Name: הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: חקור את תהליך הפריימינג של נויטרופילים בחיות חיות באמצעות דיווחנים פלואורסצנטיים ודימות אינטרוויטלי. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר התנהגות תאי דם לבנים במודלים של מחלות נדירות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

למחברים אין אישורים.

כל הניסויים בבעלי החיים מבוצעים בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש מאונ&#39; טולדו. 1. phenotyping של עכברים pIL1-DsRed הערה: Offspring מופקים על ידי גידול עכברים הטרוזיגוטיים pIL1-DsRed עם wild-type (WT) עכברים C57BL6. שלושה עד ארבעה שבוע גורים ישנים נחשבים מוכנים phenotyping. דימום submandibular של עכברים כדלקמן פרוטוקול הוקם עם שינויים קלים 23. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של תאי דם לבנים מן הדם המלא של גורי עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של הפרין לכל צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש גור אחד מהכלוב. רשום את תג הזיהוי של הגור. אין הוא הכרחי כדי להרדים גורים לפני איסוף הדם מהעורק submandibular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק גור בעורפו צוואר לנקב את וריד submandibular ב הדואר כיס לחי באמצעות אזמל 5 מ&quot;מ. להפעיל כוח מספיק כדי ליצור לנקב קטן, כך טיפות דם להפריש מנקודת החדירה. שימוש במחט חדשה עבור כל גור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 3 - 5 טיפות של דם לכל גור בתוך שפופרת microcentrifuge המכיל הפרין. נקה את האתר לנקב ולהפעיל לחץ כדי להקל המוסטאסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שם גור בכלוב חדש ולבחון למשך 30 דקות לפני ההחזרה לכלוב למתקן החיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם מעכברים בוגרים של פנוטיפ המכונה בקרות חיוביות ושליליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של חיץ lysing של כדוריות דם אדומות על צינור אחד, צינורות מערבולת, דגירה במשך 5 - 10 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף 400 - 500 μl של בסרום שור העוברי (FBS) מתחת השעיות התא בצינור אחד. ממשק ברור ניתן להבחין בין השעית התא העליונה שכבה ו השכבה התחתונה של FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות שווים דגימות צנטריפוגות ב 1500 גרם × למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.1.7 - 1.1.9 לפרווהיס להסיר תאי דם אדומים. אל תחזור אם תמוגה מספיק בפעם הראשונה. הגלולה צריכה להיות קשה להבחין לאחר צנטריפוגה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lipopolysaccharide (LPS) גירוי והתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 200 μl של מכון הזיכרון רוזוול פארק שלם (RPMI) בינוני 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא זרימה cytometry צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך LPS הפתרון עובד על ידי ערבוב 10 μl של פתרון המניות LPS (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עם 990 μl של המדיום RPMI להשלים 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​LPS הפתרון עובד 200 μl של השעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות שווי רופפים דגירת דגימות במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנית רכישת נתונים עבור cytometry הזרימה. הגדרת תבנית רכישה לפני לדגום רכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כלי Dot-מגרש בלוח הכלי. צייר FO<html> פיזור rward (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) העלילה. הגדר את הפרמטרים מתח FSC ו SSC כדי בקנה מידה ליניארי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את ספי הנמוך ביותר של FSC ו SSC הדבר נתמך על ידי cytometer. החל ספי 200 ו -50 עבור FSC ו SSC, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך FSC לעומת העלילה SSC, לצייר G1 השער הכולל מונוציטים, גרנולוציטים, ותאים דנדריטיים, ולא כולל פסולת, תאי דם אדומים לימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכלי היסטוגרמה בפלטת הכלי. צייר היסטוגרמה FL2 (ערוץ הקרינה אדום). השתמש מדגם ביקורת שלילי להגדיר את הבסיס של אותות FL2 ומדגם בקרה חיובי לצייר שער כולל את כל אירועי DsRed החיוביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוח הבקרה fluidics