Name: Stripe Assay לחקר פעילות דוחה או מושך של מצע חלבון באמצעות ניתק נוירונים בהיפוקמפוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: חקור את שיטת Stripe Assay להערכת פעילות דוחה או מושך של מולקולות הדרכה באקסונים באמצעות נוירונים מהיפוקמפוס מבודדים. שיטה זו מאפשרת ניתוח בו-זמני של מספר רב של קוני צמיחה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי Grants-in-Aid for Scientific Research מהאגודה היפנית לקידום המדע (23700412, 25122707 ו-26670090 ל-S.Y.).

הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש בבית הספר אוניברסיטת Hamamatsu לרפואה. 1. הכנת מטריצות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים 4-8 מטריצות סיליקון במיקרוגל או על פלטה חשמלית במשך 5 דקות ולאפשר להם להתייבש לחלוטין עבור h 1 תחת זרימה למינרית (צד פסים למעלה). הערה: ההליכים הבאים יש לבצע תחת זרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפוצץ אוויר דחוס או להשתמש סרט דביק שקוף כדי להסיר כל אבק מצד הפסים של המטריצות. שמור את צד הפסים נקיים אז זה בתקיפות יכול לדבוק פני הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות את מטריצות על צלחות פלסטיק 6 ס&quot;מ על ידי לחיצה באצבע (מטריצה ​​אחד לכל צלחת; פס בצד למטה). להימנע מקבלת בועות אוויר בין מטריקס ואת המנה. סמן את מיקומו של הפסים בצד התחתון של מנת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המטריצה ​​נכשלה לצרף, וחזור משלב 1.2. </li></ol>דור Stripe 2. Laminin ציפוי לתרבות Neuron <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שכותרתו fluorescently חלבון רקומביננטי (25 μl כל להזרקה [שלב 2.2] או 100 μl כל לשיטת מיקום [צעד 2.2.1]) על ידי ערבוב של חלבון Fc-tagged (10-50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו dye- ניאון אנטי אנושי מצומדות נוגדנים Fc (1 עד 3 יחס: 30-150 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ב בופר פוספט (PBS). ואז, דגירה את התערובת למשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 22-G, להזריק 25 μl של חלבון רקומביננטי מוכן בשלב הקודם (2.1) דרך חור קטן בצד של מטריקס (חיצים באיור 1A, 1C, ו 1E). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, במקום 100 μl של חלבון רקומביננטי לתוך החריץ העליון של מטריקס לשאוב כמחצית הפתרון מהחור הקטן (חיצים באיור 1A, 1C, ו 1E), כך חלבון רקומביננטי נשאר באזורי הפסים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחת עבור 30 מיליםn ב 37 מעלות צלזיוס חממת תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח 300 μl של PBS לתוך החריץ העליון (איור 1 ב &#39;) ואת לשאוב מהחור הקטן הממוקם בצד של מטריקס (חיצים באיור 1A, C ו- E) כדי להסיר חלבונים רקומביננטיים פנויים. אין לשאוב את PBS לחלוטין, משום שהחלבונים יתייבשו. חזור על פעולה זו פעמיים. (3 פעמים בסך הכל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את מטריקס ומיד למקם ~ 100 μl של חלבון בקרה (10-50 מיקרוגרם / מ&quot;ל; Fc) כדי לכסות את האזור כולו פסים, יצירת ציפוי חלופי. לאחר מכן, דגירת הצלחת למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת משטח צלחת שלוש פעמים עם PBS, לצפות אותו ~ 100 μl של 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​laminin ב PBS. הערה: Laminin צריך להיות מופשר על הקרח כדי למנוע התמצקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחת של 1 ש &#39;על 37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את פני השטח צלחת שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף Medi תרבותאממ. מניח את הצלחת המצופית עם מדיום תרבות חממה 5% CO 2 ב 37 ° C עד שימוש. </li></ol> 3. נוירונים בהיפוקמפוס Culturing מ E15.5 עכבר עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים אמא באמצעות נקע בצוואר הרחם ולבודד שלושה E15.5 עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את עור הגולגולת sagittally על קו האמצע של הראש עם מספריים, ולהסיר את המוח בעזרת כף קטנה. מעביר את המוח בזהירות לצלחת 60 מ&quot;מ פטרי המכילה 3 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל, לחתוך את ההמיספרות כולל קליפה, ההיפוקמפוס בסטריאטום (איור 2 א). לאחר מכן, לנתח את אזור בהיפוקמפוס על ידי הסרת קרומי המוח בזהירות, ולהעביר את רקמות בהיפוקמפוס גזור לצינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל המכיל 2 מ&quot;ל של תמיסת HBSS, על הקרח (איור 2 ב-ג). אסוף 6 hippocampi מן 3 עוברים בצינור, אשר מספיקים culturing נוירונים 8 מנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את Hפתרון BSS עם פתרון טריפסין / EDTA (2 מ&quot;ל) ו דגירה צינור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות באמבט מים. הערה: לשאוב HBSS ללא צנטריפוגה ואינו למזוג פתרון HBSS על ידי הטיית הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את פעילות טריפסין על ידי הוספת 500 μl של בסרום שור העוברי (FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התערובת על 100 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant לשטוף את הכדור עם 2 מ&quot;ל של מדיום תרבות. חזור על פעולה זו פעם נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet hippocampi למעלה ולמטה 10 פעמים במדיום תרבות באמצעות קצה 1,000 μl עם חור גדול (לחתוך קצה) כדי לנתק את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה עד קצה 1,000 μl רגיל (נימול) ו pipet למעלה רקמות הניתקות ולמטה כדי לקבל השעית תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את התא הבודד על ידי העברת אותם באמצעות מסננת תא רשת 80-100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השעית התא הבודדה המסוננת ב XG 150 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant על ידי aspirating, ו resuspend פלet (נוירונים) ב 2 מ&quot;ל של מדיום תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות hemocytometer עם מכתים trypan הכחול כדי לקבוע את הצפיפות ואת הכדאיות. לאחר מכן, צלחת 10,000 נוירונים 150 μl של מדיום התרבות עבור כל קבוצה של השעית stripes.The צריכה להיות ממוקמות היטב על מנת לטייח באזור הפס כולו. </li></ol> ויזואליזציה 4. Cell גופות אקסונים ידי Immunofluorescence מכתים באמצעות נוגדן אנטי Tau1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של תרבות, לשאוב את המדיום מבלי להפריע את התאים החסידים, ולתקן את הנוירונים עם paraformaldehyde מחומם מראש 4% (PFA) / 4% סוכרוז / PBS ב RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את פעמי צלחת המשטח 3 עם PBS. אם תרצה, להשתמש בעט מים ודוחה לצייר עיגול סביב אזור הפסים כדי להקטין את כמות הנוגדנים הצורכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize הנוירונים עם 0.3% Triton X-100 / PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הנוירונים עם פתרון חסימה המכיל סרום 3% חמורים 0.1% Triton X-100 טובים30 דקות ואחריו הדגירה עם נוגדן אנטי Tau1 (1: 200) בסרום חמור 1% / 0.1% Triton X-100 / PBS O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את פעמי צלחת המשטח 3 עם PBS. דגירה הנוירונים עם נוגדן fluorophore מצומדות אנטי עכבר IgG ב אלבומין 1% שור (BSA) /0.1% טריטון X-100 / PBS למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את פעמי צלחת המשטח 3 עם PBS. מכסה את אזור פסים עם מכסה זכוכית 18 מ&quot;מ x 18 מ&quot;מ באמצעות 50 μl של antifade פתרון. למנוע בועות אוויר, אשר להפריע הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג תמונות ניאון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות המערכת המתאימה, למשל, עדשה אובייקטיבית x10, מערכות סינון עבור GFP ו RFP, וזמן חשיפה של 1,000 מילים-שניות (איור 3). </li></ol>

