Name: דוגמנות Myotonic ניוון 1 בתאים C2C12 myoblast (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: חקור מודלים תאיים של ניוון שרירים מיוטוני 1 בקווי C2C12 myoblast באמצעות שיטות טרנספקציה וטרנסדוקציה ויראלית. הפרוטוקול מאפשר חקר מנגנוני מחלה גנטיים ופתוגנזה של M1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר טום קופר ממכללת ביילור לרפואה, למאני ס. מהדבן מאוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון ולדידייה טרונו מאוניברסיטת ז'נבה על הריאגנטים. עבודה זו נתמכת על ידי קרן סטארט-אפ של אוניברסיטת יוסטון (YL), מענק של איגוד הלב האמריקאי (YL, 11SDG5260033) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (XP, 81460047).

1. תרבית תאי C2C12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור myoblasts העכבר C2C12 בצלחת 100 מ&quot;מ במדיום הגידול (המדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM)) בתוספת 20% בסרום שור עוברית, 100 פניצילין U / ml, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, ו -2 מ&quot;מ L- גלוטמין. אפשר תאי passaged C2C12 להיות כ 50 - 60% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את מדיום הגידול ולשטוף תאים C2C12 עם 3 מ&quot;ל בטמפרטורת החדר פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). הסר את PBS ולהוסיף 500 μl 0.25% טריפסין- EDTA כדי לנתק את התאים. מניחים את צלחת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 3 - 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את טריפסין על ידי הוספת מדיום הגידול 3 מ&quot;ל. פיפטה 6 - 8 פעמים כדי להשעות את התאים. הוסף 1 מ&quot;ל של תאים מושעה לצלחת 100 מ&quot;מ חדש לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 2. Transfection Cell C2C12 / התמרה בחירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transfection פלסמיד C2C12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לפני transfection, עמ &#39;7.0 מאוחר x 10 5 C2C12 תאים לתוך אחד טוב של צלחת שש היטב עבור כל transfection. הערה: זה מוביל 50 - 60% מפגש ידי בזמן transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מגיב transfection כדי להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד (GFP-CUG5 או GFP-CUG200) לתוך 200 μl מחומם מראש בינוני חופשי בסרום ו מערבולת בקצרה. הוסף מגיב transfection 6 μl למדיום ומערבבים מיד למשך 30 שניות בעזרת מערבולת. דגירה את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את התקשורת של תאי C2C12 2.5 מ&quot;ל מדיה סרום ללא צמיחה. מוסיפים את תערובת transfection לתאים לאחר דגירה. החזר את הצלחות על 5% CO 2, 37 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התאים ב תערובת transfection / מדיה סרום ללא צמיחה עבור 4 שעות או עד הלילה. שינוי תקשורת חזרה תקשורת הצמיחה למחרת או כאשר cytotoxicity ניכר. הערה: Cytotoxicity נבחנת על ידי בדיקה מיקרוסקופית של ceLLS. בוחן את שינויי מורפולוגיה תאי ניתוק תא. כל עוד אין cytotoxicity גלויה, דגירה לילה במדיה סרום ללא צמיחה משפרת transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התאים 48 שעות לאחר transfection ידי הוספת 1.2 - G418 1.6 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​עבור ~ 10 ימים עד שהתרבות מלאה (טרנספקציה ללא פלסמידים) אין תאים חיים. שנה את התקשורת כל יומיים עם התקשורת צמיחה בתוספת G418. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התאים G418 עמידים במדיום הגידול ו 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך הניסויים הבאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת רטרו-וירוס תמרת retroviral C2C12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני תרבות HEK 293 על ידי השלמת גלוקוז DMEM גבוהה עם 10% בסרום שור עוברית, 100 U / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, ו -2 מ&quot;מ L- גלוטמין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 24 שעות לפני transfection, צלחת 4.0 x 10 6 ecotropic HEK תאי אריזת 293 מבוססים בבית (מפגש 80% ב transfection) 100 מ&quot;מ צלחת גתרבית תאים בינוני ontaining. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מגיב transfection כדי להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 15 מיקרוגרם DNA פלסמיד (pMSCV-Puro או pMSCV-Celf1Flag-Puro) ב 1 בינוני מ&quot;ל סרום ללא צמיחה. בקצרה וורטקס. הוסף 30 מגיבים transfection μl משלבים 2.2.2 לתוך צינור מדיום גידול DNA / סרום ללא, ומערבבים בעזרת מערבולת היטב. