודר ל -10 למינוס שלוש. הכינו מיקס מאסטר למספר התגובות הכולל בתוספת 10% וערבבו היטב.

הוסף 19 מיקרוליטר של תערובת מאסטר ומיקרוליטר אחד של תבנית משולשת לכל באר בצלחת qPCR אופטית של 96 בארות. השתמש בכיסוי אופטי qPCR כדי לכסות את הצלחת. לאחר מכן צנטריפוגה קצרה של הצלחת והעמיס אותה לתוך בלוק החימום של מכונת ה-qPCR.

לאחר מכן, פתח את תוכנת מנהל qPCR ולאחר מכן לחץ על הכרטיסייה פרוטוקול, לחץ על צור חדש והוסף את תנאי ההגברה הבאים. הגדר את נפח הדגימה ל-20 מיקרוליטר, לחץ על אישור ושמור את הפרוטוקול. כעת בחר את הכרטיסיה לוחית.

לאחר מכן, תחת ערוך נבחר, לחץ על בחר פלואורופור. הוסף את צבע הכתב עבור הבדיקה המתאימה ולחץ על אישור. סמן/י בארות המכילות את התקנים ולאחר מכן, בתפריט ״סוג דגימה״, בחר/י ״רגיל״. בחר שכפל סדרה כדי לשנות את גודל השכפול לשלוש ולחץ על החל.

בחר סדרת דילול כדי להוסיף את ריכוז ההתחלה המחושב עבור ריכוז סטנדרטי. ציין את גורם הדילול של 10, בחר באפשרות הקטנה או הגדלה בהתאם לסדר הוספת העקומה הסטנדרטית ללוח, ולחץ על החל. סמן את מיקומי הבאר המכילים את הדגימות הלא ידועות ובחר לא ידוע מהתפריט הנפתח סוג דגימה.

בחר שכפל סדרה ושנה את גודל שכפול לשלוש, ולאחר מכן לחץ על החל. תחת שם לדוגמה, ערוך את השמות לדוגמה וחזור על ההליך עבור בארות בקרה ללא תבנית. לאחר מכן, בתיבת עורך הלוחות, לחץ על אישור ושמור את הקובץ.

לאחר מכן לחץ על התחל הפעלה. לאחר השלמת ההפעלה, בחר בכרטיסייה כימות כדי להציג את העקומה הסטנדרטית, מתארי העקומה הסטנדרטית ותרשימי הגברה. לבסוף, בחר בכרטיסייה נתוני כימות עבור ערכי Cp וכמות התחלתית מתאימה עבור גנים של דגימות לא ידועות.

קבע את מספר עותקי הגנים לגרם של משקע במשקל רטוב בהתאם לפרוטוקול הטקסט. כפי שמוצג בתמונת ג'ל זו, מיצוי מוצלח של חומצות גרעין מניב רצועות DNA ו-RNA ברורות שבהן נראים רצועות RNA ריבוזומליות חדות של 23S ו-16S בנוסף לנוכחות של פס DNA גנומי במשקל מולקולרי גבוה. איור זה מדגים שכאשר טווח דילול פי עשרה מוכן ומוגבר בצורה נכונה כדי ליצור עקומה סטנדרטית שתשמש לתגובת qPCR, נראה הבדל של 3.3 מחזורים בין כל דילול סטנדרטי.

חשוב לדווח על ערכי נקודת מעבר, או ערכי Cp, מהפקד ללא תבנית, או NTC, אם קיים. אם זה קורה, מוטל חתך Cp עבור דגימות סטנדרטיות ולא ידועות של 3.3 מחזורים או קיפול לוג גבוה מערך ה-Cp של ה-NTC כפי שתואר קודם לכן. כאן בוצעה הגברת דגימה סביבתית ממסודרת, 10 למינוס 1, 10 למינוס שתיים ו-10 למינוס שלוש.

הדגימה המסודרת לא התגברה וערכי ה-Cp של 10 למינוס 1 עד 10 למינוס 3 דילולים היו 24.12, 26.02 ו-28.40 בהתאמה. כפי שניתן לראות בגרף זה, רצויים מתארי עקומה סטנדרטיים, כולל ערכי R בריבוע של 0.99 ויעילות PCR בטווח של 90 עד 110%. בניסוי זה, ה-NTC Cp היה 30.5, והוטל חתך Cp שלילי של 27.2.

המרת שפע גנים לגרם של משקעים במשקל רטוב הביאה ל-2.5 כפול 10 לשביעי ו-7.1 כפול 10 לשביעי עבור 10 למינוס 1 ו-10 למינוס שני דילולים בהתאמה. ה-Cp של 10 עד מינוס 3 היה גדול יותר מהחתך של NTC. במקרה זה, ה-10 לשניים השליליים נבחר כדילול התבנית האופטימלי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ש-RNA יכול להתפרק במהירות, לכן חשוב לשמור את הדגימה על קרח ולהשתמש בכפפות כדי למנוע זיהום ב-RNase כל הזמן. אל תשכח שאנו עובדים עם פנול: כלורופורם ואלכוהול איסמיל, וזה יכול להיות מסוכן ביותר. ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן ועבודה מתחת למכסה מנוע כימי בעת ביצוע הליך זה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ DNA ו-RNA ולכמת שפע גנים ותעתיקים במשקעי חוף ימיים. זכרו, ניתן להשתמש בהליך זה בקלות כדי לחלץ DNA ו-RNA ולכמת מגוון מטרות גנים מרוב הדגימות הסביבתיות, כולל אדמה.