Name: הפקת DNA-RNA סימולטני החוף משקעים וכימות של 16S rRNA גנים תעתיקי ידי בזמן אמת PCR (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: למד פרוטוקול להפקה סימולטנית של DNA ו-RNA משקעי חוף וכימות גנים ותעתיקי 16S rRNA באמצעות RT-qPCR. שיטה זו מאפשרת ניתוח מקיף של שפע ומגוון מיקרוביאלי בסביבה ימית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרסום זה נובע מן המחקר נערך בתמיכת הכספיים של המועצה למחקר הסביבה הטבעית (NERC) תחת מספר מענק NERC NE / JO11959 / 1 ו קרן מדע אירלנד &amp; the COFUND פעולת מארי קירי תחת גרנט מספר 11 / SIRG / B2159awarded כדי CJs ואת קונסורציום המחקר האקדמי המזרח (מזרח ARC).

<ol><li>Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenomenon+of+microbial+uncultivability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The phenomenon of microbial uncultivability.</a> Curr. Opin. Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).</li>
<li>Zhou, J., Bruns, M. A., Tiedje, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+recovery+from+soils+of+diverse+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">DNA recovery from soils of diverse composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 316-322 (1996).</li>
<li>Miller, D. N., Bryant, J. E., Madsen, E. L., Ghiorse, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+optimization+of+DNA+extraction+and+purification+procedures+from+soil+and+sediments+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures from soil and sediments samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (11), 4715-4724 (1999).</li>
<li>Burgmann, H., Pesaro, M., Widmer, F., Zeyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+optimizing+quality+and+quantity+of+DNA+extracted+from+soil%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil.</a> J. Microbiol. Methods. 45 (1), 7-20 (2001).</li>
<li>Hurt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 4495-4503 (2001).</li>
<li>Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+coextraction+of+DNA+and+RNA+from+natural+environments+for+analysis+of+ribosomal+DNA-+and+rRNA-based+microbial+community+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).</li>
<li>Martins, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+activity+of+lacustrine+sediment+bacteria+involved+in+nutrient+and+iron+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Structure and activity of lacustrine sediment bacteria involved in nutrient and iron cycles.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 77 (3), 666-679 (2011).</li>
<li>Kuffner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+season+and+experimental+warming+on+the+bacterial+community+in+a+temperate+mountain+forest+soil+assessed+by+16S+rRNA+gene+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Effects of season and experimental warming on the bacterial community in a temperate mountain forest soil assessed by 16S rRNA gene pyrosequencing.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 82 (3), 551-562 (2011).</li>
<li>Tatti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+over+winter+conditions+on+denitrification+and+nitrous+oxide-producing+microorganism+abundance+and+structure+in+an+agricultural+soil+amended+with+different+nitrogen+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Agric.+Ecosyst+.+Environ%22%5BJournal%5D)">Influences of over winter conditions on denitrification and nitrous oxide-producing microorganism abundance and structure in an agricultural soil amended with different nitrogen sources.</a> Agric. Ecosyst . Environ. 183, 47-59 (2014).</li>
<li>Giovannoni, S. J., Britschgi, T. B., Moyer, C. L., Field, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+in+the+Sargasso+Sea+bacterioplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity in the Sargasso Sea bacterioplankton.</a> Nature. 345, 60-62 (1990).</li>
<li>Ward, D. W., Weller, R., Bateson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((16S+rRNA+sequences+reveal+numerous+uncultured+microorganisms+a+natural+community%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms a natural community.</a> Nature. 345, 63-65 (1990).</li>
<li>Suzuki, M. T., Giovannoni, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+caused+by+template+annealing+in+the+amplification+of+mixture+of+16S+rRNA+genes+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bias caused by template annealing in the amplification of mixture of 16S rRNA genes by PCR.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 625-630 (1996).</li>
<li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+fluorescence+monitoring+of+rapid+cycle+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.</a> Biotechniques. 22, 130-138 (1997).</li>
<li>Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., Gelfand, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Specific+Polymerase+Chain+Reaction+Product+by+Utilizing+the+5%27+3%27+Exonuclease+Activity+of+Thermus+aquaticus+DNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Detection of Specific Polymerase Chain Reaction Product by Utilizing the 5' 3' Exonuclease Activity of Thermus aquaticus DNA Polymerase.</a> PNAS. 88, 7276-7280 (1991).</li>
<li>Smith, C. J., Osborn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+quantitative+PCR+%28Q-PCR%29-based+approaches+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 67, 2-20 (2009).</li>
<li>Park, S. J., Park, B. J., Rhee, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+archaeal+16S+rRNA+and+amoA+genes+to+estimate+the+abundance+and+diversity+of+ammonia-oxidizing+archaea+in+marine+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Extremphiles%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of archaeal 16S rRNA and amoA genes to estimate the abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea in marine sediments.</a> Extremphiles. 12 (4), (2008).</li>
<li>Urakawa, H., Yoshida, T., Nishimura, M., Ohwada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+depth-related+population+variation+in+microbial+communities+of+a+coastal+marine+sediment+using+16S+rDNA-based+approaches+and+quinone+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of depth-related population variation in microbial communities of a coastal marine sediment using 16S rDNA-based approaches and quinone profiling.</a> Environ. Microbiol. 2, 542-554 (2008).</li>
<li>Smith, C. J., Dong, L. F., Wilson, J., Stott, A., Osborn, A. M., Nedwell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+variation+in+denitrification+and+dissimilatory+nitrate+reduction+to+ammonia+process+rates+and+corresponding+key+functional+genes+along+an+estuarine+nitrate+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Seasonal variation in denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonia process rates and corresponding key functional genes along an estuarine nitrate gradient.</a> Front. Microbiol. 6, 542(2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular Cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. 205(2001).</li>
<li>Smith, C. J., Nedwell, D. B., Dong, L. F., Osborn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Quantitative+Polymerase+Chain+Reaction+%28Q-PCR%29+based+approaches+for+determining+gene+copy+and+gene+transcript+numbers+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Quantitative Polymerase Chain Reaction (Q-PCR) based approaches for determining gene copy and gene transcript numbers in environmental samples.</a> Environ. Microbiol. 8 (5), 804-815 (2006).</li>
<li>Suzuki, M. T., Taylor, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeLong+E.F.%2C+Quantitative+analysis+of+small-subunit+rRNA+genes+in+mixed+microbial+population+via+5%27-nuclease+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">DeLong E.F., Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial population via 5'-nuclease assays.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 4605-4614 (2000).</li>