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף dropwise תערובת transfection אל HEK ecotropic מבוסס 293 תאי האריזה. מערבולת בעדינות את הצלחות ולהחזיר אותם בחזרה 5% CO 2, 37 ° C חממה. לאחר 24 שעות, לשנות את התקשורת עד 10 מיליליטר מחומם מראש מדיום גידול טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר supernatant (המכיל רטרו-וירוס) 48 שעות לאחר transfection בעזרת פיפטה ולהעביר את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל. הוסף 10 מיליליטר של תקשורת החמה החדשה לצלחת ולהחזיר אותו אל האינקובטור. שמור את supernatant על 4 מעלות צלזיוס. הערה: התקשורת מתווספת בעדינות כדי לאהוא בצד של הבאר כדי לא לשבש את monolayer התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את המנה השנייה של supernatant 60 שעות לאחר transfection וברכה זה עם supernatant מ 2.2.5. צנטריפוגה ב 500 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל חדש. השתמש רטרו-וירוס כדי transduce תאים C2C12 בשלב זה על ידי שתמשיך לשלב 2.2.9 או aliquot ולאחסן את supernatant ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה רטרו-וירוס מ 2.2.7 בטמפרטורת החדר, אם מניה קפוא משמש כאן. הערה: הימנע להקפיא להפשיר מחזורים מרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי C2C12 באותו היום של התמרה המכוונת במשך 30 - 40% של מפגש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את מדיום הגידול ולשטוף תאים C2C12 עם 3 מ&quot;ל בטמפרטורת החדר PBS. הסר את PBS, להוסיף 500 μl 0.25% טריפסין- EDTA, דגירה צלחת 2 באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO עבור 3 - 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 3 מ&quot;ל med צמיחהium. פיפטה 6 - 8 פעמים כדי להשעות את התאים. ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולהוסיף 8.0 x 10 5 C2C12 תאים לצלחת 60 מ&quot;מ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל רטרו-וירוס להדביק צלחת אחת 60 מ&quot;מ של תאים בתקשורת צמיחה 3 מ&quot;ל. מחזירים את הצלחת אל האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף עם 3 מ&quot;ל התקשורת טריים בתוספת אנטיביוטיקה הבחירה (puromycin 1 - 3 מיקרוגרם / מ&quot;ל) 48 שעות לאחר ההדבקה. החלף 3 מ&quot;ל בינוני עם אנטיביוטיקה כל יום במשך ~ 5 ימים עד שהתרבות מלאה C2C12 untransduced גוועת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Lentivirus ו התמר lentiviral C2C12 הערה: בצע את כל ההליכים הקשורים lentivirus ב בטיחות ביולוגית רמה 2 ארון ולפעול בהתאם להנחיות בטיחות ביולוגיות. פסולת נוזלית בעלת הנגיף יש לחטא לפני סילוק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 4.0 x 10 6 293T תאים בצלחת 100 מ&quot;מ (~ 80 מפגש% ביום של transfection) עם תרבית תאים בינוניים HEK 293 (גלוקוז DMEM גבוהה, בתוספת 10% עובריתבסרום שור, 100 U / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, ו -2 מ&quot;מ L- גלוטמין) 24 שעות לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ לחמם את מגיב transfection לטמפרטורת החדר. מערבבים את וקטורים אריזה lentiviral (4 מיקרוגרם pMD2.G ו -6 מיקרוגרם psPAX2) יחד עם וקטור העברת 8 מיקרוגרם lentiviral (Celf1 shRNA או מקושקשות shRNA שליטה) ב 1 בינוני מ&quot;ל תרבית תאים חופשית בסרום. בקצרה וורטקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 36 μl מגיב transfection מחומם מראש ל הצינור DNA / DMEM ומערבבים היטב על ידי מערבולת. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאי 293T מן החממה ולהוסיף לתערובת transfection לצלחת. מערבולת בעדינות את הצלחת ולהחזיר אותו בחזרה 5% CO 2, 37 ° C חממה. לאחר 24 שעות, להחליף את תערובת transfection עם המדיום תרבות טרי 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את lentivirus supernatant המכיל 48 שעות לאחר transfection ולהעביר אותו לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל. הוסף 10 מדיה חמה חדשה מיליליטר לצלחת ולהחזירוחממה. אחסן את supernatant על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את המנה השנייה של supernatant 60 שעות לאחר transfection, ולשלב אותו עם supernatant מ 2.3.5. בקצרה צנטריפוגה ב 500 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant לתוך צינור 50 מ&quot;ל צנטריפוגות טריים. אם אתה משתמש וירוס טרי, המשך לשלב 2.3.9. לשימוש עתידי, חנות וירוס המכילים supernatant ב -20 מעלות צלזיוס aliquots של 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר מהווירוס 2.3.7 בטמפרטורת החדר לפני השימוש, אם מניה קפוא משמש. הערה: הימנע להקפיא להפשיר מחזורים מרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי C2C12-CUG200 (המתקבלים בסעיף 2.1) כמתואר 2.2.9 באותו היום של תמרה. הערה: כוון 30 - 40% של מפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל וירוס להדביק צלחת 60 מ&quot;מ של C2C12-CUG200 ולהחזיר את הצלחת אל האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מדיום התרבות עם תקשורת טריה בתוספת אנטיביוטיקת הבחירה (puromycin 1 - 3 מיקרוגרם / מיליליטר) 72 שעות לאחר תמרה.