Name: Assay גיבוש האנדותל תא Tube אסטרטגי: השוואת מטריקס ו- Growth Factor מופחתת מטריקס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: חקור מיצוב צינורות תאי אנדותל לחקר אנגיוגנזה בסרטן באמצעות מטריצות חוץ-תאיות ותאי HUVEC. שיטה זו מאפשרת כימות מדויק של השפעת מעכבי CXCR2 על תהליכי יצירת כלי דם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה מומנה על ידי הקרן למחקר וחינוך רפואי, אוניברסיטת וויין סטייט, דטרויט, מישיגן.

1. תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x10 Seed 5 תאים HUVEC ב 10 מ&quot;ל של מדיום הגידול להשלים 10 בבקבוק 75 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 כדי מפגש 70-80%. </li></ol> 2. Assay גיבוש אבובית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה או המטריצה ​​מופחתת-factor (GFR) הצמיחה התאית או תאי מטריקס רגיל לילה על קרח על 4 מעלות צלזיוס. הערה: למען הקיצור &#39;מטריקס&#39; מעתה לשמש כפנייה היא GFR ו מטריקס רגיל. התהליך כדי להכין אותם הוא זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תרבות צלחות 96-היטב על קרח, ולהוסיף 50 μl של מטריקס מצונן היטב לכל משתמש טיפים מראש מקורר. הכן בשלושה עותקים של 5 בארות המכילות רק את תאי מטריקס הרגיל. הכן בשלושה עותקים אחרים של 5 בארות המכילות תאי מטריקס GFR בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צלחת 96-היטב על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את HUVECsפעם עם פתרון שנאגרו-פוספט ללא סידן ומגנזיום (PBS), ולהוסיף 0.05% 1 מ&quot;ל טריפסין-EDTA. דגירת הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-5 דקות, בדיקת התאים מכל רגע עד לעגל כלפי מעלה רוב התאים. לסלק את התאים על ידי הקשה על בקבוקון פעם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסיפו 5 מיליליטר בינוני בסיס (כלומר, מדיום גידול תא האנדותל בלי כלום (למשל, ספקים) אינם במקור) עם 1% עוברי שור סרום (FBS). אוספים את התאים בבקבוק ידי pipetting ולהעביר צינור 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות עם 2 מ&quot;ל בינוני הבסיס, לספור את התאים באמצעות hemocytometer, ולהתאים את ריכוז התאים 2-3 x 10 5 תאים / מ&quot;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 μl של מעכב CXCR2 10x ריכוזי הבאים SB225002 במדיום הבסיסי: 11 מיקרומטר, 5.6 מיקרומטר, 1.1 מיקרומטר, 0.56 מיקרומטר ו 0 מיקרומטר (שליטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 300 μl של ההשעיה HUVEC לתוך כל 5 micrצינורות ocentrifuge. להוסיף 33 μl של ריכוזי מעכב (11 מיקרומטר, 5.6 מיקרומטר, 1.1 מיקרומטר, 0.56 מיקרומטר ו 0 מיקרומטר) לתוך צינור אחד בכל המכיל את HUVECs, ו מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μl של כל אחד המתלים תא (1-1.5 x 10 4 תאים) כדי בארות בודדות של מטריקס. פלייט כל השעיה בשלושה עותקי דגירה במשך 4-16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4-16 שעות, לקחת 4 תמונות של הצינורות יצרו לכל טוב באמצעות מצלמת מיקרוסקופ הפוכה 11 (גדלה מקורית x 100). </li></ol> 3. Assay שיבוש אבובית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תאי מטריקס וצלחות פי מפרט זהה גיבוש Tube Assay (שלבים 2.1 עד 2.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ההשעיה HUVEC כמתואר בשלבים 2.4- 2.4.2 של היווצרות צינור Assay ו aliquot לתוך צלחת 96-היטב המכיל את תאי מטריקס ב 50 μl לכל טוב. הערה: פלייט של בארות מספיקo כי יש 3 בארות לכל טיפול תרופתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים על תאי מטריקס עבור 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. קח תמונות לפני תחילתו של טיפול תרופתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ריכוזי 2x של SB225002 מעכב CXCR2 כמתואר שלב 2.5 של assay היווצרות צינור, ולהוסיף 50 μl של כל ריכוז לכל טוב של 96 את הצלחת היטב המכיל את HUVECs. פלייט כל ריכוז בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצליחה במשך 2-12 שעות אחרות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. קח 4 תמונות של הצינורות נוצרו בכל טוב באמצעות מצלמת מיקרוסקופ הפוכה (גדלה מקורית × 100) 11. </li></ol> 4. כימות נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת היווצרות צינור שנתפסו בתמונות על ידי מדידת אורך הצינור הכולל של צינורות בארבעה תחומים מיקרוסקופיים אקראי באמצעות תוכנת המצלמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונה בתוכנת מצלמת מיקרוסקופ, ולחץ על &#39;הסברים ומדידות9 ;. בקטע &#39;אורך&#39;, בחרו בכלי &#39;קו פשוט&#39;. הקישו על התמונה, ואז למתוח קו לאורכו של הצינור, ואז קליק ימני. הערה: התוכנה תחשב אוטומטית את האורך של הקו בפיקסלים ולשים את הנתונים לקובץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עבור כל קווי הצינור בתמונה על ידי בחירת הכלי &#39;קו פשוט&#39;. הקישו על התמונה, ואז למתוח קו לאורכו של הצינור, ואז קליק ימני. הערה: התוכנה תתעד את אורכו של כל קו ולהציג את הנתונים על המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי בדיקת כל צינור בתמונה, לחץ על &#39;יצוא&#39;, ולאחר מכן בחר &#39;אורך לגיליון אלקטרוני&#39;. הערה: הנתונים אורך ייוצאו גיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את כל אורכי הצינור מתוך הגיליון האלקטרוני כדי לקבל את אורך הצינור הכולל. חישוב ולהקליט את האורך הממוצע של החצוצרות. הערה: ארבעה משכפל מומלץ עם ממוצע וסטיית תקן שנקבע. </li></ol> 5. תאים כאשר התאוששו מן התרבות תא מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ולבצע assay היווצרות צינור (ראה סעיף 2) בקנה מידה גדול יותר כמו צלחת 96 גם לא תניב ספירת תאי מספיק. במשך 12 צלחות היטב, השתמש 500 μl של מטריקס ו 500 μl של השעית תא HUVEC (1.5x10 5 תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים למשך 4-16 שעות כדי להרכיב צינורות. ואז, לשאוב את מדיום תרבית תאים. יש לשטוף את התאים עם 1 מ&quot;ל של PBS 1x קר ללא סידן ומגנזיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של קרח קר PBS-2.5 mM EDTA חיץ על תרבות ולשמור על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסלק את התאים תערובת תאי מטריקס מצלחת באמצעות קצה פיפטה 1,000 μl עם קצה לחתוך, ולאחר מכן להעביר צינור 15 מ&quot;ל קר, לשטוף היטב עם 4 מ&quot;ל של קרח קר PBS-2.5 mM EDTA ולשים לתוך הצינור . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את הצינורות על קרח למשך 1-4 שעות ו להפוך את הצינור כמה פעמים עד שכל תאייםמטריקס נמס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 1,620 XG ב 0 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות את כדורי תא עם 1 מ&quot;ל קר PBS לצינור 1.ml על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות שוב במשך 5 דקות ב 3000 XG ב 0 מעלות צלזיוס, אז להשליך את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את התאים -80 מעלות צלזיוס. </li></ol>