<li>Luna, G. M., Dell'Anno, A., Danovaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+procedure%3A+a+critical+issue+for+bacterial+diversity+assessment+in+marine+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">DNA extraction procedure: a critical issue for bacterial diversity assessment in marine sediments.</a> Environ. Microbiol. 8 (2), 308-320 (2005).</li>
<li>Lever, M. A., Torti, A., Eickenbursch, P., Michaud, A. B., Šantl-Temkiv, T., Jørgensen, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+method+for+the+extraction+of+DNA+and+RNA%2C+and+the+separation+of+DNA+pools+from+diverse+environmental+sample+types%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types.</a> Front. Microbiol. 6, 476(2015).</li>
<li>Lloyd, K. G., MacGregor, B. J., Teske, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+PCR+methods+for+RNA+and+DNA+in+marine+sediments%3A+maximizing+yield+while+overcoming+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Quantitative PCR methods for RNA and DNA in marine sediments: maximizing yield while overcoming inhibition.</a> FEMS Microbol. Ecol. 72, 144-151 (2010).</li>
<li>Klappenbach, J. A., Dumbar, J. M., Schmidt, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rRNA+Operon+copy+number+reflects+ecological+strategies+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22App.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">rRNA Operon copy number reflects ecological strategies of bacteria.</a> App. Environ. Microbiol. 66 (4), 1328-1333 (2000).</li>
<li>Shi, Y., Tyson, G. W., Eppley, J. M., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+metatrascriptomic+and+metagenomics+analyses+of+stratified+microbial+assemblages+in+the+open+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Integrated metatrascriptomic and metagenomics analyses of stratified microbial assemblages in the open ocean.</a> ISME J. 5, 999-1013 (2011).</li>
<li>Howe, A. C., Jansson, J. K., Malfatti, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tringe+S.G.%2C+Tiedje+J.M.%2C+%26+Brown+C.T.+Tackling+soil+diversity+with+the+assembly+of+large%2C+complex+metagenomes%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Tringe S.G., Tiedje J.M., & Brown C.T. Tackling soil diversity with the assembly of large, complex metagenomes.</a> PNAS. 111 (13), 4904-4909 (2014).</li>
<li>Klaedtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terroir+is+a+key+driver+of+seed-associated+microbial+assemblages%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Terroir is a key driver of seed-associated microbial assemblages.</a> Environ. Microbiol. , (2015).</li>
<li>Lueders, T., Wagner, B., Claus, P., Friedrich MW, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing+of+rRNA+and+DNA+reveals+a+dynamic+methylotroph+community+and+trophic+interactions+with+fungi+and+protozoa+in+oxic+rice+field+soil%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing of rRNA and DNA reveals a dynamic methylotroph community and trophic interactions with fungi and protozoa in oxic rice field soil).</a> Environ. Microbiol. 6, 60-72 (2004).</li>
<li>Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+stable+isotope+probing+to+identify+key+iron-reducing+microorganisms+involved+in+anaerobic+benzene+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation.</a> ISME J. 1, 643-653 (2007).</li>
<li>Bürgmann, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+response+of+Silicibacter+pomeroyi+DSS-3+to+dimethylsulfoniopropionate+%28DMSP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional response of Silicibacter pomeroyi DSS-3 to dimethylsulfoniopropionate (DMSP).</a> Environ. Microbiol. 9 (11), 2742-2755 (2007).</li>
<li>He, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geochip%3A+a+comprehensive+microarray+for+investigating+biogeochemical+ecological+and+environmental+processes%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Geochip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical ecological and environmental processes.</a> ISME J. 1, 67-77 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השילוב של מיצוי DNA / RNA עם qPCR מספק שיטה מהירה, מדויקת, יחסית חסכונית עבור הכימות הרגיש של שכיחותם גני תמליל מתוך מגוון רחב של דגימות סביבתיות, כגון משקעי החוף. מיצוי חומצות הגרעין הראשוני הוא השלב הקריטי כדי להבטיח תצוגת נציג של ההווה קהילת חיידקים מושגים 22. מספר מגבלות צריכים להילקח בחשבון עבור פרוטוקול החילוץ: א) השגת תמוגה התא הכולל, ב) שיתוף החילוץ של תרכובות מעכבות (למשל, חומצות humic או polyphenolics), ג) זיהום DNA בשבריר RNA, ד) שפלה מהירה של חומצות גרעין שחולצו כאשר הם מאוחסנים. אמצעי זהירות יש לנקוט כדי לעקוף מגבלות אלו. לדוגמא, תשומת לב מיוחדת יש לנקוט על מנת להבטיח כי החילוץ של חומצות גרעין מותאם במיוחד עבור סוג המדגם (למשל, משקעים, אדמה, שפכים, וכו &#39;). שיפורים משמעותיים תשואת חומצות גרעין ואיכות הוא DNA ו- RNA יכולים להיות מושגת על ידי ביצוע ניסויים ראשוניים 23. כדי למזער את ההשפעה של תרכובות מעכבות על יישומים מבוססי PCR 24, לבדוק מגוון של דילולים מ- DNA ו- RNA חילוץ. כדי לעקוף את השפלה המהירה של DNA / RNA מופק להקפיא להפשיר מחזורים מרובים למנוע אובדן אפשרי של מידע גנטי, aliquots נפח קטן מרובים ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. כאשר תוכנן בקפידה, qPCR היא שיטה חזקה, מאוד לשחזור ורגישה. יש לציין, כי שיטות הגברה ובנייה עקומת בתקן המפורט בפרוטוקול זה יכול להיות מותאם לכל יעד הגן של עניין, כולל סמנים פילוגנטי אחרים (כלומר, rRNA 16S archaeal, rRNA 18S פטרייתי) או גנים המעורבים פונקציות חשובות בסביבה. מגבלות ידועות בשימוש qPCR הן: א) הדור של באיכות גבוהה לשחזורעקומת tandard כימות מוחלטת, ב) הבחירה של פריימר / בדיקות ואופטימיזציה של תנאי assay q-PCR, ג) השימוש באיכות נמוכה / חומצות גרעין טעון, ד) הבחירה של דילול עובד של RNA DNA / להימנע עיכוב . יתר על כן, זה חייב להיחשב כי טכניקת qPCR מספקת גן / שכיחותם תמליל אשר לא יכול להשוות לתא ספירות: זה נכון במיוחד במקרה כאשר 16S ו 18S גני rRNA ממוקדים, כמו שיש מיקרואורגניזמים מספרים עותק שונה של גן ריבוזומלי בגנום שלהם 25. עקומות סטנדרטיות באיכות ירודה תגרומנה כימות מדויק של הגן של עניין. זה תרגול טוב כדי לאחסן מלאי של סטנדרטי ריכוז גבוהים aliquots הקטן שממנו עקומות סטנדרטיות טריות יכולות להתבצע. אין לאחסן עקומות סטנדרטיות, תמיד לעשות דילולים טריים מלאה של הריכוז הגבוה ביותר בכל פעם. עבור כימות מדויק של דגימות סביבתיות להבטיח את טווח הריכוזים של סטןעקומת dard משתרעת על פני ערכי Cp הצפויים של הדגימות הידועות. כאשר לכימותי תמלילים, לבנות את עקומת סטנדרט מ- RNA לא להכפיל גדילי הדנ&quot;א. במידת האפשר, כימות של דגימות כדי להשוות ישירות צריך להסתיים בתוך assay אחת להימנע וריאציה-assay היתר 20. זה לא תמיד אפשרי. לכן, כדי להשוות שכיחותם גן שנוצרה בין מבחנים רצוי יש סט-משנה אקראי של דגימות המשוכפלות בין מבחנים. מבחר רחב של ערכות פריימר בדיקה זמין כרגע עבור qPCR מיקוד מיני מיקרוביאליים קבוצות פונקציונליות 15. בחינה קפדנית יש צורך בבחירה אלה כדי להבטיח הן כיסוי מרבי וספציפי קבוצת היעד. אם יעילות התגובה של assay qPCR אינה משביעת רצון, פתרון בעיות מתחילות עם בדיקת תנאי רכיבת תרמית שונה (ככל שזמן חישול ו / או טמפרטורה) ו / או תנאי תגובה, למשל, ריכוזים שונים פריימר-בדיקה. ONCE Q-PCR assay ותנאי התגובה ממוטבים, תמיד לערוך בדיקה ראשונית של מגוון רחב של דילולים DNA / cDNA כדי לקבוע את הריכוז תבנית מתאימה. בחר את טווח הדילול וכתוצאה מכך מספר העותק הגבוה ביותר כמו דילול התבנית האופטימלי עבור מבחנים נוספים. נכון לעכשיו, טכנולוגיות רצף הדור הבא לשפוך אור ביעילות על מבנה הקהילה חיידקים ופונקציות בתוך שפע של סביבות 26,27,28. עם זאת, מערכי נתונים אלה מבוססים לעתים קרובות על ספריות amplicon נקודת סיום PCR ולכן מספקים רק ערכות וכמותיות של השפע של מינים מסוימים. לפיכך, את היכולת של טכניקת PCR מבוססת בזמן האמת למקד סמנים טקסונומיות ספציפיים (מדומיין גבוה עד לרמת מתח) מאפשר אימות יעילה של התוצאות שהושגו על ידי רצף של הדור הבא. יתר על כן, qPCR שמש בהצלחה בשילוב עם שיטות מולקולריות אקולוגיה מיקרוביאלית אחרות כגון ISO היציבהלהשתכר חיטוט (SIP) או microarrays פילוגנטי / תפקודי. בשילוב עם הכלי לשעבר, qPCR יכול לשמש כדי לכמת את הקהילה פעילה מבחינה מטבולית 29,30. בשילוב עם ניתוח microarray, qPCR מספק פרשנות כמותית המפתח של מבוססי סמן פילוגנטי גן פונקציונלי סקרים של סביבות 31,32. לכן, אם להשתמש לבד או בשילוב עם אחרים (לעתים קרובות תהליך מבוסס) ערכות של תפקוד מערכת אקולוגי, PCR כמוני הוא כלי חיוני עבור אקולוגים מיקרוביאלי בחיפוש של הקישור החמקמק בין קהילות חיידקי פונקציות מערכת אקולוגיות.

