הדור של גזע תאים מושרה-פלוריפוטנטיים שימוש פיברובלסטים דמויי Synoviocytes מבודדת מן מפרידים של בחולי דלקת מפרקים שגרונית

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא ליצור תאי גזע מושרים-פלוריפוטנטיים, או IPC, מסינוביוציטים דמויי פיברובלסטים המבודדים מהרקמה הסינוביאלית של מפרק דלקתי של דלקת מפרקים שגרונית. נכון לעכשיו, iPSC יכול להיווצר מתאים ראשוניים אנושיים שונים. יצרנו בהצלחה iPSC מסינוביוציטים דמויי פיברובלסטים אנושיים, שהם התאים הפתולוגיים העיקריים של מפרקים שגרוניים.

זה עשוי לעזור לחקור את הפתולוגיה של דלקת מפרקים שגרונית. כתב עת זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי ניוון של IPSC, באמצעות RA-FLSs. התחל בהנחת הרקמה הסינוביאלית בכלי של 100 מילימטר ושטיפת הרקמה עם 5 מיליליטר PBS בתוספת אנטיביוטיקה.

הסר את רקמת השומן הצהבהבה ושאריות העצם. לאחר מכן העבירו את הרקמה הגזומה לבאר אחת של צלחת שש בארות המכילה 5 מיליליטר DMEM בתוספת FBS והשתמשו במספריים כדי לטחון את הרקמה עד שהחתיכות קטנות מספיק כדי לחדור לקצה פיפט חד פעמי. העבירו את המדיום לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, ואז הוסיפו לבאר 5 מיליליטר של DMEM טרי בתוספת FBS כדי לאסוף את כל הרקמה שנותרה ולהעביר את כל תכולת הבאר לצינור.

לאחר מכן, הוסף קולגנאז מופשר קרח לריכוז סופי של 0.01% לצינור ואטום את הצינור עם פרפילם לדגירה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול. לאחר ארבע שעות, מלאו את הצינור ב-DMEM טרי בתוספת FBS לנפח סופי של 50 מיליליטר ואספו את שברי הרקמה באמצעות צנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה ואז השהה מחדש את התאים ב-40 מיליליטר של מדיום טרי לצנטריפוגה נוספת.

השעו מחדש את הגלולה השנייה ב-25 מילליטר של DMEM טרי בתוספת FBS ואפשרו לגושי הרקמה הגדולים להתייצב. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצלחת חדשה של 100 מילימטר ודגרו על הסינוביוציטים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 14 יום. כדי להרחיב את תרבית הסינוביוציטים, השליכו את המדיום המשומש ושטפו את התאים ב -5 מיליליטר PBS.

הסר את ה- PBS ונתק את התאים עם 1 מיליליטר של EDTA בחממת תרבית התאים למשך 2 דקות. בתום הדגירה, הקש בעדינות על הצלחת כדי לנתק את כל התאים הדבקים שנותרו ולהעביר את תרחיף התאים שנוצר לצינור חרוטי של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה ב-30 מיליליטר של DMEM ו-FBS ופצלו את התאים ל-3 צלחות חדשות של 100 מילימטר.

האכילו את הסינוביוציטים במדיום טרי כל 3 ימים, ופצלו את התאים ל-3 תרביות חדשות במפגש של 80% כפי שהודגם זה עתה. ביום התמרה אפס, ראה 3 x 10 ל-FLS הרביעי לבאר על צלחת של 6 בארות במדיום גידול טרי לדגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2. למחרת, יש להפשיר בקבוקון אחד של נגיף לנטי המכיל 4 גורמי יאמאנאקה ב-4 מעלות צלזיוס ולהחליף את מדיום התרבית FLS במדיום גידול FLS בתוספת הקסדימתרין ברומיד וחומצה אסקורבית.

כאשר תכולת הבקבוקון מופשרת, מוסיפים 30 מיקרוליטר של נגיף לנטי לתאים ומערבבים בעדינות כדי להפיץ את הנגיף בצורה הומוגנית. כדי לשפר את הזיהום, יש לצנטריפוגה את הצלחת ולהחזיר את התאים לחממה ולהחליף את המדיום כל יום במדיום גידול FLS טרי המכיל נתרן בוטיראט וחומצה אסקורבית למשך 3 ימים. ביום הרביעי, החלף את המדיום בתערובת של גידול FLS ומדיום iPSC המכיל נתרן בוטיראט וחומצה אסקורבית.