רענן היומיום תקשורת והתרבות עם אנטיביוטיקת הבחירה ~ 5 ימים עד שכל התרבות מלאת C2C12-CUG200 untransduced גוועת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש כתם מערבי לאמת מציאת Celf1 בתאי transfected GFP-CUG200. </li></ol></li></ol> 3. התמיינות תאים C2C12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 2 x 10 6 תאים אחד טוב של צלחת 6-היטב 2.5 מיליליטר תקשורת צמיחת 24 שעות לפני תחילת הבידול. הערה: צפיפות הציפוי עשויה להיות מותאמת כך מפגש מלא הוא הגיע ב -24 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים ומחוברות עם PBS ולהוסיף 2.5 מ&quot;ל של מדיום בידול נמוכה בסרום (בינוני של הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 2% נסיוב סוס, 100 U / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין ו -1 מיקרומטר אינסולין) . החלף את המדיום כל יומיים. הערה: שמור אינסולין המניות קפוא ולהוסיף אותו בתקשורת בכל שינוי בינוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך התמיינות C2C12, לאסוף דגימות עבור קוואןtitative RT-PCR (ראה סעיף 4) בנקודות הזמן הבאות: יום 0, 1, 2, 4, ו -6 תהליך ההתרבות עבור immunostaining ביום 6 - 8 (ראה סעיף 5). </li></ol> בידוד RNA 4. וכמותי RT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פרוטוקול של היצרן עבור בידוד RNA. לאחר בידוד, resuspend גלולה רנ&quot;א 30 מים μl RNase ללא ו pipet מעלה ומטה מספר פעמים. הערה: הדוגמות תהיינה רשאיות להמשיך כמוני RT-PCR או יכולות להיות מאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ערכת qPCR RT עבור כמותי RT-PCR 10 ובצע את ההוראות של היצרן. מכינים את תערובת התגובה על פי טבלה 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רְכִיב </td><td> נפח (μl) </td><td> ריכוז סופי </td></tr><tr><td> מאגר התגובה 2x </td><td> 10 </td><td> 1x </tד&gt; </tr><tr><td> פריימר קדימה </td><td> 0.5 </td><td> 200 ננומטר </td></tr><tr><td> פריימר הפוך </td><td> 0.5 </td><td> 200 ננומטר </td></tr><tr><td> בְּדִיקָה </td><td> 0.5 </td><td> 200 ננומטר </td></tr><tr><td> הפוך transcriptase &amp; RNase אינהיביטור </td><td> 0.1 </td><td> 0.25 U / ml </td></tr><tr><td> תבנית </td><td> 1 </td><td> 100 RNA סך ng </td></tr><tr><td> מים חינם RNase </td><td> 7.4 </td><td> NA </td></tr><tr><td> מערבבים סה&quot;כ </td><td> 20 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1. כמותי RT-PCR מיקס מאסטר הכנה <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תגובת 20 μl RT-qPCR באמצעות טבלה 2 פרופיל תרמית. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> צעד שעתוק הפוך </td><td> 30 דקות, 48 ° C </td></tr><tr><td> פולימר DNAאיון ASE הפעלה / הפוך transcriptase </td><td> 10 דקות, 95 ° C </td></tr><tr><td rowspan="2"> 40 מחזורים </td><td> 15 שניות, 95 ° C </td></tr><tr><td> 1 דק &#39;, 60 ° C </td></tr></tbody></table> טבלה 2. כמותי פרופיל תרמי RT-PCR 5. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התרבות monolayer ב 2.5 מ&quot;ל מוכן טרי 4% paraformaldehyde / PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize דגימות 2.5 מ&quot;ל 0.1% Triton X-100 / PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות בתא humidified. חסום את דגימות 2.5 מ&quot;ל חסימת חיץ (0.1% nonionic פעילי שטח / PBS, 10% נסיוב עז רגיל) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל חסימת חיץ ולהחיל 800 μl נוגדן ראשוני נגד שרשרת שרירן כבד מדולל חסימת חיץ (1: 100). מדגירים לילה בתא humidified בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 3 times (10 דקות כל אחד) עם חיץ 2.5 מ&quot;ל לשטוף (0.1% polysorbate 20 / PBS) ביום 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיץ לשטוף ולהחיל 800 נוגדנים משני μl (IgG אנטי העכבר העז, 1: 500 בדילול מלא PBS). דגירה בתא humidified בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים (10 דקות כל אחד) עם חיץ לשטוף 2.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם 800 μl DAPI (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל, בדילול מלא O H 2 deionized מזוקקים) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חיץ 2.5 מ&quot;ל לשטוף שוב למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את חיץ כביסה 2.5 מ&quot;ל PBS ולהשתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי ללכוד תמונות. </li></ol>