מיקרואורגניזמים הם אבן הפינה של הפונקציה האקולוגית נהיגה הביוספרה. רוב מיקרואורגניזמים להישאר חסרי תרבות 1. לכן גישות מולקולריות מבוססות הם יסוד לקדם את הבנתנו את המגוון והתפקוד של מיקרואורגניזמים בסביבה. מרכז גישות אלה הוא המיצוי של חומצות גרעין מ דגימות סביבתיות לבין ההגברה הבאה של גני המטרה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR). הצעד הראשון של מיצוי DNA / RNA שואפת lyse את דופן התא של ההווה קהילת חיידקים, להסיר מולקולות גרעין-חומצה הלא רצויים (למשל, חומרים אורגניים ואי-אורגניים) ולשמר DNA / RNA בתמיסה לניתוח נוסף במורד הזרם. בין מספר אפשרויות זמינות בספרות 2,3,4,5, כוללים מגוון רחב של ערכות הפקה מסחריות, שיטת גריפיתס 6 מועסק נרחב 7,8,9. זהו חסכוני particularly גם מתאים משקע כפי שהיא משתמשת צעד להכות חרוז כדי lyse תאים משלב צעדים כדי למזער את שאיבת שיתוף של מעכבי ה- PCR, כגון חומצות humic, תוך מחל DNA ו- RNA זמנית. הצעד השני משתמש תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להגביר גני המטרה, כגון סמן 16S rRNA טקסונומיות, מן חומצות גרעין שחולצו. יש גישה זו וממשיכה להקל על החיפושים של 10,11 קופסה שחורה מיקרוביאלי uncharacterized. עם זאת, בשיטות מבוססות PCR קצה לסבול ממגבלות שונות שיכולות להטות את האפיון של קהילות מיקרוביאלי 12. כדי לכמת במדויק שכיחותם הגן / תמליל, בזמן אמת PCR, הידוע גם בשם PCR כמותי (qPCR) חייב לשמש. qPCR מנצל מערכות צבע כתב ניאון העוקבות אחר הצטברות amplicon לאחר כל מחזור של PCR. זה משמעותי כי זה אומר כי כימות יכול להתרחש במהלך שלב המעריכים מוקדם, ולאמתום הנקודות, השלב של תגובת PCR, כאשר תשואת amplicon עדיין ביחס ישר השפע הראשוני של גן המטרה. שתי מערכות הכתב משמשות: כתם חומצות גרעין intercalating 13 ו 5 &#39;3&#39; פעילות exonuclease של פולימראז DNA 14. מאחר שרשת הכתב לשעבר נקשרה indistinctively לכל הדנ&quot;א הדו-גדילית, זה עלול להוביל יתר של רצף היעד אם amplicons שאינו ספציפי הרצוי או פריימר דיימר ידי מוצרים להתרחש. כדי לעקוף זאת, אופטימיזציה הנרחבת של הגברה ייתכן שתידרש. במערכת האחרונה, הגברת תבנית הוא אתר באמצעות שילוב של פעילות nuclease 5 &#39;של פולימראז תקי מסלקת fluorophore מן התחקיר פנימי. תכונה זו מגבירה את הספציפיות של assay בשל הניצול של חללית fluorogenic שקושר רק sequenc היעד ספציפי משליםדואר בין זוג פריימר. בשתי כימי כימות מושגת על ידי קביעת הנקודה-המעבר (CP) שם ההצטברות של amplicons PCR, כפי שהיא נמדדת על ידי גידול קרינה, היא משמעותי מעל קרינת רקע. qPCR כבר נעשה שימוש נרחב באקולוגיה מיקרוביאלית לקבוע שכיחותם גן בסביבות שונות 15. יתר על כן, שעתוק לאחור של RNA ל cDNA בשילוב עם qPCR ו RT-qPCR לכמת ביטוי גנים. לפיכך, qPCR ו RT-qPCR מייצגים מהירים, שיטות יעילות עבור כימות של מספרי גן ו / או תמליל בתוך דגימות סביבתיות. מיקרואורגניזמים במשקעי החוף לנהוג תהליכים אקולוגיים שונים, כוללים מינרליזציה של חומר אורגני, השפלתה של מזהמים ואת אופני biogeochemical של macronutrients כגון 16,17,18 חנקן. ההבנה הממצה של השינויים הללו דורשת accoun הקיףt של אוכלוסיות חיידקים התורמות, כוללים נתונים כמותיים על שכיחותם גני תמליל. כאן אנחנו מציגים סדרה של בדיקות מקיפות, נהלים פשוטים הסטנדרטיים עבור כימות של חיידקי 16S rRNA שכיחותם גני תמליל במשקעי החוף. הפרוטוקול מתאר אוסף מדגם, DNA סימולטני מיצוי RNA, הכנת RNA חופשי-DNA, בדיקת איכות של חומצות גרעין שחולצו, דור של 16S rRNA-DNA וסטנדרטי -RNA וכימות של דגימות סביבתיות. נתונים כמותיים נגזרו השיטות שתוארו כאן יש צורך לשפוך אור על קהילות חיידקי נהיגת מערכות אקולוגיות החוף.

