גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לשפר את יישור האקסונים והמיאלינציה של נוירוני גנגליון שורש הגב באמצעות מערכת תרבית תאים סטטית ומתוחה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום הנדסת רקמות העצב, כגון יישור אקסונים וצמיחת עובי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ששיטה מתוחה מראש זו לא רק משפרת את יישור האקסונים אלא גם מקדמת מיאלינציה.

כדי להתחיל בהליך זה, שפכו את תערובת הבסיס וחומר הריפוי לכלי תרבית רקמות. שמור את תערובת הג'ל בוואקום למשך 20 דקות כדי להסיר בועות אוויר. לאחר מכן מכניסים את תערובת הג'ל לתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס לריפוי לילה.

לאחר שקרום ה-PDMS נרפא, טפל במשטח עם פלזמת חמצן במערכת הניקוי והתחריט של הפלזמה למשך שלוש דקות. לאחר מכן, חותכים חתיכת קרום מלבני מהצלחת. תקן אותו על מסגרת מתיחה כשהצד המטופל בחמצן פונה כלפי מעלה.

לאחר מכן הניחו את המסגרת על במת מתיחה ומתחו אותה באופן שווה על ידי סיבוב הכפתור על הבמה עד שהיא מגיעה להתארכות של 10% בציר הארוך יותר. לאחר מכן, תקן את המתיחה על ידי הידוק הברגים על המסגרת. לאחר מכן, הסר את המסגרת מהבמה.

ודא שמשטח הממברנה יבש וללא אבק לפני הנחת תא סיליקון על הממברנה. אפשר לצד הדביק של החדר להיצמד בחוזקה לקרום. ואז לעקר את המשטח עם UV למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של PLL למשטח ה-PDMS בתא תוך שש שעות מטיפול בפלזמה. לאחר מכן, דגרו אותו במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני שתזרעו את נוירוני ה-DRG כדי לשפר את החיבור לתאים. בשלב זה, הכינו את מצע הגידול הסטנדרטי עבור תאי העצב של DRG.

לפני הבידוד, יש לבצע חיטוי של ציוד הבידוד ולסנן ריאגנטים. הוסף חמישה מיליליטר של מאגר בידוד לבאר אחת של צלחת של שש בארות והניח את הצלחת על קרח. לאחר מכן הכינו 10 מיליליטר של מדיום דיסוציאציה על ידי הוספת מיליליטר אחד של קולגנאז A לתשעה מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA.

מסננים את התמיסה בעזרת פילטר של 0.22 מיקרומטר ומניחים אותה על קרח. לאחר מכן, הקריבו 10 עד 12 חולדות SD בנות חמישה עד שבעה ימים וחתכו את העור המכסה את חוט השדרה מגב כל אחת מהן. הסר את כל הרקמות העודפות סביב עמוד השדרה.

תחת זכוכית מגדלת כירורגית, בצע את החתך הראשון מהצוואר ואז בצע חתך אחד לאורך עמוד השדרה משני הצדדים בעזרת מספריים. נתק את עמוד השדרה מגוף הגור והסר עודפי שרירים. לאחר מכן חותכים לאורך הציר הארוך של עמוד השדרה ומשתמשים בפינצטה כדי לפתוח את עמוד השדרה לחלוטין כדי לחלץ את חוט השדרה.

לאחר מכן, הסר את הגנגליון מכיס העצם. חתוך את שורשי העצבים והעביר את הגרעינים למאגר הבידוד הקר כקרח. אסוף כ-10 עד 16 DRG משני הצדדים.

חזור על הליך הנתיחה עבור שאר הגורים. כעת, העבירו את ה-DRGs עם מאגר בידוד לתוך צינור סטרילי של 15 מיליליטר. הניחו לרקמה להתיישב בתחתית הצינור והסירו בעדינות את מאגר הבידוד מלמעלה.

