בידוד נייד phenotyping של בתאי גזע mesenchymal נגזר הסינוביאלי נוזל מח עצם של Minipigs

המטרה הכללית של הליך זה היא איסוף לא פולשני של נוזל סינוביאלי ומחולק גרעמי מחזירי מיני-חזיר, כדי לאסוף תאי גזע מזנכימליים לשימוש במחקרי רגנרציה ואימונומודולציה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הטיפול ב-MSC לאוטולוגים, כגון כיצד לבסס את הנוזל הסינוביאלי ב-MSC, וכיצד לאפיין אותם בהשוואה ל-MSC ממחולק גרעמי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא ביסוס יעיל של התכונות המרכזיות של MSCs המופקים מנוזל סינוביאלי וממחולק גרעמי של מיני-חזירים, דבר שיהיה שימושי ליישום בחולים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במגוון מחלות מפרקים, כיוון שאוכלוסיית ה-MSC המופקת מנוזל הסינוביה בחלל הסינוביאלי גדולה משמעותית אצל מטופלים ספורטאים. אף על פי ששיטה זו יכולה לספק תובנות בתחום הרפואה הרגנרטיבית, ניתן ליישמה גם במחקרים אחרים, כגון מחקר של מחלות אוטואימוניות. מכיוון ש-MSCs של חזירי מיני (minipig) הם אוטולוגיים, דיכוי חיסוני עשוי לעורר עניין בבני אדם.

בנוסף למדענים האחרים, את הפרוצדורה ידגמימו Hyeon-Jeong Lee ו-Won-Jae Lee מהשלב השלישי שלי. תחילה, מקמו חזיר מיניאטורי מורדם כך שניתן יהיה לגשת לרכס הכסל (iliac crest). לאחר מכן, הסירו שיער מאזור של 15 סמ"ר על רכס הכסל, באמצעות סכין גילוח או מכונת גילוח.

לאחר מכן, קרצפו לסירוגין את העור החשוף שלוש פעמים עם povidone-iodine ו-70% ethanol. לאחר ייבוש מלא, הניחו סדיני סטריליים. כעת, צפו מראש מזרק של ten-milliliter עם heparin, באמצעות שטיפה של three-to four-milliliter.

פעולה זו תמנע את קרישת מחית העצם בזמן חילוצה. לאחר מכן, בנקודת רכס עצם האיליאק (iliac bone crest) בדיוק, חבר בחוזקה מחלץ מחית עצם למזרק מצופה בהפרין, וחלץ לפחות five milliliters של מחית עצם. כדי לבודד את התאים ממחית העצם שחולצה, ראשית דלל אותה עם נפח שווה של DPBS בשפופרת קונית של 15-milliliter בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, העבירו שלושה מיליליטרים של מדיום לצנטריפוגת דחיסות לשפופרת קונית שנייה בנפח 15 מיליליטר. לאחר מכן, העבירו בזהירות ארבעה מיליליטרים של מחית העצם המדוללת על גבי המדיום לצנטריפוגת הדחיסות כדי ליצור שתי שכבות של תמיסות. כעת, סובבו את השפופרת בצנטריפוגה ב-400 Gs למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.

ה-MNCs הרצויים נאספים בשכבה הלבנה המרכזית. שאבו רק את השכבה זו. העבירו את שכבת ה-MNC למבחנה קונית בנפח 15 מיליליטר, ודללו אותה עם שבעה עד שמונה מיליליטר של DPBS.

לאחר מכן, סובב את התאים בצנטריפוגה ב-500 Gs למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר. השלך את הסופרנאט, ושטוף את התאים המשקעים פעמיים בעזרת ten milliliters של DPBS, תוך חזרה על מחזור הצנטריפוגה הקודם. לאחר שתי השטיפות, נשעה את ה-MNCs בשני milliliters של ADMEM.

לאחר מכן, העבירו את התאים לצַלחת תרבית רקמה בקוטר 35 מילימטר, והדגירו אותם בטמפרטורה של 38.5 °C באינקובטור לח עם 5% carbon dioxide. לאחר 48 שעות, שאבו את המצע יחד עם ה-MNCs שלא נצמדו. לאחר מכן, הוסיפו בחזרה 2 mL של ADMEM רענן, והמשיכו בדגירה, תוך החלפת המצע מדי שלושה ימים.