<table><tbody><tr><td>דיאתילפירוקרבונט</td><td>סיגמא</td><td>40718</td><td>רעיל, פתוח מתחת לקולט אדים כימי</td></tr><tr><td>צטרימוניום ברומיד (CTAB)</td><td>סיגמא</td><td>52365</td><td>מגרה, פתוח מתחת לקולט אדים כימי</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>RES20765</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: איזואמילאלכוהול pH 8</td><td>סיגמא</td><td>P2069</td><td>שיווי משקל ב-pH 8 לפני השימוש</td></tr><tr><td>בכלורופורם: איזואמילאלכוהול</td><td>סיגמא</td><td>25666</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>VWR</td><td>1.06404.0500</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילאנגליקול 6000&nbsp;</td><td>VWR</td><td>528877-100</td><td></td></tr><tr><td>אתנול בדרגה מולקולרית</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>צינורות E מטריקס ליסינג</td> MP <td>ביו-רפואי</td><td>116914050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>טורבו DNAse&nbsp;</td><td>אמביון</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Taq פולימראז</td><td>סיגמא</td><td>D1806</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Bioline</td><td>BIO-39028</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Life Technologies</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>מעכבי רנאז</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>ללא RNAse/DNAse 0.2&nbsp; מ"ל שפופרות PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72.985.002</td><td></td></tr><tr><td>SureCleanPlus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>pGEM Easy T וקטור</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>E. coli JM109 תאים מוכשרים</td><td>Promega</td><td>L2005</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>סיגמא</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>סיגמא</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>59349</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Bioline</td><td>BIO-37035</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioline</td><td>BIO-37036</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>20768.235</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מידי פלסמיד</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Quant-IT DNA HS Assay</td><td>Life Technologies</td><td>Q-33120</td><td></td></tr><tr><td>Quant-IT RNA HS Assay</td><td>Life Technologies</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>MEGAshortscript kit</td><td>Ambion</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-84002</td><td></td></tr><tr><td>qPCR מכונה</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הפקת dna-rna סימולטני החוף משקעים וכימות של 16s rrna גנים תעתיקי ידי בזמן אמת pcr

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

תגובת שרשרת פולימראז Real Time הידוע גם בשם PCR כמותי (q-PCR) הוא כלי בשימוש נרחב אקולוגיה מיקרוביאלית לכמת שכיחותם הגן של קבוצות טקסונומיות ופונקציונלי דגימות סביבתיות. להשתמש בשילוב עם תגובת transcriptase הפוכה (RT-q-PCR), זה יכול גם להיות מועסק לכמת תמלילי גן. Q-PCR עושה שימוש כימי איתור פלורסנט רגישות גבוהה המאפשרות כימותים של amplicons PCR בשלב המעריכים של התגובה. לכן, ההטיות הקשורות &#39;הקצה&#39; PCR זוהו בשלב הרמה של תגובת PCR נמנעות. פרוטוקול לכמת גני rRNA 16S חיידקי תמלילים ממשקעי החוף דרך בזמן אמת PCR מסופק. ראשית, שיטה שיתוף החילוץ של DNA ו- RNA ממשקעים החוף, כולל הצעדים הנוספים הדרושים לעריכת RNA DNA ללא, מפורט. שנית, מדריך צעד-אחר-צעד עבור כימות של גני 16S rRNA ו TRanscripts מן חומצות גרעין שחולצו באמצעות q-PCR ו RT-q-PCR המתואר. מידע זה כולל פרטים לבניית עקומות סטנדרטיות DNA ו- RNA. שיקולים עיקריים לשימוש מבחני RT-q-PCR באקולוגיה מיקרוביאלית כלולים.

