בידוד נייד phenotyping של בתאי גזע mesenchymal נגזר הסינוביאלי נוזל מח עצם של Minipigs
2 ביולי 2016
מוצג פרוטוקול המבסס תאי גזע מזנכימליים (MSCs) המבודדים מהנוזל הסינוביאלי וממח העצם של מיני-חזירים ונאספים באופן לא פולשני באמצעות שאיבת מזרק. פנוטיפ תאי בוצע באמצעות זרימה ציטומטרית לאחר בידוד תאים וגידול במבחנה של מח עצם ונוזלים סינוביאלים שמקורם ב-MSCs.
המטרה הכוללת של הליך זה היא איסוף לא פולשני של נוזל סינוביאלי ומח עצם ממיני-חזירים לאיסוף תאי גזע מזנכימליים שישמשו במחקרי התחדשות ואימונומודולציה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפול באוטולוג MSC, כגון כיצד לבסס את הנוזל הסינוביאלי ב-MSC, וכיצד לאפיין אותם בהשוואה ל-MSC של מח עצם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לבסס ביעילות את תכונות המפתח של נוזל סינוביאלי ו-MSCs שמקורם במח עצם ממיני-חזירים, אשר יהיו שימושיים ליישום בחולים.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות מפרקים שונות, מכיוון שאוכלוסיית ה-MSC שמקורו בנוזל הסינוביאלי בחלל הסינוביאלי גדלה באופן משמעותי בחולים אתלטיים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי רפואה רגנרטיבית, ניתן ליישם אותה גם במחקרים אחרים כגון מחקר מחלות אוטואימוניות. מכיוון שמיני-חזירים MSCs הם אוטולוגיים, דיכוי חיסוני עשוי לעניין בני אדם.
בנוסף למדענים האחרים, ידגימו את ההליך Hyeon-Jeong Lee ו-Won-Jae Lee מהרמה השלישית שלי. כדי להתחיל, כוון מיני-חזיר מורדם כדי לגשת לסמל הכסל. לאחר מכן, יש להסיר אזור של 15 סנטימטרים רבועים על פסגת הכסל, בעזרת סכין גילוח או קוצץ.
לאחר מכן, שפשפו לסירוגין את העור החשוף שלוש פעמים עם פובידון-יוד ואתנול 70%. לאחר ייבוש מלא, מרחו וילונות סטריליים. כעת, מצפים מראש מזרק של עשרה מיליליטר בהפרין, באמצעות שטיפה של שלושה עד ארבעה מיליליטר.
זה ימנע ממח העצם להיקרש בזמן מיצוי. לאחר מכן, בדיוק בפסגת עצם הכסל, חבר בחוזקה מחלץ מח עצם למזרק המצופה הפרין, וחלץ לפחות חמישה מיליליטר של מח עצם. כדי לבודד את התאים ממח העצם שחולץ, יש לדלל אותו תחילה בנפח שווה של DPBS בצינור חרוטי של 15 מיליליטר בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, טען שלושה מיליליטר של מדיית צנטריפוגה בצפיפות לתוך צינור חרוטי שני של 15 מיליליטר. לאחר מכן, העבירו בזהירות ארבעה מיליליטר של מח העצם המדולל על אמצעי הצנטריפוגה בצפיפות כדי ליצור שכבות דו-תמיסות. כעת, צנטריפוגה את הצינור ב-400 גרם למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.
ה-MNCs הרצויים נאספים בשכבה הלבנה המרכזית. שאפו רק את השכבה הזו. הוציאו את שכבת ה-MNC לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר, ודללו אותה בשבעה עד שמונה מיליליטר DPBS.
לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב -500 גרם למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את התאים המשטחים פעמיים עם עשרה מיליליטר DPBS, וחזרו על מחזור הצנטריפוגה הקודם. לאחר שתי השטיפות אנו משעים את ה- MNCs בשני מיליליטר ADMEM.
לאחר מכן, העמיסו את התאים על צלחת תרבית רקמה של 35 מילימטר, ודגרו אותם בטמפרטורה של 38.5 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של פחמן דו חמצני של 5%. לאחר 48 שעות, שאפו את המדיום יחד עם ה-MNCs הלא מחוברים. לאחר מכן, הוסיפו בחזרה שני מיליליטר של ADMEM טרי, והמשיכו את הדגירה, והחליפו את המדיום כל שלושה ימים.