של cytometer, להגדיר את מצב הנוזלים כדי &quot;להפעיל&quot; ואת קצב הזרימה &quot;HI&quot; (כ 60 μl / min). רוכשת 10,000 אירועים עבור כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע פנוטיפ גור על ידי מדידת אחוז התאים חיוביים DsRed משער G1. </li></ol></li></ol>class = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. אינדוקציה של דלקת עור של עכברים pIL1-DsRed <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים העכבר על ידי הזרקה (IP) הזרקה של קוקטייל הרדמה המכיל 100 מ&quot;ג / ק&quot;ג קטמין, 10 מ&quot;ג / xylazine ק&quot;ג, ו 1 מ&quot;ג / ק&quot;ג acepromazine. עכברים הרדימו כראוי לא מראים אחורית נסיגה כפה קמצוץ בוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל קרם להסרת שיער על פני השטח הגבי של שתי האוזניים של העכבר. מתן 30 שניות עד 1 דקות. נגב פני אוזן עם צמר גפן במים רטוב ולאפשר אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את עובי האוזן באמצעות מיקרומטר ולהחליף עכבר בכלוב נפרד. שימו לב עד ההתאוששות מן ההרדמה (~ 15 - 30 דקות). כדי לפתור דלקת עור הנגרמת על ידי מוצר הסרת השיער, לאפשר עכבר כדי לנוח במשך 3 ימים לפני ניסויים נוספים מתבצעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1.25% (w / v) OX ידי המסת 16.7 מ&quot;ג של OX ב 1 מ&quot;ל אצטון ערבוב 750 μl של פתרון OX / אצטון עם 250 μl של שמן זית. כן פתרון רכב על ידי ערבוב 750 μl של אצטון עם 250 &amp;# 181; l של שמן זית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להרדים עכבר באמצעות זריקת ip של קוקטייל הרדמה (2.1). מדוד את עובי האוזן כמו קודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 12.5 μl של OX 1.25% על כל צד של האוזן הימנית. החל 12.5 μl של פתרון הרכב שמן אצטון / זית על כל צד של האוזן השמאלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור עכבר להיפרד-חבריהם לכלוב עד התאושש לחלוטין כדי למנוע עלבון אוזניו ידי עכברים אחרים, ואז להחליף את העכבר בכלוב המקורי ולחזור מתקן דיור בעלי חיים. הערה: הסרת השיער עלולה לגרום דלקת עור קלה הבאה על ידי שינוי של עובי אוזן. דלקת קטין זה תיפתר לאחר-מכן 3 ימים אושר על ידי עובי אוזן נורמלי. לאחר יישום מקומי למשך 24 שעות, אוזניים שטופלו OX להראות משמעותי (p &lt;0.01) נפיחות פתרון הרכב לעומת האוזניים לבד שטופלו. </li></ol> 3. תיוג של נויטרופילים עכברים pIL1-DsRed הערה: תיוג vivo של נויטרופילים ידי f במינון נמוךluorescence מצומדות מב ספציפי נויטרופילים כדלקמן פרוטוקול שפותח לאחרונה 19. זריקות רטרו-מסלולית מבוצעות על פי פרוטוקול הוקם עם כמה שינויים 24. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עובד מב אנטי Ly6G ידי דילול 10 μl של 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Alexa פלואוריד 647 מצומדות אנטי Ly6G מב (שיבוט 1A8) ב 90 μl של בופר פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl של פתרון העבודה נגד Ly6G מב (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לתוך מזרק אינסולין U-100 עם 28 מחט מד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר מבוגר pIL1-DsRed על ידי זריקה ip של קוקטייל הרדמה שתואר לעיל (2.1). מניחים את הבטן העכבר הרדים למטה על לוח עבודה נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ כלפי מטה עדין על גב עור גחון בעין אחת עכבר כדי לבלוט את גלגל העין באופן חלקי מהשקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום מחט, שפוע למטה, בזווית של כ -30 מעלות על canthus המדיאלי לתוך רטרו מסלוליתסִינוּס. הערה: מפעיל הרשת הסלולרית יכול להרגיש את הלחץ, חדירה והתנגדות הקלה פעם מחדיר מחט לתוך הסינוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט חלקה להזריק 100 μl של מב אנטי Ly6G פתרון עובדים (5 מיקרוגרם מב / עכבר / הזרקה) לתוך העכבר. הסר את המחט במהירות. כמות קטנה של דימום מצביעה על זריקה מוצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להחיל 1.25% OX פתרון רכב על ימין ועל אוזני עכבר שמאליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 8 שעות, לנהל 100 μl של פתרון העבודה נגד Ly6G מוכן טרי מב (5 מיקרוגרם מב / עכבר / הזרקה) באמצעות הזרקת רטרו מסלולית לאותו עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את כלי הדם, מיד לפני הדמיה, לנהל 100 μl של 30 