<ol><li>Sharma, B., Nawandar, D. M., Nannuru, K. C., Varney, M. L., Singh, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CXCR2+enhances+chemotherapeutic+response%2C+inhibits+mammary+tumor+growth%2C+angiogenesis%2C+and+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting CXCR2 enhances chemotherapeutic response, inhibits mammary tumor growth, angiogenesis, and lung metastasis.</a> Mol Cancer Ther. 12 (5), 799-808 (2013).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-2+pericytes+participate+in+normal+and+tumoral+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 307 (1), 25-38 (2014).</li>
<li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+as+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li>
<li>Speyer, C. L., Hachem, A. H., Assi, A. A., Johnson, J. S., DeVries, J. A., Gorski, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptor-1+as+a+novel+target+for+the+antiangiogenic+treatment+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptor-1 as a novel target for the antiangiogenic treatment of breast cancer.</a> PLoS One. 9 (3), 88830(2014).</li>
<li>Gu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Apurinic%2FApyrimidinic+Endonuclease+siRNA+Inhibits+the+Angiogenesis+Induced+by+X-Ray+Irradiation+in+Lung+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease siRNA Inhibits the Angiogenesis Induced by X-Ray Irradiation in Lung Cancer Cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 10 (7), 870-882 (2013).</li>
<li>Manjunathan, R., Ragunathan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+chorioallantoic+membrane+as+a+reliable+model+to+evaluate+osteosarcoma-an+experimental+approach+using+SaOS2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line.</a> Biol Proced Online. 17, 10(2015).</li>
<li>Nidhyanandan, S., Boreddy, T. S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphodiesterase+inhibitor%2C+pentoxifylline+enhances+anticancer+activity+of+histone+deacetylase+inhibitor%2C+MS-275+in+human+breast+cancer+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo.</a> Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+improves+the+anti-angiogenic+activity+of+disulfiram+through+the+EGFR%2Fsrc%2FVEGF+pathway+in+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett.+Aug%22%5BJournal%5D)">Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas.</a> Cancer Lett. Aug. , (2015).</li>
<li>Park, H. J., Zhang, Y., Georgescu, S. P., Johnson, K. L., Kong, D., Galper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+human+dermal+microvascular+endothelial+cells+offer+new+insights+into+the+relationship+between+lipid+metabolism+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis.</a> Stem Cell Rev. 2 (2), 93-102 (2006).</li>
<li>Clonetics Endothelial Cell System Technical Information & Instructions. , Lonza Walkersville, Inc. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf">http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf</a> (2015).</li>
<li>The Essence of Cutting-edge Microscopy Research. , Nikon Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.nikoninstruments.com/images/stories/PDFs/Eclipse_Ti_Brochure.pdf">http://www.nikoninstruments.com/images/stories/PDFs/Eclipse_Ti_Brochure.pdf</a> (2008).</li>
<li>de Wit, C., Fautz, C., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+PCR+for+retrovirus-like+particle+quantification+in+CHO+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture.</a> Biologicals. 28 (3), 137-148 (2000).</li>
<li>50% of what? How exactly are IC50 and EC50 defined. , Graphpad Software. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.graphpad.com/support/faqid/1356/">http://www.graphpad.com/support/faqid/1356/</a> (2015).</li>
<li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+endothelial+cells+for+derived+from+umbililcal+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מתי לבצע assay זה, זה הכרחי כדי לשמור על תאי מטריקס על הקרח או על 4 מעלות צלזיוס בכל עת, אלא אם כן צוין אחרת. אם תאי מטריקס מותר לחמם מעל 4 מעלות צלזיוס, זה יהיה לפלמר, ואת assay ייהרס. כמו כן, חשוב להבטיח שכל דבר בא במגע (למשל, טיפים pipet, צלחת) עם תאי מטריקס היא מראש מקורר מהסיבה הנ&quot;ל. מספר תאי זרע בכל טוב הוא קריטי, מעט מדי תאים לא ינתנו באינטרנט הצפוי במדגם השליטה, יותר מדי תאים יהוו צבירי תאים גדולים או בשכבה ואת assay לא יהיה תוקף. גורם חשוב נוסף בהצלחת assay זהו המספר מעבר התא של HUVECs. המספר מעבר תמיד צריך להיות נמוך מעשרה, אחרת היווצרות צינור חזקה עשויה שלא להתרחש. בנוסף, יש לוודא, כי מדיום תרבית תאים בשימוש לא פג, או התאים לא יהיו בת קיימא. Alternatively, אפשר aliquot המדיום ומרכיביו ולאחסן אותם ב -20 ° C לשמר לתקופה של זמן לאחר תאריך התפוגה. כמובן, זה עדיין עדיף להשתמש במדיום לפני מועד התפוגה כמו כל הנהלים, יש כמה חסרונות ביצוע assay היווצרות צינור תא האנדותל. אחת הבעיות הגדולות היא, כי ישנם סוגים שונים של תאי אנדותל ומטריצות תמיכה, התוצאות של assay יכול להשתנות במידה רבה בהתאם לסוג של התא מטריצה ​​משמש. לתאי אנדותל בשימוש (HUVECs, HAECs או HMVECs) הם תאים ראשוניים, הם יקרים כדי לקבל ויש השתנות לעומת תאים הונצח. התאים הראשוניים יש קטעים מוגבלים לשימוש, ולכן אינם מתאימים לניסויים אנגיוגנזה לטווח ארוך 14. לקבלת נתונים אמינים, אחד תמיד צריך להשתמש את אותם סוגים עבור assay. כמו עם אחרים מבחני חוץ גופית, התוצאות של assay היווצרות צינור צריך להיות conוייצב vivo, כי תוצאות של בתנאים המבוקרים ומלאכותיים של תרביות רקמה דו ממדים לא תמיד להשתקף biosystem המורכב של אורגניזם חי. כמו כן, חשוב לזכור כי זה סוג של assay ניתן להשתמש רק כדי להדגים היווצרות צינור תא האנדותל, ולא צריך לשמש כדי לבדוק אחרים, שאינם אנדותל, תאי להרכיב צינור. assay זוהי שיטה פשוטה ומהירה למדי לכמת פוטנציאל angiogenic של תרכובת. היא גם יוצרת פלטפורמה עבור ניסויים נוספים, כמו לבד, זה לא להניב מידע לגבי המנגנון הספציפי שבו למתחם למעשה משפיע על תהליך גיבוש הכלי. עם זאת, השימוש של מטריצות תאיות מגוונות היא דוגמא כיצד להמשיך ליצור מסגרת שאלות מחקר אשר אינו נפוצה. ישנן גישות כדי לחקור את המנגנונים ביו-כימיות הספציפיות של המתחם כולל מעכבים ספציפיים למקד מרכיביםמסלול אנגיוגנזה. גישה אחרת עשויה להיות לחלץ RNA מתאי אנדותל ולהשתמש RT-PCR (Real Time PCR) 12 לנתח שינויים של ביטוי גנים אשר עלול לגרום להתנהגות צמיחה שנצפתה assay. יישומים עתידיים של שיטה זו כוללים טרנספקציה HUVECs ליצור מבחנים לדפוק למטה לצעדים ספציפיים של מסלול אנגיוגנזה. קיים פוטנציאל ליישם את הגישה הזאת כדי ללמוד את מסלול lymphangiogenesis. על ידי שינוי הרכיבים התאים מטריקס, האינטראקציה של מטריקס תהליך הסלולר התומכים אנגיוגנזה בסרטן ניתן הובהר נוספת. הפקת רנ&quot;א וחלבונים מתא אנדותל בתנאים מסוימים אלה מספקות נתונים מדידים נוספים מתאימים הדמית נתונים.