כאשר התאים מגיעים למפגש של 70 עד 80%, יש לשטוף את התרבית עם DPBS טרי. לאחר מכן, נתקו את התאים, באמצעות מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין-EDTA למשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. אוספים את התאים בעשרה מיליליטר ADMEM, ומעבירים אותם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.
לאחר מכן, סובבו את התאים ב-300 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, והשליכו את הסופרנטנט. כעת, השעו את ה-MNCs שנקטפו במיליליטר אחד של ADMEM טרי, ומדדו את הצפיפות שלהם. סיים עם ציפוי בין 1/2 לשלושת רבעי מיליון תאים לצלוחיות T25 עם ארבעה מיליליטר ADMEM.
דגרו את הצלוחיות בדיוק כמו הצלחות, והחליפו את המדיום כל שלושה ימים. הכינו קטע עור בגודל 15x10 ס"מ מעל מפרק הירך, כפי שנעשה בעת ההכנה לאיסוף מח עצם. לאחר מכן, מששו את פסגות הפיקה והשוק מתחת לעור כדי לזהות את המפרק הסינוביאלי, והכניסו מזרק של שלושה מיליליטר עם מחט בגודל 23, בדיוק לתוך המפרק.
בעזרת שאיבה עדינה, מחלצים בין 1/2 למיליליטר נוזלים, ומושכים מיד את המחט. אם נפח הנוזל הסינוביאלי קטן מדי, יש לשטוף את החלל עם DPBS כדי לאסוף נוזל סינוביאלי עם DPBS. נפח ה-DPBS לשימוש משתנה בהתאם לגודל החלל הסינוביאלי.
הנפח האופטימלי של הנוזל הסינוביאלי מוגבל במפרק בריא. הנפח משתנה בהתאם לגודל ולמצב הפתולוגי של המפרק שלו. כדי לבודד את התאים מהנוזל הסינוביאלי, יש לדלל את הנוזל בנפח שווה של DPBS בצינור חרוטי של 15 מיליליטר בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, אנו מזיזים את הפסולת על ידי סינון הדילול דרך מסננת תאי ניילון של 40 מיקרון. לאחר מכן, הוסף עוד עשרה מיליליטר DPBS, וצנטריפוגה את המתלה ב -400 גרם למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט ושטפו את התאים פעמיים, באמצעות DPBS.
אנו משעים את משטח התאים השטוף בשני מיליליטר ADMEM. לאחר מכן, המשיכו בתרבית התאים כפי שהודגם עם MSCs. MSCs בודדו בהצלחה ממח העצם ומהמפרקים הסינוביאלים המפרקיים של המיני-חזירים והורחבו במבחנה.
המורפולוגיה של MSCs שמקורם בנוזל סינוביאלי דומה לזו של MSCs שמקורם במח עצם: לשניהם צורת ציר פיברובלסטית והם נצמדים בצורה הומוגנית. ה-MSCs הראו ביטוי חיובי לצביעה אלקליין-פוספטאז לאחר השלמת תת-התרבית השלישית. לאחר מכן, נותחו סמני פני השטח בשתי התרבויות.
כצפוי, שני סוגי MSCs ביטאו באופן משמעותי CD29, CD44 ווימנטין. לעומת זאת, הביטוי של CD34 ו-CD45 היה שלילי ונמוך. תוצאות אלה היו זהות לאלו שהתקבלו באמצעות MSCs ייחודיים, כולל תאים שבודדו מהנוזל הסינוביאלי.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשאוב נוזל סינוביאלי ומח עצם באופן לא פולשני על מנת לבודד את ה-MSC שלהם ממיני-חזירים וכיצד לבצע את ההשוואה והפנוטיפ של MSC זה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לאתר את נקודת המטרה על פסגת הכסל והסינוביאל, שנקבעה על ידי מישוש זהיר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו במודלים של דלקת מפרקים ניוונית או דלקת מפרקים שגרונית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם לא רק מ-MSC של מח העצם אלא גם ל-MSCs של נוזל סינוביאלי יש יכולת זהה להתחלת סחוס או עצם ודיכוי חיסוני.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו קידמה טיפול אוטולוגי במחלות מפרקים על ידי סיוע באפיון MSCs שמקורם במפרק מותקף או דלקתי בחולי דלקת פרקים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לאיסוף לא פולשני של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) מנוזל הסינוביה ומוך העצם של חזירים מיניאטוריים. המחקר מדגיש את החשיבות של אפיון התאים הללו ליישומים ברפואה רגנרטיבית ואימונומודולציה.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- רפואה רגנרטיבית
- מחקר תאי גזע
- אימונומודולציה
רקע
- לתאי גזע מזנכימליים (MSCs) יש פוטנציאל יישומים טיפוליים.