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​והעמסת isothiocyanate (FITC) מצומדות dextran (150 KDA) באמצעות הזרקת רטרו מסלולית. </li></ol> 4. הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים PIL-1-DsRed עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר עם זריקת ip של קוקטייל הרדמה (2.1).0; החל משחת וטרינרים לעיני עכבר כדי למנוע יובש לאחר הרדמה של הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1 מיליליטר חצי מנת קוקטייל הרדמה על ידי דילול 500 μl של קוקטייל הרדמה מקורי עם נפח שווה של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר חצי מנה קוקטייל ההרדמה כדי מזרק 1 מ&quot;ל עם מחט מד פרפר 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט של פרפר לתוך בטן עכבר intraperitoneally ולתקן את כנף הפרפר אל הבטן על ידי מקליטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip זכוכית במרכז הבמה הדמיה. קלטת את הקצוות של coverslip כדי להחזיקו במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של PBS על פני השטח הגחון של האוזן העכבר כמו גם על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדה הרדימה עכבר עם האוזן שלה על coverslip. הר קצה האוזן, צד הגב למטה, על ידי הרבדה לאוזן בין coverslip ו זכוכית שקופית, גם מוחזק במקום באמצעות קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוסקופ confocal קרינה רב-ליזר וכל הדואר הקשורquipment. לכבות את האורות בחדר כדי למזער את החשיפה אור הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת רכישת התמונה. בחר את ערוצי ליזר לגילוי של צבעי ניאון בתפריט הרשימה דיי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המיקוד על עור האוזן הדלקתי על ידי תצפית של אותות ירוקים מכלי דם האותות אדומים מתאי DsRed + דרך עיני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע סריקה מהירה עם מהירות סריקה של 2 מיקרו-שניות / פיקסלים ורזולוציה של 512 × 512 פיקסלים. בחר pseudocolor לכל ערוץ בתפריט התצוגה החי. התאם את הידית להתמקד להגדיר סוף ולהתחיל מיקום של סריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע סריקות איטיות עם מהירות סריקה של 4 - 8 μsec / פיקסלים ורזולוציה של 800 × 800 או 1,024 × 1,024 פיקסלים. התאם את המתח הגבוה, לזכות, וכן לקזז על כל ערוץ פרט למקסם את עוצמת האותות תוך הימנעות רוויה (פיקסלים אדומים). לא צריך להיות רק כמה פיקסלים אדומים בכל ערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת קבוצות תמונה תלת-ממדיות על ידי סריקת הדואר העור האוזן מתחיל באופן שטחי את השכבה הקרנית ועל התקדמותם כלפי מטה עם x, y, כרכים z של 317 מיקרומטר × 317 מיקרומטר × 30 מיקרומטר (אובייקטיבי 40X), 635 מיקרומטר × 635 מיקרומטר × 30 מיקרומטר (אובייקטיבי 20X), או 1,270 מיקרומטר × 1,270 מיקרומטר × 50 מיקרומטר (אובייקטיבי 10X) בשעה 2 מיקרומטר Z- צעדים. הערה: השכבה הקרנית היא השכבה החיצונית ביותר של האפידרמיס ולהיות יכולה מקומי מבוססת בקלות על אות autofluorescence החזקה שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים הדמיה זמן לשגות, שיא תלת ממדי תמונות כל 2 דקות או 4 עד 8 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסירוגין, כמו העכבר מתחיל להתאושש מההרדמה, ציין מבוסס על תצפיות של שפם מתעוות, לנהל 5 - 10 μl של קוקטייל הרדמה חצי מנה דרך מחט פרפר. הערה: היי זהירה של מינון ההרדמה - מנת יתר עלול לגרום למות עכבר. לחלופין, הרדמת משאיפת בצנצנת יכולה להיות מיושמת על העכבר עבור הרדמה לטווח קצר לביןחרטומו יוכל לשמש עבור הדמיה לטווח ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העכבר הרדים מהבמה כאשר ההדמיה תושלם. ניתוק הקלטת ולהסיר מחט פרפר מן בטן העכבר. החזר את העכבר בכלוב נפרד במתקן דיור בעלי חיים. הערה: עבור הדמיה לטווח קצר (&lt;1 שעה), עכברים להחלים לחלוטין מן ההרדמה במהירות 1 - 3 שעות. עבור הדמיה לטווח ארוכה (~ 8 שעות), עכברים להתאושש לאט, עם תקופת החלמה טיפוסית של 12 - 16 שעות. לפיכך, ממשל מים אוראלי מומלץ לפחות מספר פעמים במהלך תקופת ההחלמה על מנת למנוע התייבשות חמורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכי נתוני הדמית תהליך, לעקוב אחר תאים בודדים, ליצור נתיבי נדידה, ולחשב את הכיווניות ומהירויות של נדידת תאים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה ב -25. </li></ol>