<ol><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li>
<li>Bashaw, G. J., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+axon+guidance+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling from axon guidance receptors.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941(2010).</li>
<li>Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+the+guidance+of+nerve+growth+by+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1.</a> Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).</li>
<li>Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Activity+Modulates+Growth+Cone+Guidance+by+Diffusible+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors.</a> Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).</li>
<li>Dudanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+a+contribution+of+EphA%3AephrinA+reverse+signaling+to+motor+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance.</a> J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).</li>
<li>Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit2+regulates+attractive+eosinophil+and+repulsive+neutrophil+chemotaxis+through+differential+srGAP1+expression+during+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation.</a> J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).</li>
<li>Ly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSCAM+is+a+netrin+receptor+that+collaborates+with+DCC+in+mediating+turning+responses+to+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1.</a> Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).</li>
<li>Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unc5B+associates+with+LARG+to+mediate+the+action+of+repulsive+guidance+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule.</a> J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).</li>
<li>Egea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+EphA+4+kinase+activity+is+required+for+a+subset+of+axon+guidance+decisions+suggesting+a+key+role+for+receptor+clustering+in+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function.</a> Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).</li>
<li>von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-Bound+Protein+Gradients+for+Cell+Culture+Fabricated+by+Microfluidic+Networks+and+Microcontact+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing.</a> Sci Signal. , (2007).</li>
<li>Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+submicrometer+features+on+curved+substrates+by+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing.</a> Science. 269 (5224), 664-666 (1995).</li>
<li>Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+self-assembled+monolayers+to+understand+the+interactions+of+man-made+surfaces+with+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).</li>
<li>Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+position-specific+properties+of+tectai+cell+membranes+by+retinal+axons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro.</a> Development. 101, 685-696 (1987).</li>
<li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li>
<li>Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stripe+assay%3A+studying+growth+preference+and+axon+guidance+on+binary+choice+substrates+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro.</a> Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functional+relevance+of+the+Slit2+homodimerization+domain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain.</a> EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).</li>
<li>Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+of+ephrin%2FEph+forward+and+reverse+signaling+as+the+driving+force+of+adaptive+topographic+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping.</a> Development. 139 (2), 335-345 (2012).</li>
<li>Atapattu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+binding+the+ADAM10+substrate+recognition+domain+inhibit+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function.</a> J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).</li>
<li>Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrin+interactions+modulate+muscle+satellite+cell+motility+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning.</a> Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT+Structure%3A+Balancing+Repulsion+and+Cell+Adhesion+in+Cortical+and+Vascular+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development.</a> Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).</li>
<li>Yamagishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT2+and+FLRT3+act+as+repulsive+guidance+cues+for+Unc5-positive+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons.</a> EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר assay פס המשתמשת חלבון רקומביננטי נוירונים ניתק מן ההיפוקמפוס עכבר E15.5. assay זה מאפשר תצפית היעילה של תגובות דוחות, אטרקטיביות, או ניטראליות של נוירונים לחלבון רקומביננטי של עניין להציב דפוס פסים. יתרון עיקרי של פרוטוקול זה הוא השיטה הפשוטה ליצירת הפסים, שבו החלבון מודפס ישירות על גבי המשטח של צלחת פלסטיק, לעומת השיטה המסורתית, המחייב מטריצות מיוחדות, מערכת שאיבה, וקרומי nucleopore 20 , 21. כדי להפוך את פסי החלבון, חלבון רקומביננטי שכותרתו ניתן להזרי...