<html> הפקת DNA באיכות טובה ו- RNA ממשקעים היא הצעד הראשון בכימות שכיחותם גני תמליל. תשואות חילוץ מוצלחות להקות ה- DNA ו- RNA ברורות כמצוין באיור 1 עבור המדגם AC, שבו 23S ו 16S חדו להקות rRNA גלויות בנוסף להקת הדנ&quot;א הגנומי המשקל המולקולרית הגבוהה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54067/54067fig1highres.jpg" width="400" /> באיור 1. DNA / RNA החילוץ. תוצאות אופייניות מ- DNA / מיצוי RNA מן בשלושה עותקים (ABC) 0.5 גרם משקעים החוף. 5 μl של רנ&quot;א DNA / נדרס על agarose 1.4% ב 85 V עבור 40 דקות. סמן מולקולרי בטווח 10,037-200 נ&quot;ב היה בשימוש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54067/54067fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> -together.within-page = &quot;1&quot;&gt; כדי להכין RNA, עיכול של ה- DNA שיתוף חילוץ הוא חובה. זה חייב להיות מלווה 16S rRNA נקודת הסיום PCR של רנ&quot;א על ​​מנת להבטיח כי ה- DNA הוסר בהצלחה. אם ה- DNA הוסר לחלוטין רק להקה בבקרה החיובית הוא ציין. חשוב להשתמש בשני מסודר 1:10 דילול של RNA כדי להבטיח מעכבים אינם מונעים ההיווצרות של מוצר ה- PCR. RNA יכול עכשיו לעבור את התגובה transcriptase הפוכה להמירו cDNA. זה יכול להתבצע עם פריימרים משני או hexamers אקראי גן ספציפי. בדרך כלל, התגובה מתבצעת במכונת PCR, כדי להבטיח שפרופיל טמפרטורה אופטימלי. cDNA זה משמש כתבנית תגובת qPCR הבאה. DNA ו- RNA הוא לכמת לקביעת ריכוז התבנית בשימוש כל תגובה. פרוטוקול התגובה qPCR המתואר מיקוד 16S rRNA DNA. עבור 16S rRNA תמלילים להחליף את מ&quot;ק התקןRVE ותבנית עם cDNA. כמו דגימות ידועות הן לכמת נגד עקומת הסטנדרט, זה הכרחי כדי להבטיח את העקומה הסטנדרטית היא באיכות טובה. תרשים 2 מציג את ההכנה (א), עקומות סטנדרטיות דילולי DNA הסביבתי, (B), ההגברה של עקומת הסטנדרט דגימות סביבתיות (C) מרה של עקומת סטנדרט כדי רגרסיה ליניארית וחישוב של מספרי עותק הגן. כאשר מגוון דילול של פי 10 מוכן כראוי ומוגברי הבדל 3.3 מחזור בין כל דילול סטנדרטי נתפסת (זה לוקח 3.3 מחזורי גידול של פי עשר תבנית ב 100% יעילים הגברה) (איור 2Bi). מתארי עקומות סטנדרטיים, כוללים ערכי 2 R של 0.99 ויעילויות PCR בתוך בין 90 ל- 110% (איור 2 ג) הם רצויים. חשוב לדווח על נתוני Cp מן אין שליטת תבנית (NTC) אם הוא קיים. במקרה כזה הפסקת Cp עבור תקני דגימות ידועות 3.3 מחזורים (&lt;em&gt; כלומר, קפל יומן) גבוה משווי Cp של NTC מוטל 20 (איור 2Cii). תבנית לא ידועה מופקת DNA המשקע הייתה לכמת מ מסודר, 10 -1, 10 -2 ו 10 -3 דילולים (B). המדגם המסודר לא להגביר, ערכי Cp של 10 -1 עד 10 -3 דילולים היו 24.12, 26.02 ו 28.40 בהתאמה. NTC Cp היה 30.5, גידול הפסקת NCT של 27.2 הוטל. המרת שכיחותם גן g -1 משקעי משקל רטובים הביאו 2.5 x 10 7 ו 7.1 x 10 7 ל -10 -1 ו -10 -2 בהתאמה עבור מגוון הדילול. 10 -3 Cp דילול היה מתחת לציון NTC, והיה ולכן לא נעשה שימוש. במקרה זה 10 -2 נבחרת דילול התבנית האופטימלית. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54067/54067fig2highres.jpg" width="700" /> איור 2. 16S rRNA גן QPCהגברת R של תקני DNA הסביבה מופק משקעי החוף. הכנה (א) i) עקום DNA סטנדרטי ii) דילולי DNA הסביבתי הגברת qPCR, (B) qPCR הגברה של i) עקום סטנדרט DNA ו- II) דגימות סביבתיות, Cp עבור כל דגימה מוצגות. (C) i) רגרסיה לינארית של עקומת סטנדרט עם מתארי עקומת סטנדרט; ii) חישוב שכיחותם גנים בין דגימות סביבתיות. NTC:. בקרת תבנית שלילית <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54067/54067fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> CTAB </td><html><td> 5 גרם </td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 x3H 2 O </td><td> 2.58 גרם </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0.1 גרם </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2.05 גרם </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> עד 100 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> הכנת טבלה 1. חיץ CTAB-פוספט. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> PEG 6000 </td><td> 30 גרם </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 9.35 גרם </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> עד 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td colspan="2"> הערה: להוסיף PEG 6000 לאט מתחת לחימום ערבוב מתון של 50 מ&quot;ל של DH 2 O. </td></tr></tbody></table><html> בתוך-page = &quot;1&quot;&gt; הכנת טבלה 2. פתרון ממטרים PEG-NaCl. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> RNA חי RNA / 01:10 מדולל </td><td> 1.0 מיקרוליטר </td></tr><tr><td> 10x PCR הצפה </td><td> 5.0 μl </td></tr><tr><td> dNTPs 10 מ&quot;מ </td><td> 1.0 מיקרוליטר </td></tr><tr><td> פריימר 63F קדימה </td><td> 1.0 מיקרוליטר </td></tr><tr><td> CAG GCC TAA GTC CAA CAC ATG </td><td></td></tr><tr><td> פריימר 518R ההפוך </td><td> 1.0 מיקרוליטר </td></tr><tr><td> ATT ACC מהפקולטה לרוקחות אוכלים GCT GCT GG </td><td></td></tr><tr><td> פולימראז תקי </td><td> 0.4 μl </td></tr><tr><td> DH RNAse ללא 2 O </td><td> 40.6 μl </td></tr></tbody></table>e = &quot;1&quot;&gt; לוח 3. שילוב הורים PCR בדיקת איכות RNA ללא DNA. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> RNA </td><td> 0.5-5 מיקרוגרם </td></tr><tr><td> dNTPs 10 מ&quot;מ </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> פריימר הפוך 10 מיקרומטר / Random hexamers 50 מיקרומטר </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> DEPC-H 2 O </td><td> עד 13 μl </td></tr></tbody></table> תמהיל לוח 4. cDNA תגובת סינתזת א <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> מאגר 5x </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 μl </td><html></tr><tr><td> RNAse מונע </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> transcriptase הפוכה </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table> תמהיל לוח 5. cDNA תגובת סינתזת B. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> יַעַד </td><td> שם פריימר </td><td> סדר פעולות </td><td> T חישול (° C) </td><td> התייחסות </td></tr><tr><td rowspan="3"> 16S rRNA חיידקים </td><td> Bact1369F </td><td> CGG TGA ATA CGT TCY CGG </td><td rowspan="3"> 56 </td><td rowspan="3"> סוזוקי et al 2000. 19 </td></tr><tr><td> Prok1492R </td><td> GGW TAC CTT GTT ACG ACT T </td></tr><tr><td> TM1389F (בדיקה) </td><td> CTT GTA CAC ACC GCC CGT C </td></tr></tbody></table>ove_content &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; פריימר לוח 6 ו בדיקות עבור assay 16S rRNA q-PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> 2x מיקס מאסטר </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> פריימר קדימה (10 מיקרומטר) </td><td> 0.8 μl </td></tr><tr><td> פריימר הפוך (10 מיקרומטר) </td><td> 0.8 μl </td></tr><tr><td> Probe (10 מיקרומטר) </td><td> 0.4 μl </td></tr><tr><td> מַיִם </td><td> 7.0 μl </td></tr><tr><td> נפח סופי </td><td> 19 μl </td></tr></tbody></table> טבלה 7. בזמן אמת תגובת PCR לערבב. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מתאר </td><td> מַשְׁמָעוּת </td></tr><tr><td> מקדם המתאם (R 2) </td><td> מדד של הליניאריות של עקומת סטנדרט. באופן אידיאלי זה צריך להיות R 2 = 1. ערך של R 2 = 0.98-0.99 כשרים. </td></tr><tr><td> סלופ (α) </td><td> מדד של יעילות התגובה. באופן אידיאלי זה צריך להיות שווה ערך ל -3.32. ערך בטווח שבין -3.58 ו -3.1. </td></tr><tr><td> יעילות (= 10 (-1 / שיפוע) -1) </td><td> אם זה 100%, את התבניות מכפילות לאחר כל מחזור תרמי במהלך הגברת מעריכים. מגוון יעיל טוב הוא בין 90 ו -110%. </td></tr><tr><td> Y יירוט (β) </td><td> לגבול התיאורטי של זיהוי של התגובה. אמנם לא משמש לכמת רגישות התגובה, חשוב כאשר משווים עקומות סטנדרטיות שונות של אותה מטרה. </td></tr></tbody></table> לוח 8: QPCמתארי תגובת R.