<ol><li>Harper, P. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarper%2C+PS+%22Myotonic+dystrophy.+3rd+edn%22">Myotonic dystrophy. 3rd edn</a>. , W. B. Saunders. (2001).</li>
<li>Timchenko, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+muscle+atrophy+in+myotonic+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).</li>
<li>Brook, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+myotonic+dystrophy%3A+expansion+of+a+trinucleotide+%28CTG%29+repeat+at+the+3%27+end+of+a+transcript+encoding+a+protein+kinase+family+member%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member.</a> Cell. 68 (4), 799-808 (1992).</li>
<li>Chau, A., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+insights+into+the+pathology+of+and+therapeutic+strategies+for+DM1%3A+Back+to+the+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Developmental insights into the pathology of and therapeutic strategies for DM1: Back to the basics.</a> Dev Dyn. 244 (3), 377-390 (2015).</li>
<li>Ho, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscleblind+proteins+regulate+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Muscleblind proteins regulate alternative splicing.</a> EMBO J. 23 (15), 3103-3112 (2004).</li>
<li>Kuyumcu-Martinez, N. M., Wang, G. S., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+steady-state+levels+of+CUGBP1+in+myotonic+dystrophy+1+are+due+to+PKC-mediated+hyperphosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Increased steady-state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC-mediated hyperphosphorylation.</a> Mol Cell. 28 (1), 68-78 (2007).</li>
<li>Kalsotra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mef2+transcription+network+is+disrupted+in+myotonic+dystrophy+heart+tissue%2C+dramatically+altering+miRNA+and+mRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Mef2 transcription network is disrupted in myotonic dystrophy heart tissue, dramatically altering miRNA and mRNA expression.</a> Cell Rep. 6 (2), 336-345 (2014).</li>
<li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li>
<li>Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+stable+heterocaryons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons.</a> Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).</li>
<li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celf1+regulates+cell+cycle+and+is+partially+responsible+for+defective+myoblast+differentiation+in+myotonic+dystrophy+RNA+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Celf1 regulates cell cycle and is partially responsible for defective myoblast differentiation in myotonic dystrophy RNA toxicity.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (7), 1490-1497 (2015).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myotonic+dystrophy+expanded+CUG+repeat+tract+is+necessary+but+not+sufficient+to+disrupt+C2C12+myoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The myotonic dystrophy expanded CUG repeat tract is necessary but not sufficient to disrupt C2C12 myoblast differentiation.</a> Hum Mol Genet. 10 (18), 1879-1887 (2001).</li>
<li>Amack, J. D., Paguio, A. P., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis+and+trans+effects+of+the+myotonic+dystrophy+%28DM%29+mutation+in+a+cell+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model.</a> Hum Mol Genet. 8 (11), 1975-1984 (1999).</li>
<li>Bhagavati, S., Shafiq, S. A., Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28CTG%29n+repeats+markedly+inhibit+differentiation+of+the+C2C12+myoblast+cell+line%3A+implications+for+congenital+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">(CTG)n repeats markedly inhibit differentiation of the C2C12 myoblast cell line: implications for congenital myotonic dystrophy.</a> Biochim Biophys Acta. 1453 (2), 221-229 (1999).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+defects+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic defects in myotonic dystrophy.</a> Dev Biol. 265 (2), 294-301 (2004).</li>
<li>Emerson, C. P., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEmerson%2C+CP+%22Methods+in+muscle+biology%22">Methods in muscle biology</a>. 52, Academic Press. (1997).</li>
<li>Ward, A. J., Rimer, M., Killian, J. M., Dowling, J. J., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUGBP1+overexpression+in+mouse+skeletal+muscle+reproduces+features+of+myotonic+dystrophy+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">CUGBP1 overexpression in mouse skeletal muscle reproduces features of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (18), 3614-3622 (2010).</li>
<li>Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart-specific+overexpression+of+CUGBP1+reproduces+functional+and+molecular+abnormalities+of+myotonic+dystrophy+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שורת תאים C2C12 נוצל בעבר כמודל ללמוד myogenesis 11-14. תאים אלה לשמור על המראה כמו-פיברובלסטים, להתרבות במהירות מדיה המכילה 20% בסרום שור העובר ולבדל בקלות מדיה המכילה 2% נסיוב סוס 15. הצמיחה וההתבדלות מהר הם מאפייני יתרון מודל תא myogenesis. הנה, אנחנו מדגימים את השימוש פלסמיד, retroviral, ו וקטורים lentiviral להציג cDNA, 3&#39;-UTR, ו shRNA לתאים C2C12. הנקודות הקריטיות עבור transfection / התמרה ותחזוקה של עקביות הבידול מודגשות מתחת. <p class="jove_con...