הדרכת האקסון היא התהליך שבו הנוירונים שהוקם זה עתה לשלוח אקסונים אל היעד שלהם במהלך פיתוח של 1,2 מערכת העצבים. אקסונים פיתוח לשאת מבנה ניע מאוד בקצהו שלהם שנקרא חרוט צמיחה. חרוט הצמיחה החושים רמזים תאיים לנתב את הדרך של האקסון. מולקולות הנחיה, כגון חתך, semaphorin, ו ephrins, יכולים למשוך או לדחות אקסונים תלוי האינטראקציה שלהם עם קולטנים מתאימים-קולטנים שיתוף על האקסון 1,3,4. הקולטנים מופעלים להעביר אותות אל חרוט הצמיחה המשפיעים ארגון cytoskeletal שלה לתנועות האקסון וצמיחה חרוטה. שיטות שונות פותחו כדי להעריך את הפעולה של מולקולות attractant ודוחה. חמו-משיכה ודוחים יכול להינתן לתוך מדיום הגידול / תרבות עם ריכוז שיפוע (למשל., קאמרית או μ-מגלשות דאן) 5,6, במקום מרוכז מאוד על ידי מיקרו-p<html> ipette (למשל., assay מפנה) 7 או בריכוז הומוגנית ידי יישום אמבטיה (למשל., assay קריסת צמיחה חרוט) 8,9. שיטות אחרות כוללות assay פס או הדפסת microcontact (μCP), שבו attractant הכימותרפיה או דוחה מצופה על פני השטח של צלחת כמו מצע 10-12. Thestripe assay פותחה במקור על ידי בונהופר ועמיתיו בשנת 1987 לנתח מיפוי טופוגרפי במערכת retino-tectal חומוס 13. השיטה המקורית נדרש שואב אבק לחלבונים מעיל על ממברנות פוליקרבונט nucleopore באמצעות פסים ומטריצות מרושת. בגירסאות מתקדמות יותר, חלבונים רקומביננטיים הודפסו ישירות על פני השטח של צלחת תרבות בדפוס פסים באמצעות 14,15 מטריצות סיליקון פתח צר. לאחרונה, קבוצות מחקר שונות יישמו בהצלחה assay פס זה ניתוח של פעילות מולקולה הדרכה האקסון 16-21. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור assay פס המודד את למשיכה או לדחיה של מולקולות האקסון הדרכה עבור נוירונים בהיפוקמפוס ניתק. יש לציין, שיטה זו יכולה להיות מיושמת במסגרות מעבדה מצוידות מינימאלי. עבור assay זה, פסים מתחלפים של מצע שכותרתו fluorescently ו חלבון בקרה מופקים על צלחת פלסטיק באמצעות מטריצת סיליקון עם חריצי 90 מיקרומטר ומצופי laminin. בהפגנה שלנו, ניתק נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים E15.5 היו בתרבית על לסירוגין פסים של ectodomain רקומביננטי של פיברונקטין ו לאוצין עשיר הטרנסממברני חלבון-2 (FLRT2) ולשלוט Fc חלבון 21. לאחר 24 שעות של תרבות, הן אקסונים גופי התא של הנוירונים נהדפו מאוד מן פסים FLRT2. צביעה עם נוגדן אנטי Tau1 גילה כי כ -90% של נוירונים חולקו על אזורים מצופה Fc, לעומת כ -10% על FLRT2-FC, המציין כי FLRT2 יש חזקה דוחהפונקציה עבור נוירונים בהיפוקמפוס 21.

<table><tbody><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>Violamo&nbsp;</td><td>1-3500-01</td><td></td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד (PFA)</td> <td>נקלאי</td><td>01954-85</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 נוגדן IgG אנטי אנושי עיזים</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11013</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 חמור נגד עכבר נוגדן IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21203</td><td>דילול 1/500</td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Tau1</td><td>Chemicon</td><td>MAB3420</td><td>דילול 1/200</td></tr><tr><td>אנטי דהייה</td><td>Thermo Scientific</td><td>P7481</td><td>ניתן להשתמש באמצעי הרכבה חלופיים</td></tr><tr><td>תוסף B27</td><td>Thermo Scientific</td><td>17504-044</td><td>דילול 1/50</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא</td><td>01-2030-2</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים 100 אום</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>מכונת צנטריפוגה</td><td>Kubota</td><td>2410</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית 18 מ"מx18 מ"מ</td><td>מטסונאמי</td><td>18x18 מ"מ מס' 1</td><td></td></tr><tr><td>עט</td><td>DAKO</td><td>DAKO S2002</td><td>ניתן להשתמש בעט דוחה מים חלופי</td></tr><tr><td>נוצות</td><td>אזמל חד פעמי</td><td>2975#11</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Fluorecent</td><td>Nikon</td><td>E600</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מס' 5</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050-061</td><td>דילול 1/100</td></tr><tr><td>מזרק המילטון</td><td>המילטון</td><td>805N</td><td>22 מד, 50 uL</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>IgG אנושי, שבר Fc</td><td>ג'קסון</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Thermo Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל</td><td>ג'קסון</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>15070-063</td><td>דילול 1/100</td></tr><tr><td>צלחת תרבית פלסטיק, 60 מ"מ</td><td></td><td></td> מטריצות סיליקון Thermo Scientific 150288 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>זמין וניתן לרכישה אצל פרופ' מרטין בסטמאייר (bastmeyer@kit.edu)</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>אולימפוס</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>טיפ, 1000 uL</td><td>Watson</td><td>125-1000S</td><td></td></tr><tr><td>סרט דביק שקוף</td><td>Tesa</td><td>57315</td><td>ניתן להשתמש בסרט דביק חלופי</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4%</td> <td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>תרבית מדיום</td><td></td><td></td><td>נוירובזאלי בתוספת B27, GlutaMAX ופניצילין-סטרפטומיצין.</td></tr></tbody></table>

stripe assay לחקר פעילות דוחה או מושך של מצע חלבון באמצעות ניתק נוירונים בהיפוקמפוס