מסופק פרוטוקול לכימות גנים ותעתיקים של חיידקים 16S rRNA ממשקעי חוף באמצעות PCR בזמן אמת. המתודולוגיה כוללת מיצוי משותף של DNA ו-RNA; הכנת RNA נטול DNA; וכימות גן rRNA 16S וכימות תעתיק באמצעות RT-q-PCR, כולל בניית עקומה סטנדרטית.

הפקת DNA-RNA סימולטני החוף משקעים וכימות של 16S rRNA גנים תעתיקי ידי בזמן אמת PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחלץ DNA ו-RNA בעלי תפוקה גבוהה ואיכות גבוהה ממשקעים ימיים חופיים ולאחר מכן לכמת גנים ותעתיקים של RNA ריבוזומלי 16S. שיטה זו המתארת מיצוי DNA ו-RNA ממשקעים ימיים ואחריה PCR כמותי היא צעד מפתח בניתוח המולקולרי של שפע ומגוון מיקרוביאלי בסביבה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לחלץ DNA ו-RNA מאותה דגימה אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בה לניתוח במורד הזרם, כגון PCR כמותי.ידגימו את ההליך ד"ר אנריקו טאטי מ-NUI Galway, ודאנקן סוויני, דוקטורנט מאוניברסיטת אסקס. כדי לחלץ DNA ו-RNA ממשקעים חופיים לאחר הכנת חומרים נטולי RNA ואיסוף דגימות משקעי חוף על פי פרוטוקול הטקסט, העבירו 0.5 גרם משקעים לצינור חרוזים של שני מיליליטר. הוסף לצינור 500 מיקרוליטר של מאגר פוספט CTAB ו-500 מיקרוליטר של פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל והפוך חמש עד 10 פעמים כדי להומוגניזציה של הדגימה.מערבולת במלוא המהירות במשך 2.5 דקות לפני שהיא מסתובבת ב-16, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, במכסה אדים, מחלצים את השכבה המימית העליונה ומעבירים אותה לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי חדש של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הניחו את הדגימות על קרח והוסיפו 500 מיקרוליטר של כלורופורם קר כקרח: אלכוהול איזואמיל.לאחר מכן הפוך את הצינור מספר פעמים עד שנראה תחליב וצנטריפוגה כמו קודם. במכסה אדים, מחלצים את השכבה המימית העליונה ומניחים בצינור סטרילי חדש של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, כדי לזרז את חומצות הגרעין, הוסף שני נפחים של תמיסת נתרן כלורי 30% PEG וערבב היטב.דגרו על קרח במשך שעתיים, או השאירו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימות ב-16,000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. בעזרת מיקרופיפטה, הסר בעדינות את הסופרנטנט, והקפד לא להפריע לגלולה.השאירו כ-10 מיקרוליטר של תמיסת PEG בצינור והוסיפו מיליליטר אחד של אתנול קר כקרח 70%. לאחר סיבוב הדגימה, השתמש במיקרופיפטה כדי להסיר לאט את האתנול, הקפד לא לגעת בגלולה. לאחר מכן צנטריפוגה למשך חמש שניות והסר את שאריות האתנול.הניחו לגלולה להתייבש באוויר במשך חמש דקות לפני השימוש ב-50 מיקרוליטר מים שטופלו על ידי DEPC כדי להשעות אותה מחדש. יש ליטר דגימה של 15 מיקרוליטר ל-DNA ו-30 מיקרוליטר ל-RNA. הצעד הקריטי ביותר הוא להבטיח שכדור ה-DNA/RNA לא נעקר בזמן הסרת הסופרנטנט ולא נשאר שאריות אתנול לפני השעיית הגלולה במים, מכיוון שמעכב תגובה מולקולרית במורד הזרם.כדי לעכל את ה-DNA בדגימת ה-RNA, הוסף שלושה מיקרוליטרים של מאגר DNase I ו-1.5 מיקרוליטר של DNase I ל-30 מיקרוליטר חומצת גרעין. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מערבבים את מגיב ההפעלה של DNase על ידי מערבולת למשך 30 שניות.לאחר מכן הוסיפו לדגימה 4.8 מיקרוליטר מהתמיסה ודגרו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, ומדי פעם הקישו על תחתית הצינורות כדי לערבב את התמיסה. לאחר סיבוב הדגימה, העבירו את הסופרנטנט המכיל RNA לתוך צינור חדש, תוך הקפדה לא להעביר את המשקעים. כדי לבדוק את איכות ה-RNA, יש לדלל שני מיקרוליטרים של RNA, אחד מכל 10, על ידי הוספת 18 מיקרוליטר של מים נטולי יונים סטריליים ללא RNase.בתגובות PCR נפרדות, הוסף מיקרוליטר אחד של דילול מסודר או אחד ל-10 של RNA לצינור PCR סטרילי של 0.5 מיליליטר. בעקבות הטבלה בפרוטוקול הטקסט, הוסף את רכיבי תגובת ה-PCR כדי להגביר את גן ה-RNA הריבוזומלי 16S. כלול בקרה חיובית, בקרת מעכב PCR ובקרה שלילית.לאחר מכן הפעל את תגובות ה-PCR באמצעות פרמטרי ההגברה הבאים. כדי ליצור cDNA גדיל ראשון מ-RNA, הוסף את ריאגנטים לתגובה לצינור PCR של 0.2 מיליליטר בהתאם לפרוטוקול הטקסט. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.