על מנת לקבל את החומרים המזינים הדרושים להישרדות, גידולים ממאירים דורשים גישה לזרם הדם של החולה. כדי לקבל גישה זו, תאים סרטניים משחררים אותות כימיים המעודדים צמיחה של כלי דם חדשים לגידול, ובכך חטיפת תהליך פיזיולוגי נורמלי המכונה אנגיוגנזה 2. זוהי גם דרך כלי הדם שנוצרו באמצעות אנגיוגנזה כי גרורות (כלומר, התפשטות הסרטן לאיברים אחרים) יכול להתרחש. בגלל התהליך של אנגיוגנזה הוא כל כך חיוני להתקדמות של רחב מגוון של סרטן מסוג זה, היא יעד אטרקטיבי במחקר טיפול נגד סרטן 3. שיטה אחת בשימוש לכמת אנגיוגנזה היא למדוד את היכולת של תאים ובתאים אנדותל להקים צינורות כאשר הניח על תאי מטריקס. בגלל היווצרות של צינורות אלה היא צעד מוקדם קריטי אנגיוגנזה, בדיקת תנאי הסביבה (למשל, נוכחות או העדר שיתוף נתוןmpound) שיכולים לעורר או לעכב היווצרות צינור מספק תובנה צעדים ספציפיים שניתן להתמקד בהם כדי לעכב אנגיוגנזה. את assay היווצרות צינור תא האנדותל הוא אחת השיטות 4 הנפוץ ביותר במבחנה אשר מודד את היכולת של התאים כדי ליצור צינורות. זהו assay פשוט, הדורש רכיבים מעטים יחסית ותקופת תרבות קצרה 5. ואולי הכי חשוב, עם זאת, הוא כי הנתונים שנצברו סוג זה של assay הוא לכימות. דוגמא לשימוש של assay היווצרות צינור כרוך להשוות את ההתפתחות של צינורות מתאי אנדותל כלי דם גדלו על תאי מטריקס לעומת גורם גדילה המופחת (GFR) מטריקס. המטריצה ​​התאית היא חומר קרום דמוי במרתף מבודד מתאי סרקומה המרכיבים העיקריים שלה הם laminin, קולגן מהסוג IV, גורמי גדילת proteoglycans. יש תרכובות מסוימות השפעות שונות על היכולת של התא כדי ליצור צינורות כאשר בסביבה עם גורמי גדילה מופחתים proteoglycans סולפט heparan המופחת (HSPGs). HSPGs הם מרכיב של מטריקס אשר מצטמצם משמעותית מטריקס GFR. כדוגמה, אם ההשערה כי מעכבי אנגיוגנזה, כגון SB225002, החוסם את קולטן CXCR2, חלשים היכולת ניכרת לקטוע היווצרות צינור כאשר HSPGs נמצאים בשפע, אז השוואה בין פעילות היווצרות צינור ב תאי מטריקס ו מטריקס GFR הוא חשוב לבחון את האפשרות של עיכוב אנגיוגנזה באמצעות השלט של HSPGs. מבחני אחרים המשמשים בדרך כלל כדי לקבוע את ההשפעות של תרכובות על אנגיוגנזה נמצאים שיטות vivo. דוגמאות בולטות לכך הן קרום חומוס chorioallantoic (רמ&quot;א) assay 6 באמצעות ביצי תרנגולת, ואת Matrigel vivo ב תקע assay אנגיוגנזה 7 באמצעות עכברים. בעוד שיטות in vivo למדוד אנגיוגנזה tממדים hree והם יותר נציג של גוף האדם לעומת assay היווצרות צינור חוץ גופית, הם סובלים את הפגם של הדורש באופן משמעותי יותר זמן הם הרבה יותר קשה לבצע. הן assay CAM ואת assay תקע תאיים לקחת לפחות שבוע 8 לעשות, ואילו השוואה, assay היווצרות צינור יכול להיעשות ביום אחד והוא אינו דורש שימוש בבעלי חיים. חשוב לציין כי תאי אנדותל נעשה שימוש בדוח זה הם תאי אנדותל וריד אדם הטבור (HUVEC). תאים אלה ממלאים תפקיד מרכזי ניבט כלי דם ואת צמיחת כלי דם, והם מקבילים במידה מספקת לתאי אנדותל בסרטנים לשמש לשם הערכת פעילות אנטי-אנגיוגנזה היא במבחנה בניסויי vivo 9. תאים אחרים כגון לתאי אנדותל כלי דם עיקריים עשויים לשמש גם. כמו כן, חשוב לציין כי חוץ מזה שיש תחתוןרמות של HSPGs, מטריקס GFR גם הפחיתה רמות של רכיבים רבים בהשוואה מטריקס רגיל. זה כולל, אך אינו מוגבל: EGF, IGF-1, PDGF, ו TGF-beta. אלה ניסויי ביצוע לומדים את המשמעות של תרכובות אלה ביחס אנגיוגנזה עשויים להיות מעוניינים להשתמש מטריקס GFR.