ביום החמישי מוסיפים 60 מיקרוליטר ויטרונקטין ל -6 מיליליטר PBS ללא סידן ומגנזיום ומצפים 3 בארות של צלחת 6 בארות עם 2 מיליליטר מהתמיסה כל אחת למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר. בזמן שהוויטרונקטין מתייצב, שטפו את התאים המתמרים עם PBS ונתקו אותם עם EDTA כפי שהודגם. לאחר איסוף התאים המנותקים על ידי צנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה ב-900 מיקרוליטר של מדיום טרי.

הסר את עודפי הוויטרונקטין מהבארות והוסף 300, 150 ו -100 מיקרוליטר תאים לבארות בודדות. לאחר מכן החזירו את התאים לאינקובטור, והחליפו את המדיום מדי יום במדיום iPSC טרי עד להופעת מושבות. כדי לבחור את המושבות, יש להוסיף תחילה 500 מיקרוליטר של מדיום iPCS, בתוספת מעכב ROCK לכל באר של צלחת 48 בארות מצופה וירונקטין.

לאחר מכן, הניחו את תרביות ה-FLS תחת מיקרוסקופ מנתח על ספסל נקי, והשתמשו בקצה פיפט של 10 מיקרוליטר כדי לחתוך סביב מושבה מעניינת. בעזרת קצה פיפט של 200 מיקרוליטר, העבירו את המושבה שנבחרה לבאר אחת מתוך צלחת 48 הבארות. לאחר שנקטפו כל המושבות, הניחו את הצלחת בחממת תרבית התאים עד שהמושבות גדולות מספיק להעברה.

פיצול התאים כאשר המושבות נמצאות מחוץ לשדה הנראה של המיקרוסקופ, כפי שנראה בהגדלה של פי 100. בתמונה זו ניתן לראות את המורפולוגיה של ה-FLS המבודד לאחר תרבית ראשונית של 14 יום. התאים מציגים את המאפיינים של פיברובלסטים באופן כללי עם ביטוי דומה של הסמנים הפיברוטיים וימנטין ופיברונקטין וכן ביטוי נמוך של סמן הסינוביוציטים דמוי המקרופאגים CD-68.8 עד 11 ימים לאחר ההתמרה הוויראלית של גורם יאמאנאקה, מתחילות להופיע מושבות קטנות שניתן לקטוף ולהגביר במשך 5 עד 10 מעברים.

דלקת מפרקים שגרונית זו מבטאת פוספטאז אלקליין המצביע על כך שהם נשארים לא מובחנים. התאים מבטאים גם סמנים פלוריפוטנטיים כפי שאושרו על ידי RT-PCR וניתוח אימונופלואורסצנטי. iPCS של דלקת מפרקים שגרונית מציגים דפוס כרומוזומלי תקין של 44+XY כפי שנקבע על ידי קריוטיפ.

פורתור, 12 שבועות לאחר הזרקתם לעכברי SCID, דלקת מפרקים שגרונית iPSC יצרה טרטומה, המציגים פנוטיפים מגוונים של רקמות. עם התמיינות שכבת הנבט שלהם מאושרת על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית. לאחר השליטה, ניתן לייצר iPSC מ-FLS עם סינוביום.

לאחר הצפייה בסרטון, אתה אמור להבין טוב יותר כיצד לבודד מרקמה סינוביאלית וכיצד לגרום לתכנות מחדש באמצעותם. iPSC אלה שמקורם ב-RAF-FLS יכולים להיות שימושיים לחקר התחדשות או בדיקת תרופות בראומטולוגיה. ברגע ש-iPSC אלה נוצרים, סוגים שונים של תאי מטרה או איברים יכולים להיווצר.

מה שעשוי להיות שימושי לחקר המחלה או יישומים עתידיים אחרים, כגון עריכת גנים וכן הלאה.