ניוון Myotonic (DM) הוא מחלה דומיננטית אוטוזומלית המשפיעה מערכות מרובות, בעיקר שרירי לב שלד 1. ישנם שני תת סוגים של המחלה הזאת, DM1 ו DM2. DM1 נפוץ יותר ויש לו ביטוי חמור יותר DM2 2. המוטציה הגנטית הבסיסית DM1 היא רחבה של חזרות שלישיית CUG הממוקמות באזור המתורגם &#39;3 (UTR) של גן החלבון קינאז DM (DMPK) 3. מספר חוזרי CUG אצל אנשים לא מעושה משתנה בין 5 ל 37. לעומת זאת, היא מגדילה ליותר מ -50, ולפעמים עד אלף בחולי DM1 4. כתוצאה מכך, חלבונים קושרי RNA, כגון muscleblind דמוי 1 (MBNL1), CUGBP, ו Elav-כמו משפחה 1 (Celf1), הם misregulated. בשל התפיסה על חזרות CUG המורחבות, MBNL1 מאבד את יכולתו לווסת שחבור חלופי 5. Celf1, ומצד שני, הוא למעלה מוסדר 6,7. התבטאות יתר של Celf1 קשורה לאובדן שרירחולשה, אשר אינן מיוחסות אובדן תפקוד MBNL1. במודלים של בעלי חיים לדמות שינויים הקשורים DM1, ובכלל זה, הרחבת DMPK 3&#39;-UTR CUG, אובדן MBNL1, ואת יתר של Celf1, הוקמו. עם זאת, דוגמנות DM1 ב myoblasts מציעה אלטרנטיבה יעילה, במיוחד עבור לנתח הקשורות DM1 אירועים תאיים ומולקולריים. C2C12 שורת תאי myoblast בודד לראשונה מ שריר עכבר C3H נפצע בשימוש נרחב ללמוד 8,9 בידול myogenic. תאי C2C12 להתרבות במהירות בסרום שור עובר (FBS) המכיל תקשורת לעבור התמיינות בקלות כאשר FBS ייגמר. עם זאת, באמצעות מודל בידול myoblast זה מציג שני אתגרים: תאי C2C12 הם בדרך כלל עמידים בפני transfection גן / תמרה ויראלית; ו שינויים קלים טיפול תא הליך בידול יכולים להוביל לשינויים חדים בהשקעות myotube. המעבדה שלנו באופן שגרתי משתמש myoblasts C2C12 כמו acell מודל פתח פרוטוקולים להעברת גנים ביעילות על ידי transfection פלסמיד, תמרת retroviral, תמרת lentiviral לתוך תא C2C12 קו 10. בסרטון, אנחנו מדגימים את הנהלים אופטימיזציה עבור transfecting / transducing C2C12 תאים ושמירה על עקביות בידול בהקמת מודלים myoblast DM1.