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

אקסונים גדלים מפתחים מבנה תנועתי מאוד בקצותיהם, הנקרא חרוט הגדילה. חרוט הגדילה יוצר קשר עם רמזים סביבתיים חוץ-תאיים כדי לנווט בצמיחה אקסונלית. Netrin, slit, semaphorin ו-ephrins הן מולקולות הנחיה ידועות שיכולות למשוך או לדחות אקסונים בעת קשירה לקולטנים וקולטנים משותפים על האקסון. הקולטנים המופעלים יוזמים מולקולות איתות שונות בחרוט הגידול שמשנות את המבנה והתנועה של הנוירון. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול המפורט לבדיקת פסים כדי להעריך את יכולתה של מולקולת הנחיה למשוך או לדחות נוירונים. בשיטה זו, נוירונים היפוקמפיים מנותקים מעכברי E15.5 מתורבתים על כלים מצופים למינין המעובדים עם פסים מתחלפים של אקטודומיין של פיברונקטין וחלבון טרנסממברני עשיר בלאוצין-2 (FLRT2) ובקרת חלבון אזור גבישי (IgG) של אימונוגלובולין G (IgG). גם האקסונים וגם גופי התאים נהדפו חזק מאזורי הפסים המצופים FLRT2 לאחר 24 שעות של תרבית. צביעה חיסונית עם tau1 הראתה ש~90% מהנוירונים היו מפוזרים על הפסים המצופים ב-Fc בהשוואה לפסים המצופים FLRT2-FC (~10%). תוצאה זו מצביעה על כך של-FLRT2 יש השפעה דוחה חזקה על תאי עצב אלה. שיטה רבת עוצמה זו ישימה לא רק עבור נוירונים מתורבתים ראשוניים אלא גם עבור מגוון תאים אחרים, כגון נוירובלסטים.

נוירונים בהיפוקמפוס ניתקו מעכברי E15.5 היו מצופים ותרבותי במשך 24 שעות על פסים של שכותרתו fluorescently Fc ביקורת (איור 3A-C) או FLRT2-FC (איור 3D-F) לסירוגין עם Fc שליטה הלא מסומן. בשני המקרים, הנוירונים היו מצטברים והאריכו האקסונים שלהם כמו צרורות. בשלט Fc / פסים Fc, הנוירונים חולקו באופן שווה על שכותרתו fluorescently ופסים אי שכותרתו ושם האריכו האקסונים שלהם בכיוונים אקראיים (איור 3A-C). לעומת ז...

מולקולות הנחיית אקסון מווסתות את הנדידה העצבית וניווט ממוקד של חרוט גדילה. אנו מציגים שיטה רבת עוצמה, מבחן הפסים, להערכת יכולתן של מולקולות הנחיה למשוך או לדחות נוירונים. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את בדיקת הפסים על ידי הצגת יכולתו של FLRT2 להדוף נוירונים בהיפוקמפוס מתורבתים.

Stripe Assay לחקר פעילות דוחה או מושך של מצע חלבון באמצעות ניתק נוירונים בהיפוקמפוס