לאחר מכן הניחו את הדגימות על קרח למשך דקה אחת לפחות לפני הדגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, הוסף את הריאגנטים בטבלה המפורטת כאן מפרוטוקול הטקסט ודגירה בחום של 55 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות. לאחר מכן השבת את התגובה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.לאחר יצירת תקני DNA ו-RNA עבור qPCR על פי פרוטוקול הטקסט, יש להפשיר דגימות DNA ו-cDNA סביבתיות, תקנים וריאגנטים של qPCR על קרח. לדלל את תקני חומצות הגרעין ולהכין אחד מכל 10 דילולים של ה- DNA וה- cDNA הסביבתי ממסודר ל -10 למינוס שלוש. הכינו מיקס מאסטר למספר התגובות הכולל בתוספת 10% וערבבו היטב.הוסף 19 מיקרוליטר של תערובת מאסטר ומיקרוליטר אחד של תבנית משולשת לכל באר בצלחת qPCR אופטית של 96 בארות. השתמש בכיסוי אופטי qPCR כדי לכסות את הצלחת. לאחר מכן צנטריפוגה קצרה של הצלחת והעמיס אותה לתוך בלוק החימום של מכונת ה-qPCR.לאחר מכן, פתח את תוכנת מנהל qPCR ולאחר מכן לחץ על הכרטיסייה פרוטוקול, לחץ על צור חדש והוסף את תנאי ההגברה הבאים. הגדר את נפח הדגימה ל-20 מיקרוליטר, לחץ על אישור ושמור את הפרוטוקול. כעת בחר את הכרטיסיה לוחית.לאחר מכן, תחת ערוך נבחר, לחץ על בחר פלואורופור. הוסף את צבע הכתב עבור הבדיקה המתאימה ולחץ על אישור. סמן/י בארות המכילות את התקנים ולאחר מכן, בתפריט ״סוג דגימה״, בחר/י ״רגיל״. בחר שכפל סדרה כדי לשנות את גודל השכפול לשלוש ולחץ על החל.בחר סדרת דילול כדי להוסיף את ריכוז ההתחלה המחושב עבור ריכוז סטנדרטי. ציין את גורם הדילול של 10, בחר באפשרות הקטנה או הגדלה בהתאם לסדר הוספת העקומה הסטנדרטית ללוח, ולחץ על החל. סמן את מיקומי הבאר המכילים את הדגימות הלא ידועות ובחר לא ידוע מהתפריט הנפתח סוג דגימה.בחר שכפל סדרה ושנה את גודל שכפול לשלוש, ולאחר מכן לחץ על החל. תחת שם לדוגמה, ערוך את השמות לדוגמה וחזור על ההליך עבור בארות בקרה ללא תבנית. לאחר מכן, בתיבת עורך הלוחות, לחץ על אישור ושמור את הקובץ.לאחר מכן לחץ על התחל הפעלה. לאחר השלמת ההפעלה, בחר בכרטיסייה כימות כדי להציג את העקומה הסטנדרטית, מתארי העקומה הסטנדרטית ותרשימי הגברה. לבסוף, בחר בכרטיסייה נתוני כימות עבור ערכי Cp וכמות התחלתית מתאימה עבור גנים של דגימות לא ידועות.קבע את מספר עותקי הגנים לגרם של משקע במשקל רטוב בהתאם לפרוטוקול הטקסט. כפי שמוצג בתמונת ג'ל זו, מיצוי מוצלח של חומצות גרעין מניב רצועות DNA ו-RNA ברורות שבהן נראים רצועות RNA ריבוזומליות חדות של 23S ו-16S בנוסף לנוכחות של פס DNA גנומי במשקל מולקולרי גבוה. איור זה מדגים שכאשר טווח דילול פי עשרה מוכן ומוגבר בצורה נכונה כדי ליצור עקומה סטנדרטית שתשמש לתגובת qPCR, נראה הבדל של 3.3 מחזורים בין כל דילול סטנדרטי.חשוב לדווח על ערכי נקודת מעבר, או ערכי Cp, מהפקד ללא תבנית, או NTC, אם קיים. אם זה קורה, מוטל חתך Cp עבור דגימות סטנדרטיות ולא ידועות של 3.3 מחזורים או קיפול לוג גבוה מערך ה-Cp של ה-NTC כפי שתואר קודם לכן. כאן בוצעה הגברת דגימה סביבתית ממסודרת, 10 למינוס 1, 10 למינוס שתיים ו-10 למינוס שלוש.הדגימה המסודרת לא התגברה וערכי ה-Cp של 10 למינוס 1 עד 10 למינוס 3 דילולים היו 24.12, 26.02 ו-28.40 בהתאמה. כפי שניתן לראות בגרף זה, רצויים מתארי עקומה סטנדרטיים, כולל ערכי R בריבוע של 0.99 ויעילות PCR בטווח של 90 עד 110%. בניסוי זה, ה-NTC Cp היה 30.5, והוטל חתך Cp שלילי של 27.2.המרת שפע גנים לגרם של משקעים במשקל רטוב הביאה ל-2.5 כפול 10 לשביעי ו-7.1 כפול 10 לשביעי עבור 10 למינוס 1 ו-10 למינוס שני דילולים בהתאמה. ה-Cp של 10 עד מינוס 3 היה גדול יותר מהחתך של NTC. במקרה זה, ה-10 לשניים השליליים נבחר כדילול התבנית האופטימלי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ש-RNA יכול להתפרק במהירות, לכן חשוב לשמור את הדגימה על קרח ולהשתמש בכפפות כדי למנוע זיהום ב-RNase כל הזמן. אל תשכח שאנו עובדים עם פנול: כלורופורם ואלכוהול איסמיל, וזה יכול להיות מסוכן ביותר. ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן ועבודה מתחת למכסה מנוע כימי בעת ביצוע הליך זה.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחלץ DNA ו-RNA ולכמת שפע גנים ותעתיקים במשקעי חוף ימיים. זכרו, ניתן להשתמש בהליך זה בקלות כדי לחלץ DNA ו-RNA ולכמת מגוון מטרות גנים מרוב הדגימות הסביבתיות, כולל אדמה.