<table><tbody><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td>למדיום תרבית</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי - פרימיום</td><td>אטלנטה ביולוגית</td><td>S11150</td><td>למדיום תרבית</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (100x)</td> <td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>למדיום תרבית</td></tr><tr><td>אינסולין מלבלב בקר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>I6634-100MG</td><td>עבור סרום סוסים בינוני התמיינות</td></tr><tr><td></td><td>אטלנטה ביולוגית</td><td>S12150</td><td>עבור מדיום התמיינות</td></tr><tr><td>FuGENE&nbsp; מגיב טרנספקציה HD</td><td>Promega</td><td>E2311&nbsp;</td><td>עבור טרנספקציה</td></tr><tr><td>G418 סולפט&nbsp;</td><td>גולד ביוטכנולוגיה&nbsp;</td><td>G-418-10</td><td>לבחירה עמידה לתרופות</td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>sc-108071</td><td>לבחירה עמידה לתרופות</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris ג'ל חלבון, 1.0 מ"מ, 15 באר</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>עבור כתם מערבי</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP00061</td><td>עבור כתם מערבי</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS מאגר ריצה (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0002</td><td>עבור כתם מערבי</td></tr><tr><td>Amersham Protran נתמך 0.2 NC, 300 מ"מ x 4 מ'</td><td>GE בריאות מדעי החיים</td><td>10600015</td><td>עבור כתם מערבי</td></tr><tr><td>MF 20</td><td>בנק היברידומה התפתחותי</td><td>MF 20</td><td>Ab ראשוני לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני, טקסס אדום-X מצומד</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>T-862</td><td>משני Ab עבור צביעה חיסונית</td></tr><tr><td>צעד אחד qRT-PCR MasterMix</td><td>AnaSpec</td><td>05-QPRT-032X</td><td>עבור qRT-PCR</td></tr><tr><td>ריאגנט בידוד TriPure</td><td>Roche</td><td>11667165001</td><td>לבידוד RNA</td></tr><tr><td>נוגדן CUG-BP1 (3B1)</td> <td>סנטה קרוז</td><td>SC-20003</td><td>כתם ראשי Ab מערבי</td></tr><tr><td>נוגדן אקטין סנטה</td><td>קרוז</td><td>SC-1615</td><td>עז פוליקלונלי IgG לבקרת טעינה</td></tr><tr><td>293T Ecopack</td><td>Clontech</td><td>631507</td><td>תאים להכנת רטרו-וירוס</td></tr><tr><td>pMSCV-puro</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td>וקטור רטרו-ויראלי ריק להכנת רטרו-וירוס</td></tr><tr><td>pMSCV-Celf1Flag-puro</td><td>שנבנה בבית</td><td>לא זמין</td><td>קידוד וקטור רטרו-ויראלי Celf1Flag, המשמש להכנת רטרו-וירוס</td></tr><tr>מתנת<td>psPAX2</td><td>מדידייה טרונו</td><td>אינה זמינה</td><td>להכנת וירוס</td></tr><tr>מתנת <td>pMD2.G</td><td>מאת דידייה טרונו</td><td>אינה זמינה</td><td>להכנת וירוס הלנטי</td></tr><tr>מתנת<td>GFP-CUG5</td><td>מ- MS Mahadevan</td><td>אינה זמינה</td><td>פרטים בהפניה 10&nbsp;</td></tr><tr><td>GFP- מתנת CUG200</td><td>מ-M.S. Mahadevan</td><td>לא ניתן לקבל</td><td>פרטים בהפניה 10&nbsp;</td></tr><tr><td>טריטון&nbsp; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp; 20</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P9416</td><td>לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D9542</td><td>לצביעה חיסונית</td></tr></tbody></table>