<table><tbody><tr><td>מדיום גידול מלא EGM-2 (ערכת כדורי EGM-2 CC-3162) מדיום גידול</td> מלא <td>של Fisher</td><td>NC9525043</td><td>HUVEC: מדיום בסיס EGM-2 מעורבב עם BBE (תמצית מוח בקר), hEGF (גורם גדילה אפידרמלי אנושי), הידרוקורטיזון, GA-1000 (גנטמיצין, אמפוטריצין-B), 2% FBS (סרום בקר עוברי), VEGF (גורם גדילה אנדותל כלי דם), hFGF-ובטא; (גורם גדילה פיברובלסטים אנושי בטא), R3-IGF-1 (גורם גדילה דמוי אינסולין R ארוך 1), חומצה אסקורבית והפרין. ציטוט המדיום ומרכיביו ואחסן אותם ב-20&nbsp; &deg; C, חם ב-37&nbsp; &deg; C לפני השימוש.</td></tr><tr><td>מטריצת מטריג'ל 10 מ"ל גורם גדילה מופחת (GFR); 10&nbsp; מ"ל; </td><td>מטריצה</td> חוץ-תאית ללא LDEV <td>Fisher CB-40230</td><td>Growth Factor Reduced (GFR), שמור ב-20&nbsp; &deg; C, חם ב-4&nbsp; &deg; C לפני השימוש.</td></tr><tr><td>מטריצת מטריג'ל 10 מ"ל; 10&nbsp; מ"ל; </td> מטריצה חוץ-תאית <td>של פישר</td><td>CB-40234</td> ללא LDEV<td>, שמור ב-20&nbsp; &deg; C, חם ב-4&nbsp; &deg; C לפני השימוש.</td></tr><tr><td>SB225002</td><td>פישר</td><td>559405</td><td>מעכב CXCR2, יש לשמור ב-20&nbsp; &deg; C, יש לחמם בטמפרטורת החדר לפני השימוש.</td></tr><tr><td>תאי אנדותל ראשוניים של וריד הטבור האנושי (HUVEC)&nbsp;</td><td>מעבדות המחקר של ScienCell&nbsp;</td><td>8000</td><td>תרבית זה על פי התייחסות&nbsp; 10.טריפסין</td></tr> <tr><td>0.05%-EDTA פנול אדום</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>שמור ב-4&nbsp; &deg; C, חם ב-37&nbsp; &deg; C לפני השימוש.</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td>מיקרוסקופ מחקר הפוך.&nbsp;</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 4.20.02 64 סיביות</td><td>תוכנת מיקרוסקופ מחקר הפוך</td><td>של Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Graph-pad Prism 5</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>תוכנה מדעית לגרפים וסטטיסטיקה דו-ממדיים, לחישוב IC50.</td></tr></tbody></table>