<ol><li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at work.</a> Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).</li>
<li>Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Immunol.+Ther.+Exp.+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the innate immune response.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).</li>
<li>Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+priming%3A+pathophysiological+consequences+and+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Sci.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms.</a> Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).</li>
<li>El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+of+the+neutrophil+NADPH+oxidase+activation%3A+role+of+p47phox+phosphorylation+and+NOX2+mobilization+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane.</a> Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).</li>
<li>Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+imaging+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Cellular imaging in rheumatic diseases.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).</li>
<li>Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+microbial+immunity+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues.</a> Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).</li>
<li>Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+immunoimaging--deeper%2C+bigger%2C+more+precise%2C+and+definitively+more+colorful%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).</li>
<li>Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+biology+in+live+animals%3A+ready+for+prime+time%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cell biology in live animals: ready for prime time.</a> J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+recruited+by+chemoattractants+in+vivo+induce+microvascular+plasma+protein+leakage+through+secretion+of+TNF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF.</a> J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).</li>
<li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+S+inhibits+neutrophil+recruitment+during+the+early+stages+of+Streptococcus+pyogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-modal+imaging+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+transgenic+reporter+mice+reveals+the+dynamic+nature+of+inflammatory+changes+during+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression.</a> J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).</li>
<li>Slaba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+Dynamic+Platelet-Neutrophil+Response+in+Sterile+Liver+Injury+and+Repair+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice.</a> Hepatology. , (2015).</li>
<li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li>
<li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catchup%3A+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li>
<li>Matsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+IL-1beta+production+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of IL-1beta production in skin.</a> J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li>
<li>Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+imaging+for+the+in+vivo+tracking+of+high-speed+vesicle+transport+in+mouse+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils.</a> Sci. Rep. 3, (1913).</li>
<li>Sreeramkumar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+scan+for+activated+platelets+to+initiate+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation.</a> Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+priming+occurs+in+a+sequential+manner+and+can+be+visualized+in+living+animals+by+monitoring+IL-1beta+promoter+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation.</a> J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).</li>
<li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+simple%2C+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice).</a> Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+time-lapse+microscopy+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration).</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li>
<li>Mizumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+immunostimulants+by+dendritic-cell-based+functional+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening.</a> Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).</li>
<li>Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+proteins%3A+selling+cytokines+by+the+pound%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound.</a> Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).</li>
<li>Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+ATP-+and+LPS-induced+IL-1beta+release+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).</li>
<li>Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+domoic+acid+differ+between+in+vivo+and+in+vitro+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice.</a> Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).</li>
<li>Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+role+of+G-CSF+in+the+production%2C+survival%2C+and+release+of+neutrophils+from+bone+marrow+into+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation.</a> Blood. 100 (3), 854-861 (2002).</li>
<li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).</li>
<li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assessment+of+confocal+microscopy+slide-based+systems%3A+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability.</a> Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).</li>
<li>Hogan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+on+the+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics.+Int%22%5BJournal%5D)">Focusing on the experiment.</a> Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).</li>
<li>Kabashima, K., Egawa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+cutaneous+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).</li>
<li>Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+epidermal+keratinocytes+and+dermal+vasculatures+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dermatol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy.</a> J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).</li>
<li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים כספיים.

