Stripe Assay לחקר פעילות דוחה או מושך של מצע חלבון באמצעות ניתק נוירונים בהיפוקמפוס

המטרה הכוללת של בדיקת הפסים (stripe assay) היא להעריך את יכולתם של חלבונים ספציפיים, כגון מולקולות הנחיה, למשוך או לדחות נוירונים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנחיית האקסונים, כגון האופן שבו נוירונים יכולים לנדוד או להאריך את האקסונים שלהם בתגובה לסביבה התאית החיצונית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להדגים מספר רב של נוירונים בניסוי בודד ולנתח בו-זמנית קונוסים של צמיחה (growth cones) רבים.

כהכנה, הרתיחו ארבע עד שמונה מטריצות סיליקון במים למשך חמש דקות. תנו להן להתייבש לחלוטין באוויר תחת מ ihūה למינרית כאשר הצדים הפסיתים פונים כלפי מעלה. פעולה זו אורכת כשעה.

המשיכו לעבוד תחת מנדף. השתמשו באוויר דחוס או בסרט דביק כדי להסיר אבק מהצד המפוספס של המטריצות. לאחר מכן, הניחו בזהירות כל מטריצה בצלחת פלסטיק נפרדת בקוטר שישה סנטימטרים, כאשר הצד המפוספס פונה כלפי מטה.

בעזרת אצבע אחת, לחצו על כל מטריצה בחוזקה. הימנעו מלכוד בועות אוויר בין המטריצה לצלחת. אם המטריצה אינה נצמדת, חזרו על התהליך.

לאחר ההצמדה, סמנו את מיקום הפסים בצדו התחתון של כלי התרבית. הכינו את החלבונים הרקומביננטיים המסומנים פלואורסצנטית ב-PBS. הכינו 25 µL עבור כל כלי עם הפסים.

השאירו את התערובת להדגרה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, עבור כל צלחת, טענו מזרק בכיול 22 עם 25 µL של חלבון מדולל והזריקו אותו דרך החור הקטן שבצד המטריצה. הימנעו מהזרקת בועות אוויר לתוך המטריצות, שכן הן יפריעו להיקשרות החלבונים לצלחות.

כעת, דגרו את הצלחות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לתרביות תאים. לאחר הדגירה, העבירו 300 µL של PBS לחריץ העליון של כל מטריצה. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS דרך חור קטן הנמצא בצד של כל מטריצה כדי להסיר את כל החלבונים הרקומביננטיים שלא נצמדו.

אין לשאוב את ה-PBS באופן מלא כיוון שהחלבונים יתייבשו. בצע שטיפה זו ב-PBS שלוש פעמים בסך הכל. לאחר מכן, הסר בזהירות את המטריצה מכל צלחת.

לאחר מכן, הוסיפו מיד כ-100 µL של חלבון השליטה על פני כל השטח המפוספס, כך שייווצר ציפוי לסירוגין בכל צלחת. לאחר מכן, דגרו את הצלחות למשך 30 דקות ב-37 °C. במקביל, הפשיתו על קרח laminin ו-PBS בריכוז של 20 µg/mL.

לאחר 30 דקות, שטפו את הצלחות שלוש פעמים ב-PBS. לאחר מכן, כסו כל צלחת בכ-100 microliters של laminin קר והחזירו את הצלחות לאינקובטור למשך שעה נוספת. שעה לאחר מכן, שטפו שוב את הצלחות שלוש פעמים באמצעות PBS.

לאחר השטיפה השלישית, הוסיפו כ-150 µL של מצע תרבית לכל צלחת. לאחר מכן, הדגירו את הצלחות באינקובטור עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 °C עד למועד השימוש הבא. לאחר ביצוע קרטזיה לעכבר תורם בשלב E15.5, חתכו את העור ואת הגולגולת בצורה סגיטלית בקו האמצע של הראש באמצעות מספריים כירורגיים, והוציאו את המוח בעזרת מיקרו-ספטולה.

העבר בזהירות את המוח לצלוחית פטרי בנפח 60 מיליליטר המכילה 3 מיליליטר של HBSS. בצלוחית, השתמש בסכין מנתח כדי לחתוך את ההמיספרים, כולל הקורטקס, ההיפוקמפוס והסטריאטום. לאחר מכן, בצע דיסקציה של אזורי ההיפוקמפוס על ידי הסרה זהירה של הקרומים (meninges).

העבירו את רקמות ההיפוקמפוס המבודדות למבחנת צנטריפוגה של 15 milliliters המכילה שני milliliters של תמיסת HBSS על קרח. שישה היפוקמפוסים משלושה עובריים מספיקים לתרבית נוירונים בשמונה צלחות. לאחר איסוף כל רקמות ההיפוקמפוס, שאבו את ה-HBSS והחליפו אותו בשני milliliters של trypsin-EDTA.

לאחר מכן, דגרו את המבחנה במשך 15 דקות במקלחת במים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, נטרלו את פעילות ה-trypsin על ידי הוספת 500 µL של fetal bovine serum. לבסוף, סובבו את התערובת בצנטריפוגה ב-100 Gs למשך חמש דקות.

הסר את הנוזל העליון (supernatant) ושטוף את המשקע עם שני milliliters של מצע גידול. לאחר מכן, סבב שוב את התערובת בצנטריפוגה והחלף את המצע במצע חדש. כעת, הפרד את הרקמה באמצעות טריטורציה עדינה תוך שימוש בראש פיפט של one milliliter עם קצה חתוך.

העבירו את הרקמות למעלה ולמטה דרך קצה הפיפטה כ-10 פעמים. לאחר מכן, השתמשו בטיפ של 1 ml שלא נחתך וחזרו על פעולת הטרטורציה (trituration) כדי לקבל תמיסת תאים בודדים. כעת, בדלו את התאים הבודדים על ידי דחיסת התמיסה דרך מסננת תאים עם רשת של 80 עד 100 micron.

לאחר מכן, סובבו את התו Suspension המסונן בצנטריפוגה ב-150 Gs למשך חמש דקות, שאבו את supernatant ותלו את המשקע (pellet) בשני מיליליטר של מצע גידול. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר והעבירו 10,000 נוירונים ב-150 microliters של מצע גידול לכל פלטת פסים (stripe plate) שהוכנה. השקיפו את התו Suspension בזהירות כך שיכסה את כל אזור הפסים.

נוירונים מופרדים מהיפוקמפוס של עכברים בשלב E15.5 נזרעו ותורבתו במשך 24 שעות על פסי חלבון בקרה FC המסומנים פלואורסצנטית, או שהנוירונים נזרעו על פסי FLRT2 FC לסירוגין עם פסי בקרה FC שאינם מסומנים. בשני המקרים, הנוירונים הצטברו והאריכו את האקסונים שלהם כצרורים. בבקרה של FC, הנוירונים התפלגו באופן שווה והאריכו את האקסונים שלהם בכיוונים אקראיים. לעומת זאת, כאשר תורבתו עם פסי FLRT2 FC, האקסונים נמנעו מצמיחה על אזורי ה-FLRT2 FC.

כך, האקסונים המתארכים צמחו בעיקר על פסי ה-FC. הגדלה גבוהה יותר מראה כי האקסונים צמחו לאורך הגבול עם פסי ה-FLRT2 FC, אך לא התקדמו לתוך טריטוריית ה-FLRT2. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו יוצרים שטיח פסים של החלבונים המומלצים ובוחנים את הפעילות המושכת או הדוחה באמצעות נוירונים מופרדים מההיפוקמפוס.

לאחר ששולטים בטכניקה זו, ניתן לבצעה בחמישה שעות אם היא מבוצעת כראוי.