assay גיבוש האנדותל תא tube אסטרטגי: השוואת מטריקס ו- growth factor מופחתת מטריקס

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

גידולים ממאירים זקוקים לאספקת דם על מנת לשרוד ולהתפשט. גידולים אלה משיגים את הדם הדרוש להם מזרם הדם של המטופל על ידי חטיפת תהליך האנגיוגנזה, שבו נוצרים כלי דם חדשים מכלי דם קיימים. קולטן CXCR2 (קולטן כימוקין (מוטיב C-X-C) 2) הוא מולקולה טרנסממברנית הקשורה לחלבון G הנמצאת בתאים רבים וקשורה קשר הדוק לאנגיוגנזה1. חסימה ספציפית של קולטן CXCR2 מעכבת אנגיוגנזה, כפי שנמדד על ידי מספר בדיקות כגון בדיקת היווצרות צינור האנדותל. בדיקת היווצרות הצינור שימושית לחקר אנגיוגנזה מכיוון שזוהי שיטה מצוינת לחקר ההשפעות שעשויות להיות לכל תרכובת נתונה או מצב סביבתי על אנגיוגנזה. זוהי בדיקה חוץ גופית פשוטה ומהירה המייצרת נתונים הניתנים לכימות ודורשת מעט רכיבים יחסית. בניגוד למבחני in vivo, הוא אינו דורש בעלי חיים וניתן לבצע אותו תוך פחות מיומיים. פרוטוקול זה מתאר וריאציה של המטריצה החוץ-תאית התומכת בבדיקת היווצרות צינור אנדותל, הבודקת את קולטן CXCR2.