דוגמנות myotonic ניוון 1 בתאים c2c12 myoblast

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Myotonic ניוון 1 (DM1) היא צורה נפוצה של ניוון שרירים. למרות במודלים של בעלי חיים כמה הוקמו DM1, מודלי תא myoblast הם עדיין חשובים משום שהם מציעים אלטרנטיבה הסלולר ביותר ללימוד אירועים תאיים ומולקולריים. למרות תאים myoblast C2C12 כבר בשימוש נרחב ללמוד myogenesis, עמידות transfection הגן, או התמרה ויראלית, מעכבת מחקר בתאי C2C12. כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה הכולל תחזוקה יומית, נהלי transfection התמר להציג גנים לתוך myoblasts C2C12 ואת האינדוקציה של בידול myocyte. ביחד, נהלים אלה לאפשר יעילות transfection / תמרה הטובות ביותר, כמו גם תוצאות בידול עקביות. הפרוטוקול המתואר בהקמת מודלי תא myoblast DM1 ירוויח לחקר ניוון myotonic, כמו גם מחלות שרירים אחרות.

תאי C2C12 היו transfected עם GFP-CUG5 או GFP-CUG200. לאחר בחירת התרופה-התנגדות, ברכות יציבות הוקמו, אשר ניתן דמיינו ידי ביטוי של GFP (איור 1 א). היווצרות Myotube ב myoblasts הבדיל זוהה על ידי שרירן שרשרת כבדה immunostaining 10 (איור 1 ב). כימות של היווצרות myotube הראו כי מדדי היתוך היו ירד מ 35.4 ± 4.1% ל -2.6 ± 1.1% ובאזורים myotube היו ירד מ 35.6 ± 2.2% ל -2.7 ± 0.8% על ידי הרחבת CUG חריגה GFP-CUG200 ...

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים בהקמת מודלי myoblast myotonic ניוון 1, כוללים תחזוקת תא מותאם C2C12, transfection גן / תמרה, והבחנת myocyte.

דוגמנות Myotonic ניוון 1 בתאים C2C12 myoblast

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

המטרה הכללית של נהלי התחזוקה, הטרנספקציה והטרנסדוקציה של המיובלאסטים היא לבסס מודל של תא בודד לדיסטרופיה מיוטונית לצורך חקר הדיסטרופיה המיוטונית ומחלות שרירים אחרות. שיטה זו יכולה לסייע בביסוס מודלים של תאי מיובלאסט M1 שיהיו שימושיים בחקירת המנגנון המפורט של הפתוגנזה של M1. מניפולציה גנטית רב-שכבתית זו של מיובלאסטים C2C12 מאפשרת מידול של אירועים פתולוגיים גנטיים ועוקבים ב-M1. 24 שעות לפני הטרנספקציה שלהם, זרעו 7×10⁵ תאי C2C12 לכל באער בלוח של 6 באערים.למחרת, הוסיפו 2 µg של ה-plasmid DNA הרצוי ל-200 µL של מצע ללא סרום בטמפרטורת החדר, וערבבו את התמיסה קצרות באמצעות vortex. לאחר מכן, הוסיפו 6 µL של ריאגנט טרנספקציה בטמפרטורת החדר למצע, וערבבו מיד את התמיסה ב-vortex למשך 30 שניות. לאחר מכן, דגרו את המצע בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.במהלך חמש הדקות האחרונות של האינקובציה, החליפו את המצע בכל באר ב-2.5 milliliters של מצע גידול רענן נטול סרום, והוסיפו 200 micro liters של תערובת טרנספקציה לכל באר. החזירו את הפלטה לאינקובטור תרביות התאים למשך ארבע שעות.לאחר מכן, בדקו את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לאתר שינויים במורפולוגיה ובאתחוף שלהם. אם נצפתה ציטוטוקסיות, החליפו את המצע נטול הסרום במצע גידול. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, הוסיפו את האנטיביוטיקה לברירה המתאימה במצע גידול טרי מדי יומיים למשך 10 ימים.ע

modeling-myotonic-dystrophy-1-in-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בתאי שריר בתרבית הם מודל לקוי לשחזר שרירים...

יחידת מנוע פונקציונלית בצלחת תרבות: עמית תרבות Explants חוט השדרה לתאי השריר

אמצעי לא פולשני להערכת ההצלחה של השתלה והיצמדות מתואר. השיטה מנצלת את גן כתב היתוך מאוחד המורכבים של גנים אשר ביטוי ניתן הדמיה בשיטות הדמיה שונות. הנה, אנחנו עושים שימוש...