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

המטרה הכוללת של בדיקת הפסים (stripe assay) היא להעריך את יכולתם של חלבונים ספציפיים, כגון מולקולות הנחיה, למשוך או לדחות נוירונים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנחיית האקסונים, כגון האופן שבו נוירונים יכולים לנדוד או להאריך את האקסונים שלהם בתגובה לסביבה התאית החיצונית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להדגים מספר רב של נוירונים בניסוי בודד ולנתח בו-זמנית קונוסים של צמיחה (growth cones) רבים.כהכנה, הרתיחו ארבע עד שמונה מטריצות סיליקון במים למשך חמש דקות. תנו להן להתייבש לחלוטין באוויר תחת מ ihūה למינרית כאשר הצדים הפסיתים פונים כלפי מעלה. פעולה זו אורכת כשעה.המשיכו לעבוד תחת מנדף. השתמשו באוויר דחוס או בסרט דביק כדי להסיר אבק מהצד המפוספס של המטריצות. לאחר מכן, הניחו בזהירות כל מטריצה בצלחת פלסטיק נפרדת בקוטר שישה סנטימטרים, כאשר הצד המפוספס פונה כלפי מטה.בעזרת אצבע אחת, לחצו על כל מטריצה בחוזקה. הימנעו מלכוד בועות אוויר בין המטריצה לצלחת. אם המטריצה אינה נצמדת, חזרו על התהליך.לאחר ההצמדה, סמנו את מיקום הפסים בצדו התחתון של כלי התרבית. הכינו את החלבונים הרקומביננטיים המסומנים פלואורסצנטית ב-PBS. הכינו 25 µL עבור כל כלי עם הפסים.השאירו את התערובת להדגרה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, עבור כל צלחת, טענו מזרק בכיול 22 עם 25 µL של חלבון מדולל והזריקו אותו דרך החור הקטן שבצד המטריצה. הימנעו מהזרקת בועות אוויר לתוך המטריצות, שכן הן יפריעו להיקשרות החלבונים לצלחות.כעת, דגרו את הצלחות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לתרביות תאים. לאחר הדגירה, העבירו 300 µL של PBS לחריץ העליון של כל מטריצה. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS דרך חור קטן הנמצא בצד של כל מטריצה כדי להסיר את כל החלבונים הרקומביננטיים שלא נצמדו.אין לשאוב את ה-PBS באופן מלא כיוון שהחלבונים יתייבשו. בצע שטיפה זו ב-PBS שלוש פעמים בסך הכל. לאחר מכן, הסר בזהירות את המטריצה מכל צלחת.לאחר מכן, הוסיפו מיד כ-100 µL של חלבון השליטה על פני כל השטח המפוספס, כך שייווצר ציפוי לסירוגין בכל צלחת. לאחר מכן, דגרו את הצלחות למשך 30 דקות ב-37 °C. במקביל, הפשיתו על קרח laminin ו-PBS בריכוז של 20 µg/mL.לאחר 30 דקות, שטפו את הצלחות שלוש פעמים ב-PBS. לאחר מכן, כסו כל צלחת בכ-100 microliters של laminin קר והחזירו את הצלחות לאינקובטור למשך שעה נוספת. שעה לאחר מכן, שטפו שוב את הצלחות שלוש פעמים באמצעות PBS.לאחר השטיפה השלישית, הוסיפו כ-150 µL של מצע תרבית לכל צלחת. לאחר מכן, הדגירו את הצלחות באינקובטור עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 °C עד למועד השימוש הבא. לאחר ביצוע קרטזיה לעכבר תורם בשלב E15.5, חתכו את העור ואת הגולגולת בצורה סגיטלית בקו האמצע של הראש באמצעות מספריים כירורגיים, והוציאו את המוח בעזרת מיקרו-ספטולה.העבר בזהירות את המוח לצלוחית פטרי בנפח 60 מיליליטר המכילה 3 מיליליטר של HBSS. בצלוחית, השתמש בסכין מנתח כדי לחתוך את ההמיספרים, כולל הקורטקס, ההיפוקמפוס והסטריאטום. לאחר מכן, בצע דיסקציה של אזורי ההיפוקמפוס על ידי הסרה זהירה של הקרומים (meninges).העבירו את רקמות ההיפוקמפוס המבודדות למבחנת צנטריפוגה של 15 milliliters המכילה שני milliliters של תמיסת HBSS על קרח. שישה היפוקמפוסים משלושה עובריים מספיקים לתרבית נוירונים בשמונה צלחות. לאחר איסוף כל רקמות ההיפוקמפוס, שאבו את ה-HBSS והחליפו אותו בשני milliliters של trypsin-EDTA.לאחר מכן, דגרו את המבחנה במשך 15 דקות במקלחת במים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, נטרלו את פעילות ה-trypsin על ידי הוספת 500 µL של fetal bovine serum. לבסוף, סובבו את התערובת בצנטריפוגה ב-100 Gs למשך חמש דקות.הסר את הנוזל העליון (supernatant) ושטוף את המשקע עם שני milliliters של מצע גידול. לאחר מכן, סבב שוב את התערובת בצנטריפוגה והחלף את המצע במצע חדש. כעת, הפרד את הרקמה באמצעות טריטורציה עדינה תוך שימוש בראש פיפט של one milliliter עם קצה חתוך.העבירו את הרקמות למעלה ולמטה דרך קצה הפיפטה כ-10 פעמים. לאחר מכן, השתמשו בטיפ של 1 ml שלא נחתך וחזרו על פעולת הטרטורציה (trituration) כדי לקבל תמיסת תאים בודדים. כעת, בדלו את התאים הבודדים על ידי דחיסת התמיסה דרך מסננת תאים עם רשת של 80 עד 100 micron.לאחר מכן, סובבו את התו Suspension המסונן בצנטריפוגה ב-150 Gs למשך חמש דקות, שאבו את supernatant ותלו את המשקע (pellet) בשני מיליליטר של מצע גידול. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר והעבירו 10,000 נוירונים ב-150 microliters של מצע גידול לכל פלטת פסים (stripe plate) שהוכנה. השקיפו את התו Suspension בזהירות כך שיכסה את כל אזור הפסים.נוירונים מופרדים מהיפוקמפוס של עכברים בשלב E15.5 נזרעו ותורבתו במשך 24 שעות על פסי חלבון בקרה FC המסומנים פלואורסצנטית, או שהנוירונים נזרעו על פסי FLRT2 FC לסירוגין עם פסי בקרה FC שאינם מסומנים. בשני המקרים, הנוירונים הצטברו והאריכו את האקסונים שלהם כצרורים. בבקרה של FC, הנוירונים התפלגו באופן שווה והאריכו את האקסונים שלהם בכיוונים אקראיים. לעומת זאת, כאשר תורבתו עם פסי FLRT2 FC, האקסונים נמנעו מצמיחה על אזורי ה-FLRT2 FC.כך, האקסונים המתארכים צמחו בעיקר על פסי ה-FC. הגדלה גבוהה יותר מראה כי האקסונים צמחו לאורך הגבול עם פסי ה-FLRT2 FC, אך לא התקדמו לתוך טריטוריית ה-FLRT2. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו יוצרים שטיח פסים של החלבונים המומלצים ובוחנים את הפעילות המושכת או הדוחה באמצעות נוירונים מופרדים מההיפוקמפוס.לאחר ששולטים בטכניקה זו, ניתן לבצעה בחמישה שעות אם היא מבוצעת כראוי.