<html> ניכר, בריא היווצרות צינור אנדותל ניתן בניגוד בקלות היווצרות צינור עכבות בתמונות מיקרוסקופ. היווצרות צינור בריאה מופיעה כרשה מאורגנת של המבנים נימי דמוית (איור 1). לשם השוואה, היווצרות צינור עכבות בא לידי ביטוי כמו תאים מפוזרים (איור 2). נתוני assay היווצרות צינור הוא לכמת על ידי מדידת אורך הצינור הכולל של צינורות נימים (טבלה 1). מלבד אורך הצינור הכולל, אורך צינור הממוצע, המספר הכולל של צינורות, או המספר הכולל של נקודות הסניף ניתן למדוד. היווצרות צינור מובני מניב אורך צינור נטו יותר מאשר צמיחת צינור עכבות מפוזרת. באיור 3, עקומת מנה תגובה מאפשר חישוב של IC 50 תחת תנאי הניסוי של HUVECs על תאי מטריקס GFR ו מעכב CXCR2 SB225002. &gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig1.jpg" /> איור 1. האנדותל t Ube היווצרות תא מטריקס והצמיחה מופחת גורם (GFR) מטריקס. שתי תמונות להראות היווצרות צינור מוצלחת על תאי מטריקס (א) ו מטריקס GFR (B). הרשת מחוברת צינורות מראה בבירור כי הצמיחה של צינורות היא בריאה HUVECs אלה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig2.jpg" /> איור 2. עיכוב של היווצרות צינור על-מופחת גורם תאי וצמיחה (GFR) תאי מטריקס ידי SB225002 CXCR2 מעכב (5.6 מיקרומטר). שתי תמונות להראות צינורהיווצרות כי כבר מעוכבים על ידי SB225002 CXCR2 מעכב (5.6 מיקרומטר) על תאי מטריקס (א) ו מטריקס GFR (B). הגושים הבודדים של תאי HUVEC לראות להראות את התמונה כי התאים לא היו מסוגלים ליצור את צינורות הצורך להתחבר זה לזה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig3.jpg" /> מנת איור 3. עקומת תגובה על-מופחת גורם גדילה (GFR) מטריקס. ציר ה- X מראה אורך צינור ואת ציר Y מראה את ריכוז מעכב CXCR2. עקומת מנת התגובה מראה כי תגובת HUVEC לבולמי CXCR2 על תאי מטריקס GFR תלויה במינון. IC 50 (המעכב מקסימאלי וחציריכוז y) חושב באמצעות תוכנת 13 וניתן לעומת עקומת מנת תגובה עבור מטריקס, למשל. IC 50 הוא ריכוז מעכב כי מקטין את התגובה ל -50%. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Growth Factor המופחת (GFR) תאי מטריקס ו מעכב (4 משכפל כל אחד) </td><td> סה&quot;כ Tube אורך ממוצע (פיקסלים) (1 פיקסל = 0.34 מיקרומטר) </td><td> סטיית תקן </td><td> P ערך </td></tr><tr><td> GFR מלא תאי מטריקס </td><td> 2447 </td><td> 168.174 </td><td></td></tr><tr><td> GFR תאי מטריקס + 0.56 מיקרומטר SB225002 </td><td> 1422.5 </td><td> 185.4218 </td><td> 0.000395 </td></tr><tr><td>GFR תאי מטריקס + 1.1 מיקרומטר SB225002 </td><td> 1004 </td><td> 126.1784 </td><td> 2.14 x 10 -5 </td></tr><tr><td> GFR תאי מטריקס + 5.6 מיקרומטר SB225002 </td><td> 519.25 </td><td> 129.6368 </td><td> 4.19 x 10 -6 </td></tr><tr><td> GFR תאי מטריקס + 11 מיקרומטר SB225002 </td><td> 393.75 </td><td> 212.6857 </td><td> 1.21 x 10 -5 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. כימותי אורכי צינור מוחלטים על צמיחה מופחתת גורם (GFR) מטריקס בתנאים משתנים. חלק של טבלה באמצעות אורכי צינור הכוללת שנרשמו דגימות גדלו על תאי מטריקס GFR עם ריכוזים שונים של מעכב CXCR2. מן הנתונים עולה כי מעכב CXCR2 עושה לעכב היווצרות צינור. הוצאות כוללים ערכים הקשורים כגון ממוצע של ארבע חזרות, סטיית התקן, וערך P. נמדד בפיקסלים להראותהנתונים מיוצאים. ניתן לחשב 50 IC באמצעות תוכנה סטטיסטית 13. (1 פיקסל = 0.34 מיקרומטר)

כתב יד זה מתאר בדיקת היווצרות צינור כדי לכמת את ההשפעות של תרכובת או מצב נתון על אנגיוגנזה על ידי שימוש בהיווצרות צינור תא אנדותל בסביבה מבוקרת.

Assay גיבוש האנדותל תא Tube אסטרטגי: השוואת מטריקס ו- Growth Factor מופחתת מטריקס