כאשר התאים מגיעים ל-70 עד 80% confluency, שטפו את התרבית ב-DPBS טרי. לאחר מכן,נתקו את התאים באמצעות מיליליטר אחד של 0.25%Trypsin-EDTA למשך שלוש עד חמש דקות ב-37 °C. אספו את התאים בעשרה מיליליטר של ADMEM, והעבירו אותם למבחנה קונית של 15 מיליליטר.

לאחר מכן, סובבו את התאים ב-300 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, והשליכו את הנוזל העליון. כעת, השעו את ה-MNCs שנאספו ב-1 ml של ADMEM טרי, ומדדו את צפיפותם. סיימו בפריסה של בין 500,000 ל-750,000 תאים לתוך בקבוקי T25 עם 4 ml של ADMEM.

דגרו את הבקרוחים בדומה לצלחות, והחליפו את המצע מדי שלושה ימים. הכינו אזור עור של 15x10 סנטימטר מעל מפרק הירך, כפי שנעשה בעת ההכנה לאיסוף מחול לשדרה. לאחר מכן, בצעו מישוש של הפיקה ורכבי השוקמת מתחת לעור כדי לזהות את המפרק הסינוביאלי, והחדירו מזרק של שלושה מיליליטר עם מחט בקוטר 23-gauge, בדיוק לתוך המפרק.

בעזרת שאיבה עדינה, הוצא בין 1/2 למילליליטר אחד של נוזל, ושלוף מיד את המחט. אם נפח הנוזל הסינוביאלי קטן מדי, שטוף את החלל בעזרת DPBS כדי לאסוף נוזל סינוביאלי עם DPBS. נפח ה-DPBS שיש להשתמש בו משתנה בהתאם לגודל החלל הסינוביאלי.

הנפח האופטימלי של נוזל סינוביאלי מוגבל במפרק בריא. הנפח משתנה בהתאם לגודל המפרק ולמצבו הפתולוגי. כדי לבודד את התאים מתוך הנוזל הסינוביאלי, יש לדלל את הנוזל עם נפח שווה של DPBS בתוך מבחנה קונית של 15-milliliter בטמפרטורת החדר.

בשלב הבא, נסיר את השאריות על ידי סינון של הדילול דרך מסננת תאים מניילון בנקבוביות של 40 מיקרון. לאחר מכן, נוסיף עשרה מיליליטרים נוספים של DPBS, ונרכז את התרחף באמצעות צנטריפוגה ב-400 Gs למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, נשפוך את על-משקע התרחיף ונשטוף את התאים פעמיים, באמצעות DPBS.

אנו מרחפים את משקע התאים השטוף בשני מיליליטר של ADMEM. לאחר מכן, ממשיכים בגידול התאים כפי שהודגם עם ה-MSCs. תאי MSCs בודדו בהצלחה ממוך העצם וממפרקים סינוביאליים של חזירי מיני-פיג והורחבו in vitro.

המורפולוגיה של תאי MSC המופקים מנוזל סינוביאלי דומה לזו של תאי MSC המופקים ממח עצם: לשניהם צורה כישכית פיברובלסטית והם נצמדים באופן הומוגני. תאי ה-MSC הראו ביטוי חיובי לצביעת alkaline-phosphatase לאחר השלמת התת-תרבית השלישית. לאחר מכן, נותחו סממנים שטח בשתי התרביות.

כצפוי, שני סוגי ה-MSCs הביעו באופן משמעותי CD29, CD44 ו-Vimentin. לעומת זאת, הביטוי של CD34 ו-CD45 היה שלילי ונמוך. תוצאות אלו היו זהות לאלו שהתקבלו באמצעות MSCs שונים, כולל תאים שבודדו מנוזל סינוביאלי.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לשאוב באופן לא פולשני נוזל סינוביאלי ומח עצם לצורך בידוד MSC מהם במיני-חזירים, וכיצד לבצע השוואה ואפיון (phenotyping) של MSC אלו. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לאתר את נקודת היעד על רכס הכסל (iliac crest) ובמפרק הסינוביאלי, שנקבעה באמצעות מישוש מדויק. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון במודלים של אוסטאו ארתריטיס או דלקת מפרקים שיגרומית (rheumatoid arthritis), כדי לענות על שאלות נוספות, כמו האם לא רק MSC ממח עצם אלא גם MSC מנוזל סינוביאלי בעים יכולת דומה ליצירת סחוס או עצם ולדיכוי חיסוני.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו קידמה את הטיפול האוטולוגי במחלות מפרקים על ידי סיוע באפיון של MSCs המופקים ממפרק תקיף או דלקתי אצל חולי דלקת מפרקים.