stripe-assay-to-study-attractive-or-repulsive-activity-protein

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים גישה של הזנת נוגדנים לחקר הסחר של קולטני גלוטמט בתרביות עצביות ראשוניות בהיפוקמפוס. גישה זו מאפשרת תצפית על אוכלוסיות קולטנים הן בפלזמה והן בקרומים הפנימיים. הבחנה בין תת-קבוצות אלה מושגת על ידי תיוג הקולטנים לפני ואחרי חדירת הממברנה, תוך שימוש באותו נוגדן ראשוני אך נוגדנים משניים מצומדים לפלואורופורים שונים.

טכניקת מבחנה לחקר סחר בקולטן גלוטמט בתאי עצב בהיפוקמפוס

סרטון זה מדגים שיטה להערכת פעילות החלבונים באמצעות תאי עצב בהיפוקמפוס על פני אזורי חלבון בדוגמאות. תאי עצב מפגינים דחייה באזורי חלבון הבדיקה והתקשרות באזורי חלבון ביקורת, מה שמדגיש את ההשפעות של פעילות חלבון אטרקטיבית או דוחה.

הערכת פעילות מושכת או דוחה של חלבונים באמצעות נוירונים בהיפוקמפוס

בנוסף ההפיך של Palmitate לחלבונים הוא רגולטור חשוב של סחר בחלבונים תאי. זו היא עניין מיוחד בתאי עצב שבו חלבונים סינפטיים רבים palmitoylated. אנו משתמשים בשיטה ביוכימית פשוטה לזהות חלבונים בתאי עצב בתרבית palmitoylated, שניתן להתאים למספר רבים של סוגי תאים ורקמות.