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לכמת את התלות של יצירת צינורות על ידי תאי אנדותל בחמוצים אנגיוגניים (angiogenic chemokines), תוך שימוש בשתי מטריצות חוץ-תאיות שונות המכילות רכיבים הנקשרים למולקולות אנגיוגניות שונות. שיטה זו יכולה להשיב על שאלות מפתח בתחום האנגיוגנזה בסרטן, כגון, מדוע אנגיוגנזה נתמכת על ידי מסלולים חלופיים באמצעות שינויים במטריצה החוץ-תאית? היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם היותה כמותית והשימוש במספר קטן יותר של משתנים.את הפרוצדורה תדגים גב' Donghong Ju, עובדת מחקר במעבדה. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הפשירו overnight בטמפרטורה של 4 °C מטריצה חוץ-תאית (extracellular matrix) מסוג GFR או מטריצה חוץ-תאית רגילה. השאירו את פלטת התרבית בעלת 96 הבארות על קרח והוסיפו לכל באר 50 µL של מטריצה חוץ-תאית מקוררת באמצעות טיפים של פיפט שקולל מראש.הכינו שלשות של חמישה בארות המכילות רק מטריצה חוץ-תאית נורמלית, ולאחריהן שלשות של חמישה בארות המכילות רק מטריצה חוץ-תאית של GFR. לאחר מכן, דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, שטפו את ה-HUVEC פעם אחת ב-PBS, ללא סידן ומגנזיום, והוסיפו 1 mL של 0.5% Trypsin EDTA.לאחר מכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך דקה עד חמש דקות, ובדקו אותם מדי דקה עד שמרבית התאים יקבלו צורה עגולה. לאחר מכן, השריקו את התאים על ידי נקישה על הבקבוק. לאחר מכן, הוסיפו לבקבוק 5 mL של Basal medium עם 1% FBS.העבירו את התאים לשפופרת של 15 מיליליטר. לאחר מכן, סבבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 200 ×g למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, השליכו את העליון (supernatant) והשעיקו מחדש את התאים בשני מיליליטר של Basal medium.ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר (hemocytometer) והתאימו את ריכוז התאים לשניים עד שלושה כפול 10 בחזקת 5 תאים למיליליטר. לאחר מכן, הכינו 100 µL של חמישה ריכוזים שונים של CXCR2 inhibitor בריכוז 10X בתוך Basal medium. העבירו באמצעות פיפט 300 µL מתליהית ה-HUVEC לכל אחת מחמשת מבחנות המיקרו-צנטריפוגה הנפרדות.לאחר מכן, הוסיפו 33 µL של מעכב בריכוז 10X מכל ריכוז למבחנות המכילות HUVEC וערבבו אותן באמצעות וורטקס. לאחר מכן, העבירו בפיפט 50 µL מכל אחת מתליית התאים לבארים נפרדות של המטריצה החוץ-תאית. זרעו כל תליה בשלוש חזרות, ודגרו למשך 4 עד 16 שעות בטמפרטורה של 37 °C.לאחר מכן, צלם ארבע תמונות לכל באר באמצעות מצלמה של מיקרוסקופ הפוך. בהליך זה, הכן את המטריצה החוץ-תאית ואת הפלטות בהתאם לאותן מפרטים של בדיקת יצירת צינוריות. לאחר מכן, הכן את תרחיף ה-HUVEC וחלקה לפלטת 96 בארות המכילה את המטריצה החוץ-תאית בנפח של 50 µL לבאר.לאחר מכן, גדלו את התאים על המטריקס החוץ-תאי במשך ארבע שעות ב-37 °C. לאחר מכן, דגמו תמונות לפני תחילת הטיפול התרופתי. בשלב הבא, הכינו חמש ריכוזים שונים של פי 2 (2X) של מעכב CXCR2 בתוך Basal medium.הוסיפו 50 µL של מעכב CXCR2 מכל ריכוז לכל אחת מ-96 הבארות המכילות HUVEC. לאחר מכן, הדגירו את הפלטה למשך שעתיים עד 12 שעות נוספות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, צלמו ארבע תמונות של כל באר באמצעות מצלמה של מיקרוסקופ הפוך.כדי להעריך את היווצרות השפופרות שנלכדה בתמונות, מדדו את אורך השפופרות הכולל בארבעה שדות מיקרוסקופיים אקראיים באמצעות תוכנת מצלמת המיקרוסקופ. לשם כך, פתחו את התמונה בתוכנת מצלמת המיקרוסקופ ולחצו על Annotations and Measurements. תחת סעיף Length, בחרו בכלי הקו הפשוט (simple line tool).לחצו על התמונה, שרטטו קו לאורך השפופרת, ולאחר מכן לחצו קליק ימני לביצוע החישוב. לאחר מכן, חזרו על הפעולה עבור כל קווי השפופרות בתמונה באמצעות בחירה בכלי הקו הפשוט. לחצו על התמונה, שרטטו קו לאורך השפופרת, ואז לחצו קליק ימני.התוכנה תתעד את אורכה של כל שורה ותציג את הנתונים על המסך. לאחר מדידת כל מבחנה בתמונה, לחצו על Export, ולאחר מכן בחרו ב-Length to Spreadsheet כדי לייצא את נתוני האורך לגיליון אלקטרוני. סכמו את כל אורכי המבחנות מהגיליון כדי לקבל את אורך המבחנות הכולל.בשלב הבא, חשבו ורשמו את אורך המצעורות הממוצע. בהליך זה, תרבתו את התאים ותבצעו בדיקת יצירת מצעורות (tube formation assay) בלוחית 12 בארות. דגרו את התאים למשך ארבע עד 16 שעות כדי לאפשר את יצירת המצעורות.לאחר מכן, שאבו את מצע תרבית התאים ושטפו את התאים עם מיליליטר אחד של 1XPBS קר ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, הוסיפו על התרבית מיליליטר אחד של בופר PBS קר מאוד עם 2.5 millimolar EDTA והשאירו אותה על קרח למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, השריעו את תערובת התאים והמטריקס החוץ-תאי מהצלחת באמצעות טיפ של פיפט של 1,000-microliter שקצהו נגזר.לאחר מכן, העבירו את התאים לשפופרת קרה בנפח 15 מיליליטר. שטפו את הבאר עם 4 מיליליטר של PBS קר מאוד והעבירו את הנוזל לאותה שפופרת. בשלב הבא, הניחו את השפופרת על קרח למשך שעה אחת עד ארבע שעות והפכו את השפופרת מספר פעמים עד להמסת המטריקס החוץ-תאי.לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 0°C. לאחר מכן, השביו את משקע התאים ב-1 mL של PBS קר בתוך מבחנה של 1.5 mL על קרח. סבבו בצנטריפוגה פעם נוספת למשך חמש דקות בטמפרטורה של 0°C.לאחר מכן, יש להסיר את הנוזל העליון (supernatant) ולאחסן את התאים בטמפרטורה של 80 degrees Celsius. שתי תמונות אלו מראות יצירה מוצלחת של צינוריות אנדותל על גבי מטריצה חוץ-תאית נורמלית ומטריצה חוץ-תאית של GFR. רשת הצינוריות המקושרת מראה בבירור כי צמיחת הצינוריות ב-HUVEC אלו היא בריאה.שתי תמונות אלו מראות את עיכוב היווצרות השפופרות על ידי מעכב CXCR2, SB225002, בריכוז של 5.6 micromolar על מטריצה חוץ-תאית נורמלית ועל מטריצה חוץ-תאית של GFR. גושי ה-HUVEC המבודדים הנראים בתמונה זו מראים כי התאים לא היו מסוגלים ליצור את השפופרות הדרושות כדי להתחבר זה לזה. גרף זה מראה כי התגובה של HUVEC למעכב CXCR2 על מטריצה חוץ-תאית של GFR תלויה במינון.לאחר ביצוע הפרוצדורה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון QRTPCR או רצף RNA באמצעות התאים שהוכנו. נתונים כגון אורך צינור ממוצע, מספר צינורות כולל או מספר נקודות פיצול כולל, ניתן להפיק באמצעות תמונות כדי לאפיין את תהליך האנגיוגנזה תחת תנאי הניסוי.

strategic-endothelial-cell-tube-formation-assay-comparing

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Assay הקמת הצינור משמש להערכת פעילות כלי הדם של תאים סרטניים.