simultaneous-dna-rna-extraction-from-coastal-sediments-quantification

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

מתודולוגיה לבודד משקל מולקולרי גבוה גבוה DNA הגנומי איכות מהקהילה חיידקים בקרקע מתואר.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

פרוטוקול ריבוזומלי רנ"א (rRNA) דלדול פותח כדי להעשיר RNA שליח (mRNA) לRNA-seq של metatranscriptome בטן היתוש. בדיקות דגימה ספציפיות rRNA, ששמשו להסרת rRNA דרך חיסור, נוצרו מהיתושים וחיידקי המעיים שלה. ביצועים של הפרוטוקול יכולים להוביל להסרה של כ 90-99% מrRNA.

דלדול של רנ&quot;א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq

אפיון הקהילה המיקרוביאלית היה מטרה ארוכת שנים במיקרוביולוגיה סביבתית. שיטות ריצוף מהדור הבא מאפשרות כעת אפיון של קהילות מיקרוביאליות בעומק חסר תקדים עם עלות ועבודה מינימליות. אנו מפרטים כאן את הגישה שלנו לרצף גנים של RNA ריבוזומלי חיידקי 16S באמצעות רצף שולחני.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

אנחנו מתארים שיטה יעילה, איתנה, וחסכונית לחילוץ חומצות גרעין מן מטליות לאפיון של קהילות חיידקי באמצעות רצף amplicon הגן 16S rRNA. השיטה מאפשרת גישה עיבוד משותף סוגי מדגם מרובים ויכול להכיל מספר תהליכים טיפוליים במורד הזרם.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

הנפוץ ביותר ניתוח תוכן הבטן של macroinvertebrates הם חזותיים. הדורשים ידע אינטנסיבי ונעשית מורפולוגי של אורגניזמים טרף, הם מתגעגעים טרף גוף רך, בשל comminution חזקה של טרף, הם כמעט בלתי אפשרית עבור אורגניזמים מסוימים, כולל amphipods. אנו מספקים נתונים היסטוריים, רומן גישות גנטיות עבור macroinvertebrate טרף זיהוי בתזונה של amphipods.

פרוטוקול המעבדה הגנטית ניתוחים תוכן הבטן של הימית Macroinvertebrates באמצעות קבוצה ספציפית rDNA תחל

בדיקות DNA סביבתיות דורשות תכנון קפדני, בדיקות, אופטימיזציה ואימות לפני תחילת איסוף נתוני השדה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שייקח את המשתמשים דרך כל שלב של תכנון בדיקת qPCR ספציפית למינים, מבוססת בדיקה לגילוי וכימות של דנ"א של מיני יעד מדגימות סביבתיות.

פיתוח ובדיקה של מבחני PCR כמותיים ספציפיים למינים עבור יישומי DNA סביבתיים

אנו מציגים את תהליך הבידוד, ההתרבות והאפיון של חיידקים מפרקים פחמימנים מבתי גידול מימיים. הפרוטוקול מתאר בידוד חיידקים, זיהוי בשיטת 16S rRNA, ובדיקת פוטנציאל פירוק הפחמימנים שלהם. מאמר זה יסייע לחוקרים לאפיין מגוון ביולוגי מיקרוביאלי בדגימות סביבתיות, ובמיוחד לסנן מיקרובים בעלי פוטנציאל לריפוי ביולוגי.

בידוד, ריבוי וזיהוי של מיני חיידקים בעלי תכונות מטבוליזם פחמימני מבתי גידול מימיים

מאמר זה מתאר פרוטוקול למיצוי DNA דיאטומי באמצעות ערכת מיצוי DNA משותפת שונה.

מיצוי DNA דיאטום מדגימות מים ורקמות

הפרוטוקול מזהה גנים מרכזיים של מחזור מתאן בביצות החוף של דרום טקסס ומדמיין את התפוצה המרחבית שלהם כדי לשפר את ההבנה של ויסות המתאן והשפעותיו הסביבתיות במערכות אקולוגיות דינמיות אלה.

הדמיה של דינמיקה מיקרוביאלית של מחזור מתאן בביצות חוף

פרוטוקול זה מתאר תהליך עבודה סטנדרטי לאיסוף דגימות DNA סביבתי (eDNA) של יוונקים ימיים מכלי שיט לצפייה בלווייתנים. היתכנות לחוקרים ולמדענים אזרחיים מיומנים היא בעדיפות גבוהה, בעוד שתנאי הסביבה, זמן הסינון, העכירות והלוגיסטיקה על הסיפון מגדירים את הגבולות המעשיים של יישומה.

דגימת DNA סביבתית מכלי שיט לצפייה בלווייתנים למעקב אחר יונקים

למד פרוטוקול להפקה סימולטנית של DNA ו-RNA משקעי חוף וכימות גנים ותעתיקי 16S rRNA באמצעות RT-qPCR. שיטה זו מאפשרת ניתוח מקיף של שפע ומגוון מיקרוביאלי בסביבה ימית.

הפקת DNA-RNA סימולטני החוף משקעים וכימות של 16S rRNA גנים תעתיקי ידי בזמן אמת PCR

גלה סרטונים נוספים