איתור של palmitoylation חלבון בנוירונים ביפוקמפוס מתורבתים ידי immunoprecipitation וacyl-Exchange ביוטין (אייב)

אנו מתארים שיטה לתייג חלבון על פני השטח של תאי עצב חיים באמצעות נוגדן polyclonal ספציפי לאפיטופים תאיים. החלבון קשור בנוגדן על פני התא, ולאחר מכן הפנים באמצעות אנדוציטוזה ניתן להבחין בין החלבון שנותר ב, או נסחרים ל, את פני השטח במהלך הדגירה.

תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לאינדוקציה של הגברה לטווח ארוך באזור CA1 של ההיפוקמפוס והבידוד הבא של שברים מועשרים גרעיניים מאזור tetanized של הפרוסה. גישה זו יכולה לשמש כדי לקבוע פעילות יבוא חלבון גרעיני תלוי בדגמים סלולריים של למידה וזיכרון.

בידוד של CA1 גרעיני שברים מועשרים מSlices בהיפוקמפוס לחקר פעילות תלויה גרעיני יבוא של חלבונים Messenger synapto-גרעיניים

שלפוחית סינפטית אנדוציטוזה מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור של pHluorin התמזגו עם שלפוחית סינפטית חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של ספיגת שלפוחית.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

יכול להיות מאופנן דעתנית עצביים באמצעות תהליך דינאמי של אנדו - אקסוציטוזה של רצפטורים גלוטמט ionotropic סינאפסות. המתוארים כאן הוא assay הנגיש, תיכון-תוכן לכימות תנועת משטח ופנימיים קולטן האוכלוסייה בריכות.

וזמינותו גבוהים-תוכן עבור ניטור אמפא קולטן סחר

בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לטיהור החלק הדנדריטי-עשיר של השבר הדנדריטים של הגביע phagocytic כמו מבנה בליטה על הנוירונים היפוקמאל תרבותי על ידי ניצול הזיקה הספציפית והחזקה בין מחוגה הדנדריטי מולקולת הדבקה, TLCN ומולקולת מטריקס בעלי מטריצה, vitronectin.

טיהור של הדנדריטים הדנדריפיאה-חלק עשיר

מאמר זה מציג שיטה לימוד קולטן גלוטמט (GluR) סחר בתרבויות היפוקמאל העיקרי הנתק. באמצעות גישה האכלה נוגדן התווית אנדודוגני או קולטנים מוגזם בשילוב עם גישות פרמקולוגית, שיטה זו מאפשרת זיהוי של מנגנונים מולקולריים הוויסות ביטוי המשטח של GluR על ידי מודולים תהליכי הפנמה או מיחזור.

גישה האכלה נוגדן כדי לחקור את הסחר בקולטן גלוטמט בתרבויות היפוקמא העיקרי ההיפוקיים

אנו מציגים פרוטוקול כדי לתייג ולנתח נוירונים באמצע, אשר קריטי להערכת שינויים מורפולוגיים פוטנציאליים בנוירונים ובקוצים הדנדריטים שעלולים להיות מומים נוירוכימיקלים והתנהגותיים.

בליסטי לתיוג של הנוירונים בתוך המוח בפרוסות ובתרבות התא הראשוני

כאן, אנו מדגימים כיצד לשלב טרנספקציה של נוירונים מכרסמים ראשוניים בהיפוקמפוס עם הדמיה קונפוקלית של תאים חיים כדי לנתח השפעות פתולוגיות המושרות על ידי חלבונים על הובלה אקסונלית ולזהות מסלולים מכניסטיים המתווכים השפעות אלה.

שימוש בדימות תאים חיים כדי למדוד את ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס

חקור את שיטת Stripe Assay להערכת פעילות דוחה או מושך של מולקולות הדרכה באקסונים באמצעות נוירונים מהיפוקמפוס מבודדים. שיטה זו מאפשרת ניתוח בו-זמני של מספר רב של קוני צמיחה.

Stripe Assay לחקר פעילות דוחה או מושך של מצע חלבון באמצעות ניתק נוירונים בהיפוקמפוס

גלה סרטונים נוספים