Matrigel מבוסס גיבוש Tube Assay להעריך את פעילות Vasculogenic של תאים סרטניים

Assay היווצרות הצינור הוא שיטה מהירה, לכימות למדידת אנגיוגנזה במבחנה. תאי האנדותל הם בשילוב עם אמצעי תקשורת מותנה ומצופים על תמצית קרום במרתף. היווצרות צינור מתרחשת בתוך שעות וצינוריות שהוקמו זה עתה לכמת בקלות.

Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל<em&gt; במבחנה</em&gt; חקר אנגיוגנזה

אנו מתארים המבדק פשוט מבוססי תאים לזיהוי, כימות לפקח על פעילות בני משפחת פקטור הגדילה של אנדותל כלי הדם של הליגנדים. את assay משתמש קולטנים chimeric לידי ביטוי קו תא גורם תלוי לתת הערכה וכמותיות או הכמות של קולטן מחייב cross-linking ידי ליגנד.

מבדק פשוט עבור הערכת גורמי הגדילה של אנדותל כלי דם

עבור במבחנה אינדוקציה של המעבר אנדותל-mesenchymal (EndMT), אשר הוא שימושי עבור חוקרים הסלולר איתות המסלולים מעורב EndMT, פרוטוקול המתואר. במודל זה ניסיוני, EndMT הנגרמת על ידי טיפול עם TGF-β בתאי האנדותל MS-1.

אנליזה מולקולרית של אנדותל-mesenchymal מעבר המושרה על ידי הפיכת גורם גידול-β איתות

כאן, אנו להעריך את ההשפעות של תמצית המים של רוטה הקבר על היווצרות הרשת באמצעות שימוש בשיטת היווצרות צינור על מטריצה מרתף ג.

מערכת שפופרת HUVEC להערכת השפעת מוצרים טבעיים על אנגיוגנזה

מערכת שיתוף התרבות התלת-ממדית של החברה מיועדת לחקות את האנגיוגנזה הפיזיולוגי. שיתוף תרבות הספרואידים נוצרות על ידי שני מקדים האדם תא כלי דם, ECFCs ו MSCs, ו מוטבע ג'ל קולגן. המערכת החדשה יעילה להערכת מאפטורים מאופגנטיים, ומספקת מידע רלבנטי יותר למחקר בvivo.

3-מימדי אנגיוגנזה שיטת מערכת באמצעות Spheroids שיתוף תרבות נוצר על ידי ויוצרים מושבת המושבה תאים ותאי גזע Mesenchymal

מטרת שיטה זו היא להשיג פיברוההדף מטריצות 3D נגזר כפיגום טבעי עבור הבאים הסלולר assays. פיברותקיעות מורצת לוחית התרבות שטופלו מראש ומגורה עם חומצה אסקורבית ליצירת מטריקס. מטריצות מdecellularized וחסומות לתאים רלוונטיים לתרבות (למשל, תאי האנדותל).

מערכת מטריצה תלת-ממדית פיברובלסט הישימה בשיטת היווצרות שפופרת אנדותל

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור כל הר באתרו הכלאה של RNA ניתוח ב-דג זברה והיווצרות שפופרת שיטת החולה-נגזר המושרה תא גזע מתאים הנגזר ללמוד את התפקיד של אנגלין במערך כלי הדם.

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

הפרוטוקול הנוכחי מאפשר התאוששות של מבנים דמויי צינור שנוצרו במבחן היווצרות צינור אנגיוגנזה קלאסי במבחנה שבו תאים, כגון תאי טרופובלסט, מתארגנים במבנים דמויי נימים על גבי שכבה של מטריצת קרום בסיס חוץ-תאית. המבנים המשוחזרים משמשים לבידוד RNA וחלבונים לניתוחים ביוכימיים שונים.

התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות

מחקר זה מציג את בדיקת נדידת פצעי השריטה הדו-ממדית (2D) ואת בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית (3D), יחד עם שיטות הניתוח שלהם במורד הזרם, כולל מיצוי RNA ואימונוציטוכימיה, כבדיקות מתאימות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

חקירת אנגיוגנזה ברמה תפקודית ומולקולרית על ידי מינוף בדיקת נדידת פצע השריטה ובדיקת הנבטת הספרואיד

חקור מיצוב צינורות תאי אנדותל לחקר אנגיוגנזה בסרטן באמצעות מטריצות חוץ-תאיות ותאי HUVEC. שיטה זו מאפשרת כימות מדויק של השפעת מעכבי CXCR2 על תהליכי יצירת כלי דם.

Assay גיבוש האנדותל תא Tube אסטרטגי: השוואת מטריקס ו- Growth Factor מופחתת מטריקס

גלה סרטונים נוספים