מטרת מחקר זה היא לפתח טכנולוגיה לניטור התהליך יחול נויטרופילים בעלי חי חיים, אשר טרם התקיימו על ידי הטכניקות זמינות כרגע. כדי להשיג מטרה זו, שלוש מתודולוגיות הוקמה מבוצעת: 1) אינדוקציה של דלקת עור IL-1β עכברי כתב DsRed מונחה אמרגן כאמצעי של הטרמה, 2) in vivo תיוג של נויטרופילים עם מינונים נמוכים של מצומדות-קרינה אנטי Ly6G מב, ו -3) הדמיה מיקרוסקופית confocal intravital. השילוב של שלוש שיטות אלה מאפשר הדמיה של פעילויות הניע של נויטרופילים דרוכים (DsRed + / Ly6G ...

נויטרופילים הם לויקוציטים בשפע קצרים מועד ביותר במחזור. הם מגויסים במהירות לאתרים של זיהום או פציעה, שבו הם משרתים פגוציטים כפי מקצועיים באמצעות שחרור ביניים חמצן וחנקן תגובתי יחד עם גרגירים המכילים פפטידים מיקרוביאלית פרוטאזות 1. במהלך גיוסם, נויטרופילים הם &quot;דרוכים&quot; על ידי סוכנים שונים כולל מוצרי חיידקים, chemoattractants, וציטוקינים דלקתיים, וכתוצאה מכך פונקציונלית תָא בַּלעָן משופרת במידה ניכרת עם הגיעם אתר של דלקת 2. המנגנונים של הטרמה נויטרופילים נחקרו רבות במבחנה 3,4; עם זאת, ניטור דינמי של התהליך in vivo מצטער לא יכל להסיג עד כה. לאחרונה, הדמית intravital הפכה טכניקה חשובה הדמיה לכימות הדינמיקה הסלולר של תהליכים ביולוגיים באורגניזמים חיים. Intraviהדמית טל יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ עירור אחד פוטונים קונבנציונליים (למשל, confocal) או מיקרוסקופיה multiphoton מתקרבת 5. במשך הזמן, שיפורים משמעותיים הושגו טכניקה זו מאפשרת רזולוציית תמונה מוגברת, עומק הדמיה משופרת, ירד נזקי רקמות, 6,7 ייצוב תמונה משופרת. בהינתן היכולת הייחודית שלה כדי לאפשר הדמיה דינמית של הגירה ואינטראקציה הסלולר לאורך זמן, מיקרוסקופיה intravital יושמה בהרחבה בתחומים מגוונים של מחקר באימונולוגיה 8. הדמית Intravital מאפשרת אימונולוגים כדי להבין טובים יותר את הקשר התגובה חיסונית ברמה התאית ומולקולרית הם חיים במודלים של בעלי חיים. התקדמות המהונדסת וכן עקומים בעכברי כתב ספקה כלים שימושיים לניטור ההתנהגויות הדינמיות של נויטרופילים ב בעלי חיים. אמרגן מונחה M ליזוזים חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת עקומהעכברים שימשו רחב לאפיין תנועתיות של נויטרופילים, מונוציטים, מקרופאגים במהלך תהליכים דלקתיים שונים כולל extravasation, זיהום חיידקי, ודלקת סטרילית 9-15. יתר על כן, העכברים הטרנסגניים המבטא biosensor העברת אנרגיה תהודה הקרינה cytoplasmic הועסק בחקר פעילות קינאז mitogen ו- A קינאז חלבון תאי-מוסדר נויטרופילים במעי מודלק 16. מודל Murine עם סגוליות גבוהות עבור ביטוי קרינת נויטרופילים הוא עכבר הקטשופ העקום, מייצר recombinase Cre וכן tdTomato חלבון פלואורסצנטי, שבעצמה מצמידה את הביטוי של 6G אנטיגן לימפוציטים (Ly6G) 17. ויזואליזציה של נויטרופילים Ly6G המחסרים באמצעות מודל זה הוכיחה כי התאים האלה להפעיל פונקציונליות נורמלית במגוון הקשרים דלקתיים סטרילי או זיהומיות in vivo. עכברים טרנסגניים המבטאים את p ניאון DsRedrotein גן בשליטת העכבר interleuikin-1β (IL-1β) אמרגן (pIL1-DsRed) כבר נוצל כדי להמחיש את התנהגויות ניע של תאים מייצרים IL-1β - האמין לכלול נויטרופילים, מונוציטים דלקתיים, מקרופאגים הופעל - המתעורר בעור מודלק 18. בשנת vivo תיוג יכול לשמש גישה חלופית לאיתור התנהגויות תאית ומולקולרית של נויטרופילים ברקמות דלקתיות. לאחר הזרקה תוך ורידית של מינונים נמוכים של שכותרתו fluorescently אנטי-GR-1 נוגדן חד-שבטי (מב), מפל גיוס של Gr-1 + נויטרופילים כבר דמיינו בנגעים בעור העכבר נגוע Staphylococcus aureus 19. בשנת vivo הממשל של conjugates המכיל streptavidin- מצומדות 705 נקודות קוונטיות ננומטר מב אנטי Ly6G biotinylated תווית במיוחד נויטרופילים במחזור 20. יתר על כן, אנדוציטוזה של conjugates כזה לתוך neutrophשלפוחית ​​il מאפשר מעקב התחבורה שלפוחית ​​במהירות גבוהה ב נויטרופילים נודדות אל interstitium. בשנת vivo תיוג עם נוגדנים הקרינה מצומדות נגד P-selectin גליקופרוטאין ליגנד-1 (PSGL-1), L-selectin (CD62L), integrin αM (CD11b chemokine ו) (מוטיב CXC) קולטן 2 (CXCR2) במודל של דלקת הנגרמת TNFα יש הבהיר את מנגנוני ויסות בבית לשחק במהלך מוקדם דלקת 21. נויטרופילים Polarized לבלוט PSGL-1 מועשר uropods לקיים אינטראקציה עם ההווה CD62L על טסיות מופעל, וכתוצאה מכך חלוקה מחדש של CD11b ו CXCR2, קולטנים שמניעים הגירה נויטרופילים וליזום את הדלקת. IL-1β הוא אחד הגנים החתים כי הוא מוגבה ב נויטרופילים דרוכים 22. בעכברים הכתב pIL1-DsRed, אותות הקרינה DsRed (כלומר., הפעלה של האמרגן IL-1β) לתאם באופן חיובי עם IL-1β ביטוי mRNA וייצור חלבון IL-1β. &lt;sup&gt; 18 כדי לפקח על תהליך של הטרמה נויטרופילים, שיטה מיקרוסקופית intravital פותחה מעורבים אינדוקציה של דלקת עור עם oxazolone (שור) במודל העכבר pIL1-DsRed הבאים in vivo תיוג של נויטרופילים עם מב הקרינה מצומדות אנטי Ly6G. Via מודל זה, ניתן ללמוד את ההתנהגות ותפקוד של נויטרופילים דרוכים במודלים של בעלי חיים של מחלות והפרעות שונות.

<table><tbody><tr><td>Heparin נתרן</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>ACK מאגר ליסינג</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>ליפופוליסכרידים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>קטמין הידרוכלוריד</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>מעבדת לויד</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>אצפרומזין</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>קרם להסרת שיער</td><td>Church & דווייט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>פישר מדעי</td><td>A16P4</td><td></td></tr><tr><td>אוקסזולון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 נוגדן נגד עכבר Ly6G BioLegend</td><td></td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>U-100 מזרק אינסולין עם מחט 28 גרם</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran, 150 kDa</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>סט עירוי פרפר (מחט 27 גרם)</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACSציטומטר קליבור</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro תוכנה</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>אולימפוס</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph תוכנה</td><td>הדמיה</td><td></td><td></td> אוניברסלית</tr></tbody></table>

הדמיה intravital של priming נויטרופילים שימוש il-1β מונחה יזם עכברים reporter dsred