- חזירים מיניאטוריים משמשים מודל חשוב לחקר מחלות אנושיות.
- תאי MSCs שמקורם בנוזל סינוביה עשויים להיות שונים מתאי MSCs שמקורם במוך העצם.
- הבנת ההבדלים הללו יכולה לשפר אסטרטגיות טיפול במחלות מפרקים.
מטרת המחקר
- לבסס שיטה לא פולשנית לאיסוף תאי MSCs מחזירים מיניאטוריים.
- להשוות את המאפיינים של תאי MSCs שמקורם בנוזל סינוביה ומוך העצם.
- לחקור את ההשלכות על טיפולים במחלות מפרקים ומחקר אוטואימוני.
שיטות ששימשו
- איסוף לא פולשני של נוזל סינוביה ומוך עצם באמצעות שאיבה עם מזרק.
- בידוד וטיפוח תאי MSCs in vitro.
- פנוטיפ של תאים שבוצע באמצעות ציטומטריית זרימה.
- השוואה של מאפייני תאי MSCs ממקורות שונים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של תאי MSCs מנוזל סינוביה ומוך עצם.
- אפיון של תאי MSCs הראה מאפיינים שונים בהתאם למקורם.
- הממצאים תומכים בפוטנציאל של תאי MSCs לטיפול במחלות מפרקים.
- התובנות שהושגו עשויות להודיע על מחקרים עתידיים על מחלות אוטואימוניות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה אמינה לאיסוף תאי MSCs מחזירים מיניאטוריים.
- אפיון של תאי MSCs ממקורות שונים חיוני ליישומים טיפוליים.
- מחקר זה תורם להבנת תאי MSCs ברפואה רגנרטיבית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Non-invasive isolation and phenotyping of mesenchymal stem cells (MSCs) from minipig synovial fluid and bone marrow enables robust comparative analysis of cell sources for regenerative and immunomodulatory research. This workflow supports early-stage target validation and de-risks translational studies by providing standardized, reproducible MSC populations for downstream applications. The approach enhances predictive confidence in preclinical model selection and portfolio advancement for cell-based therapies targeting joint and autoimmune diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct comparison of MSCs from distinct tissue sources for functional target validation.
- Supports biological de-risking by confirming phenotypic equivalence of synovial and marrow-derived MSCs.
- Facilitates hypothesis testing on MSC immunomodulatory and regenerative properties.
- Provides a foundation for mechanistic studies in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Delivers validated MSC populations for assay standardization and reproducibility.
- Enables quantitative flow cytometry-based phenotyping for robust screening outputs.
- Supports preparation of scalable, homogeneous cell systems for compound evaluation.
- Improves readiness for high-content screening and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Aligns MSC sourcing with disease-relevant preclinical models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement of autologous cell therapy candidates.
- Supports biomarker alignment through surface marker analysis and functional assays.
- De-risks preclinical studies by confirming cell identity and comparability across sources.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying standardized MSCs for target validation, assay development, and translational research in joint and autoimmune disease models.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and pathway clarification using well-characterized MSCs.
- Screening: Enables reproducible, quantitative phenotyping for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers flow cytometry-based surface marker data for comparative analysis of cell populations.
- Translational Research: Supports continuity from early discovery through preclinical validation in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for MSC isolation and characterization across multiple studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in MSC-based research.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and phenotyping for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in cell therapy pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of MSC-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue handling and flow cytometry analysis.
- Needs access to centrifugation, cell culture, and analytical instrumentation.
- Demands cross-team standardization of isolation and phenotyping protocols.
- Adaptable to various preclinical models with attention to joint size and fluid volume.
- Limited by synovial fluid availability in healthy versus diseased joints.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:39
Collecting Bone Marrow from Minipigs
2:47
Isolation of Cells and In Vitro Cultivation
4:42
In Vitro Cultivation of Cells Isolated from Bone Marrow
6:18
Collecting Synovial Fluid and Cultivating Isolated Cells
8:19
Results: Bone Marrow- and Synovial Fluid-derived MSC Morphology and Cell Surface Marker Expression
9:23
Conclusion