מולקולרית והדמיה ליעד בתאים שריר מושתלים

פרוטוקול זה מתאר טכניקות לבידוד תאים חיים ותרבית ראשונית של קווי תאים מיוגניים ופיברובלסטים מרקמת שריר או עור.  מתוארת גם טכניקה לאמורטליזציה של קווי תאים אלה.  בסך הכל, פרוטוקולים אלה מספקים כלי אמין ליצירה ושימור של תאים שמקורם בחולה עבור יישומים במורד הזרם.

בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

פרוטוקול זה משתמש באלקטרופורציה כדי להציג ולבטא חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית בסיבי שריר עכברים. לאחר ההתאוששות לאחר אלקטרופורציה, הסיבים מבודדים. לאחר מכן מדמים סיבים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה כדי להמחיש את מבנה השרירים.

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

תאי שריר הם בין התאים האיקריוטיים המורכבים ביותר. אנו מציגים פרוטוקול להתמיינות חוץ גופית של סיבי שריר בוגרים מאוד המאפשר מניפולציה גנטית והדמיה ברורה בכל שלבי ההתפתחות.

במבחנת הבידול של בוגרות Myofibers עבור הדמיה חיה

מטרת טכניקה זו היא להכין תרבות מועשר של ראשי motoneurons (MNs) של חוט השדרה מאתר. כדי להעריך את ההשלכות של מוטציות גורמות למחלות MN, נתאר כאן ניתוקה של אלה מבודדים MNs של תרביות תאים שלהם על-ידי magnetofection.

מידול שארקו-מארי-טות במבחנה על-ידי Transfecting Motoneurons ראשי העכבר

אנו מספקים פרוטוקול כדי להפיל גנים מטריקס קידוד מטריצות (ECM) חלבונים ב C2C12 myoblasts באמצעות סיכת ראש קטן (sh) RNA. פילוח ADAMTSL2 כדוגמה, אנו מתארים את השיטות לאימות היעילות של הנוק-אין, חלבון, ורמת הסלולר במהלך C2C12 myoblast כדי לאפשר בידול צינור.

יציבה מנוק של גנים הקידוד מיקתאי מטריקס חלבונים ב C2C12 Myאובלסט התא באמצעות סיכת ראש קטן (sh) RNA

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור מודל יעיל של שריר ניוון שרירים Duchenne באמצעות MYOD1-המרה בתאי השתן כדי להעריך את השיקום של mrna הדיסטרופין ואת רמות החלבון לאחר דילוג קפיצה.

Exon דילוג ישירות מיותצינורות שהתקבלו מתאי שתן אנושיים

כאן, אנו מציעים שיטה ביעילות להשיג סיבי שריר בודד בשלב מוקדם לאחר לידה התפתחותית מ homozygous מוטציה Lamin δ 8-11 מודל העכבר, מודל חמור מאוד עבור השרירים נייל-דרייפוס ניוון שרירים (edmd).

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

פרוטוקול זה מתאר את ההמרה של פיברובלסטים בעור לתוך myoblasts ואת הבידול שלהם myotubes. קווי התאים נגזרים מחולים עם הפרעות נוירומוסקולריות וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מנגנונים פתולוגיים ולבדוק אסטרטגיות טיפוליות.

תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות

אנו מתארים מערכת הדמיה ניתנת לשחזור, אוטומטית ובלתי משוחדת לאפיון תפקוד צומת נוירומוסקולרי באמצעות רקמת שרירי שלד מהונדסת אנושית ומוטונורונים אופטוגנטיים. מערכת זו מאפשרת כימות תפקודי של קישוריות עצבית-שרירית לאורך זמן ומזהה ירידה בתפקוד העצבי-שרירי הנגרמת על ידי נוירוטוקסינים וסרום המטופלים myasthenia gravis.

הנדסה ואפיון של מודל אופטוגנטי של הצומת העצבי-שרירי האנושי

חקור מודלים תאיים של ניוון שרירים מיוטוני 1 בקווי C2C12 myoblast באמצעות שיטות טרנספקציה וטרנסדוקציה ויראלית. הפרוטוקול מאפשר חקר מנגנוני מחלה גנטיים ופתוגנזה של M1.

דוגמנות Myotonic ניוון 1 בתאים C2C12 myoblast

גלה סרטונים נוספים