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

נויטרופילים הם לויקוציטים הנפוצים ביותר במחזור דם אנושי מגויסים במהירות לאתרים דלקתיים. לקרקע הוא אירוע קטלני זה משפר את הפונקציונליות phagocytic של נויטרופילים. למרות מחקרים מקיפים חשפו את קיומה וחשיבותה של הטרמה נויטרופילים במהלך זיהום ופגיע, פירושו של ביטוי חזותי תהליך זה in vivo לא היה בהישג ידי. הפרוטוקול ספק מאפשר ניטור של התהליך הדינמי של נויטרופילים יחולו בחיות חיים על ידי שילוב שלוש מתודולוגיות: 1) אות כתב DsRed - משמש כמדד יחול 2) תיוג נויטרופילים vivo - מתקבל על ידי הזרקה של אנטיגן נגד לימפוציטים קרינה מצומדות 6G (Ly6G) נוגדן חד-שבטי (מב) ו -3) הדמיה confocal intravital. שלבים קריטיים כמה מעורבים בפרוטוקול זה: דלקת עור אוזן עכבר נגרם oxazolone, הרגעה מתאימה של חיות, זריקות חוזרות ונשנות של מב אנטי Ly6G, ו קודםention של סחיפה המוקד במהלך ההדמיה. למרות מספר מגבלות נצפו, כגון הגבלת זמן הדמיה הרציפה (~ 8 שעות) ב שמאלי ואת הדליפה של isothiocyanate-dextran והעמסה מכלי דם במדינה הדלקתית, פרוטוקול זה מספק מסגרת יסוד הדמית intravital של התנהגות ותפקוד נויטרופילים דרוכים, אשר ניתן להרחיב בקלות הבדיקה של תאי חיסון אחרים במודלי דלקת עכבר.

הקרנת עכברי pIL1-DsRed מתבצעת על פי איתות קרינת DsRed פנוטיפי המיוצרת על ידי לויקוציטים הדם ההיקפיים שלהם באמצעות cytometry זרימה. גירוי LPS ידוע לגרום ייצור IL-1β בתאים מיאלואידית כולל נויטרופילים, מונוציטים, ותאים דנדריטיים 26-28. לפיכך, לויקוציטים מבודד מודגרת עם LPS עבור 4 שעות לפני ניתוח תזרים cytometry. לאחר מכן, gating מוגדר במחזור התאים מיאלואידית על בסיס גודל תא (FSC) ומורכב פנימיים (SSC) (איור 1 א) 29,</su...

פרוטוקול נוכחי זה משתמש במדווחים פלואורסצנטיים, תיוג in vivo וטכניקות הדמיה תוך-חיוניות כדי לאפשר ניטור של התהליך הדינמי של תחול נויטרופילים בבעלי חיים חיים.

הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להציג טכנולוגיה לניטור תהליך תחול הנויטרופילים בבעלי חיים חיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון ויזואליזציה של ההתנהגות ותפקוד ההתחלה של הנויטרופילים במודלים של בעלי חיים של מחלות והפרעות נדירות ביותר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת שלוש מתודולוגיות מבוססות, כולל מדווחים פלואורסצנטיים בתיוג ויראלי והדמיה תוך-חיונית.לגדל עכברים הטרוזיגוטיים pIL1-DsRed עם שישה עכברים מסוג C57Black מסוג בר. בגיל שלושה עד ארבעה שבועות, פנוטיפ לגורים שלהם. לכל גור הכינו צינור של 1.5 מיליליטר עם 20 מיקרוליטר הפרין.כדי לאסוף דם, החזיקו גור בצווארו ונקבו את הווריד התת-לסתי בכיס הלחי באמצעות רומח בקוטר 5 מילימטר. יש צורך רק בפנצ'ר קטן. אסוף שלוש עד חמש טיפות דם בכל צינור.לאחר ביצוע האיסוף, הקפידו לעצור את הדימום ולהתבונן בבעלי החיים במשך 30 דקות לפני החזרתם למתקן החיות. לכל צינור דגימה, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה של תאי דם אדומים. לאחר מכן, מערבל את הצינורות, ודגר אותם במשך חמש עד 10 דקות על קרח.לאחר הדגירה, הוסף לאט 400 עד 500 מיקרוליטר של סרום בקר עוברי מתחת לתרחיפי התאים בכל צינור. צריך להיווצר ממשק ברור בין השכבות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות ב-1,500 גרם למשך חמש דקות כדי לאסוף כדורי תאים.השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב -200 מיקרוליטר של מדיום RPMI-1640 שלם. לאחר מכן, העבירו כל תרחיף לצינור ציטומטריית זרימה והוסיפו 20 מיקרוליטר של פתרון עבודה LPS טרי לכל צינור. דגרו את הדגימות במשך ארבע שעות לפני ביצוע ציטומטריית זרימה.כדי להתחיל, יש להרדים את העכבר בזריקה תוך-פרטונאלית של קוקטייל הרדמה ולאשר טשטוש הולם באמצעות בדיקת צביטה בבוהן. לאחר מכן, מרחו קרם להסרת שיער על פני הגב של שתי האוזניים, נגבו אותו תוך דקה ושטפו את העור במים. מדוד את עובי האוזן שבה בוצעו היישומים באמצעות מיקרומטר.מאוחר יותר, החזירו את העכבר לכלוב משלו לאחר שהתאושש מההרדמה, ואפשרו לעכבר לנוח לפחות שלושה ימים לפני בדיקה נוספת. לאחר שלושה ימים, יש להרדים את העכבר ולמדוד שוב את עובי האוזן כדי לוודא שהוא אינו מגורה. לאחר מכן, יש למרוח 12.5 מיקרוליטר של 1.25% אוקסזולון על כל צד של האוזן הימנית, ולמרוח 12.5 מיקרוליטר מתמיסת רכב שמן זית אצטון על כל צד של האוזן השמאלית.כמו תמיד, צפו בעכבר מתאושש מההרדמה. 24 שעות לאחר מכן, מדדו שוב את עובי האוזן בהרדמה כדי לוודא שהתרחשה דלקת עור הנגרמת על ידי אוקסזולון. כדי להתחיל, העבירו 100 מיקרוליטר של נוגדן חד-קולונלי XG אנטי-ליז למזרק אינסולין U100 עם מחט בקוטר 28.לאחר מכן, יש להרדים עכבר שטופל כפי שתואר קודם לכן. כשבטן העכבר כלפי מטה, הפעל לחץ עדין כלפי מטה על העור הגבי והגחוני לעין כדי להבליט חלקית את גלגל העין. לאחר מכן, הנח בזהירות את המחט, שפוע כלפי מטה, כ-30 מעלות לקנתוס המדיאלי והכנס בזהירות את המחט לסינוס הרטרו אורביטלי.לחץ החדירה יוקל כאשר המחט תיכנס לסינוס. לאחר מכן, הוצא את התוכן והסר את המחט במהירות. כמות קטנה של דימום מרמזת על הזרקה מוצלחת.כעת, יש למרוח מיד 1.25% אוקסזולון ותמיסת רכב על אוזני העכבר הימנית והשמאלית כמו קודם. שמונה שעות לאחר מכן, יש לתת מנה שנייה של אותו נוגדן לכל עכבר. כמו כן, כדי לדמיין את כלי הדם, יש לתת רטרו 100 מיקרוליטר של פיטק דקסטרן.לצורך הליך זה, תחילה יש להרדים את העכבר כמו קודם. לאחר מכן, מרחו משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש במהלך ההדמיה. לאחר מכן, הנח כיסוי זכוכית במרכז שלב הדמיה, ואבטח את שולי הכיסוי בעזרת סרט.כמו כן, הוסף טיפת PVS לכיסוי. כעת, מקם את אוזן העכבר מעל הכיסוי, כשהצד הגבי כלפי מטה. לאחר מכן, הרטיבו את פני הגחון של אוזן העכבר בטיפת PVS.לאחר מכן, הרכיבו את קצה האוזן עם שקופית זכוכית למעלה ואבטחו את השקופית בעזרת סרט. כעת, הפעל מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי רב לייזר ואת הציוד הנלווה. כבה את אורות החדר כדי למזער את החשיפה לאור הסביבה.לאחר מכן, הקלט תמונות תלת מימדיות באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקלי. עבור ניסויי הדמיה דולג זמן, הקלט תמונות תלת מימדיות כל שתיים עד ארבע דקות למשך עד שמונה שעות. כל אותו הזמן, שימו לב לשפם מתעוות, מה שמעיד על כך שהעכבר מתחיל להתאושש מההרדמה.במצבים כאלה, יש לתת חמישה עד 10 מיקרוליטר של חצי מנה של קוקטייל הרדמה באמצעות מחט פרפר. עכברים אדומים pIL-1-DsRed נבדקו עבור פלואורסצנטיות DsRed פנוטיפית המיוצרת בלויקוציטים בדם היקפי באמצעות ציטומטריית זרימה. תאים מיאלואידים במחזור מעכברים מסוג בר מבטאים באופן מינימלי את DsRed, בעוד שאותם תאים מעכברי pIL1-DsRed מבטאים אותות DsRed הניתנים להבחנה.הפעלת מקדם בטא IL-1 היא סמן של תחול נויטרופילים, וניתן לדמיין אותה בצורה הטובה ביותר בעכברי pIL-1DsRed חיים. לאחר מכן, רגיש לעור, אוקסזולון, נמרח באופן מקומי על אוזן ימין. מאוחר יותר, הנויטרופילים סומנו לפני ואחרי יישום שני של רגיש האוקסזולון באמצעות הזרקת רטרו אורביטל.כמו כן, הוזרק פיטק דקסטרן לאיתור כלי דם. תאים רבים בעלי תווית כפולה נמצאו בחלל החוץ-וסקולרי, המייצגים נויטרופילים דרוכים. מספר קטן של תאים סומנו רק על ידי נוגדן lyse XG, שככל הנראה היו נויטרופילים במנוחה.יתר על כן, נצפתה אוכלוסייה קטנה של תאים חיוביים ל-DsRed, שעשויים להכיל מונוציטים דלקתיים ומקרופאגים מופעלים. עקבו אחר מסלולי נדידת התאים כדי להשוות בין שתי אוכלוסיות הנויטרופילים. שתי אוכלוסיות הנויטרופילים הראו נדידה אקראית לאחר שנכנסו לחלל החוץ-תאי.מעניין שהנויטרופילים הראשונים לכאורה הפגינו מהירות גבוהה משמעותית בהשוואה לעמיתיהם המשוערים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה. שניים חוקרים את ההתנהגות והתפקוד של תאים חיסוניים רבים במצבים דלקתיים שונים הכוללים תאי T שונים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעקוב אחר התהליך הדינמי של תחול נויטרופילים בבעלי חיים חיים.