לאחר מכן הוסף 10 מיליליטר של מדיום דיסוציאציה לצינור. דגרו את הרקמות המנותחות במדיום הדיסוציאציה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה תוך ניעור הצינור כל חמש עד 10 דקות. לאחר הדיסוציאציה הכימית, צנטריפוגה את הגרעינים בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר חמש דקות, הסר את הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה ב -10 מיליליטר של מדיום גידול סטנדרטי ומערבל אותו. לאחר מכן, צנטריפוגה שוב את התאים המנותקים. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה ב -12 מיליליטר של מדיום גידול סטנדרטי ומערבל אותו.

לפני זריעת התאים, הסר את תמיסת ה- PLL מהתא. שטפו את משטח ה-PDMS במים סטריליים וייבשו אותו באוויר. לאחר השעיית התאים, הניחו לתרחיף לשבת למשך דקה עד שתיים כדי לאפשר לפסולת להתיישב בתחתית הצינור.

לאחר מכן, הוסף 1.5 מיליליטר של תרחיף תאים לכל תא מתוח ודגר אותו ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. כדי לחסל תאי גליה ביום אחד במבחנה, הוסף 10 מיקרוליטר או 15 מיקרוליטר מתמיסת מלאי תערובת FDU-U לכל באר. לאחר שבע שעות, החלף מדיום זה במדיום גידול סטנדרטי טרי והנח את מכשיר התרבית המתוח מראש באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2.

במהלך תקופת תרבית התאים, החלף את המדיום כל יומיים על ידי החלפת מחצית מהמדיום המושקע במדיום טרי. בהליך זה, הסר את מדיום התרבית מתאי שוואן והוסף חמישה מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA לבקבוק. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 למשך שתיים-שלוש דקות.

בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ האופטי באמצעות מטרה פי 10 כדי לראות אם הם מתרוממים מהבקבוק. לאחר מכן מוסיפים חמישה מיליליטר של מדיום תרבית לתאים בבקבוק ומערבבים. לאחר מכן, הוסף את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר וצנטריפוגה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר מכן הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה בשבעה מיליליטר של מדיום גידול DRG סטנדרטי. לאחר מכן, העבירו 10 מיקרוליטר של תרחיף התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר. מערבבים אותו עם 10 מיקרוליטר של טריפן כחול ואז סופרים את מספר התא עם המוציטומטר באמצעות מטרה פי 10.

הוסף את מדיום הגידול DRG כדי לדלל את תרחיף התאים ל-5,000 תאים למיליליטר. לאחר מכן, הסר 0.5 מיליליטר מהמדיום מתרבית ה-DRG בתא המתוח והוסף 0.5 מיליליטר של תרחיף תאי שוואן לתרבית ה-DRG. תרבית התאים במשך שבוע ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2.

החלף את המדיום כל יומיים על ידי החלפת מחצית מהמדיום המושקע במדיום גידול סטנדרטי טרי. לאחר תרבית על המשטחים המתוחים והלא מתוחים במשך שבועיים, תאי שוואן מטוהרים נוספו לתא ועברו תרבית למשך שבוע נוסף. מוצג כאן צביעת טובולין בטא-III לאקסונים על המשטח המתוח.

וזוהי שכבת העל של טובולין בטא-III וצביעה P0 על פני השטח המתוחים, מה שמרמז על כך שתאי שוואן מחוברים לאקסונים וככל הנראה מיאלינים אותם. תמונה זו מציגה את צביעת טובולין בטא-III לאקסונים על פני השטח הלא מתוחים. ושכבת העל של טובולין בטא-III וצביעה P0 על פני השטח הלא מתוחים מרמזת על כך שתאי שוואן אינם מחוברים לאקסונים.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על קרום ה-PDMS שטוח ובעובי הומוגני. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מרססים כמו מיקרו-ערוצים מתוחים מראש על מנת לענות על שאלות נוספות כמו עדשת אקסון ונדידת תאי שוואן.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום הנדסת הרקמות לחקור את תפקידה של אניזוטרופיה פני השטח על התחדשות עצבים בחוט השדרה ובעצב הסיאטי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום ליישור ומיאלינציה של אקסונים באמצעות מכשיר מתוח מראש.