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו מתארים פולשני שני הפוטונים (2P) הגישה מיקרוסקופיה ללמוד ליקוציט ביות ב שודד את העכבר. אנו דנים בהיבטים הטכניים של ההכנה שלנו רקמות הדמיה ללכת את הקורא דרך בניסוי אופייני הראשונית להגדיר לאוסף ביצוע ונתונים.

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

אנו מתארים פרוטוקול של מיקרוסקופיה brightfield intravital למדידת דינמי נויטרופילים-אנדותל האינטראקציות התא במהלך לגיוס נויטרופילים בתגובה מקור chemoattractant נויטרופילים in vivo. זחילה נויטרופילים intraluminal, הגירה chemotaxis transendothelial ו ברקמת השריר cremaster העכבר הם דמיינו עם הצילום בזמן שחלף וידאו מעקב עם ImageJ.

מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

סרטון זה מדגים הדמיה in vivo כדי לחקור את דינמיקת גיוס הנויטרופילים באתר זיהום בעכבר מהונדס מדוכא חיסון עם נויטרופילים המבטאים GFP. זה כרוך הזרקת חיידקים זוהרים כדי לגרום לזיהום. זה מוביל גיוס נויטרופילים לאתר הזיהום, אשר מעקב נעשה על ידי הדמיה.

ניטור דינמיקת גיוס נויטרופילים ועומס חיידקים באתר ההדבקה במודל מורין

סרטון זה מדגים טכניקה in vivo להערכת אנטיגן בדיקה על ידי גרימת דלקת עור במודל מורין. האנטיגן הנבדק - הפטן בתמיסת שמן/אצטון - נמרח באופן מקומי על עור אוזן העכבר, ודלקת העור מוערכת לאחר תקופה מספקת.

טכניקה להערכת התגובה החיסונית נגד אנטיגן על ידי גרימת דלקת בעור

כאן אנו מדווחים טכניקה ניסויית של מיקרוסקופיה intravital פלואורסצנטי לדמיין אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים. טכנולוגיה מיקרוסקופית זה תהיה יקרה כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של מחלת כלי דם ולבדוק סוכנים תרופתיים בתנאי pathophysiological.

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

ההדמיה intravital ברזולוציה גבוהה עם ניגודיות משופרת עד 120 מיקרומטר עומק בבלוטות הלימפה של עכברים בוגרים מושגת על ידי מרחבית ויסות דפוס העירור של מיקרוסקופ שני פוטונים רב המוקדים. ב100 עומק מיקרומטר מדדנו החלטות 487 ננומטר (לרוחב) ו551 ננומטר (צירי), ובכך לעקוף את מגבלות פיזור ועקיפות.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

אנו מפרטים פרוטוקול לניטור התנהגותם של נויטרופילים ומונוציטים בוורידים מזנטריים במצב יציב ובתנאים דלקתיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך-חיונית בעכברים מורדמים.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

המנגנונים ששולטים תנועתיות ביניים של תאי T מסוג CD4 מפעיל באתרים של דלקת הם יחסית לא ידועים. אנו מציגים גישה לא פולשנית לדמיין ולטפל בתאים במבחנה -primed CD4 T בדרמיס האוזן הדלקתית, המאפשר חקר את ההתנהגות הדינמית של תאים אלה באתרו.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה של IL- 8 האמרגן תלוי דלקת ההפעלה הריאות של עכברים באמצעות הדמיה פליטת אור לא פולשני (BLI). אותו בעל חיים יכול להיות נתון BLI מספר פעמים במשך עד חודשיים מזמן המסירה של הכתב לוציפראז לבנות.

דגם IL-8 עכבר transgenized חולף עבור<em&gt; בויבו</emמעקב ארוך טווח אחר תגובות דלקתיות

כאן, אנו מראים כיצד לבצע מיקרוסקופ לאחר הנימי של השריר הראשי של העכבר. בדרך כלל מיושם מודלים שונים של דלקת אלח דם, במיוחד אלה המושרה על ידי נוגדנים ו ציטוקינים, אנו להדגיש את הרלוונטיות שלה במחקר של מוסקולופאאס מעורבים חדירה מוגזמת שרירי לוקיציט.

הסתננות לאוציט של שריר Cremaster בעכברים המוערך על ידי מיקרוסקופ אינטרטל

נדידת נויטרופילים מסתמכת על עיצוב מחדש מהיר ומתמשך של קרום הפלזמה בתגובה לכימואטרקנט והאינטראקציות שלו עם המיקרו-סביבה החוץ-תאית. מתואר כאן הליך המבוסס על מיקרוסקופ תת-תאי תוך תאי כדי לחקור את הדינמיקה של עיצוב מחדש של ממברנות בנויטרופילים המוזרקים לאוזן של עכברים מורדמים.

הדמיה של נדידת נויטרופילים בעור העכבר כדי לחקור עיצוב מחדש של קרום תת-תאי בתנאים פיזיולוגיים

חקור את תהליך הפריימינג של נויטרופילים בחיות חיות באמצעות דיווחנים פלואורסצנטיים ודימות אינטרוויטלי. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר התנהגות תאי דם לבנים במודלים של מחלות נדירות.

הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed

גלה סרטונים נוספים