Name: בידוד של ענק Lampbrush כרומוזומים מחי ביציות של צפרדעי סלמנדרות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: למדו לבודד כרומוזומי Lampbrush ענקיים מביציות דו-חיים לצפייה חיה וניתוח מולקולרי. שיטה זו מאפשרת חקר מבנה כרומוזומים, תעתיק RNA ותהליכי מולקולריים בביולוגיה התאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R01 GM33397. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. ג'יי ג'י הוא פרופסור לגנטיקה התפתחותית של האגודה האמריקאית לסרטן.

<ol><li>Purkinje, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPurkinje%2C+JE+%22Symbolae+ad+ovi+avium+historiam+ante+incubationem%22">Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem</a>. , Leopold Vossi. (1830).</li>
<li>Rückert, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zur+Entwickelungsgeschichte+des+Ovarialeies+bei+Selachiern%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Anz%22%5BJournal%5D)">Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern.</a> Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).</li>
<li>Callan, H. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCallan%2C+HG+%22Lampbrush+Chromosomes%22">Lampbrush Chromosomes</a>. 36, Springer-Verlag. (1986).</li>
<li>Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C. Lampbrush chromosomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGall%2C+JG+%22Xenopus+laevis%3A+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology%22">Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology</a>. Kay, B. K., Peng, H. B. Vol. 36 Methods in Cell Biology , Academic Press. 149-166 (1991).</li>
<li>Gall, J. G., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+contents+of+isolated+Xenopus+germinal+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles.</a> Methods. 51, 45-51 (2010).</li>
<li>Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tips+and+tricks+for+preparing+lampbrush+chromosome+spreads+from+Xenopus+tropicalis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes.</a> Methods. 51, 37-44 (2010).</li>
<li>Morgan, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+oocyte+nuclei%3A+cytological+preparations+of+active+chromatin+and+nuclear+bodies+from+amphibian+germinal+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles.</a> Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).</li>
<li>Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oocyte+nucleus+isolated+in+oil+retains+in+vivo+structure+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions.</a> Biotechniques. 13, 238-246 (1992).</li>
<li>Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies%2C+nucleoli%2C+and+speckles+in+the+Xenopus+oocyte+nucleus+have+a+low-density%2C+sponge-like+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure.</a> Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).</li>
<li>Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+images+of+RNA+polymerase+II+transcription+units%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Live images of RNA polymerase II transcription units.</a> Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).</li>
<li>Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octagonal+nuclear+pores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Octagonal nuclear pores.</a> J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).</li>
<li>Löschberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+visualizes+the+eightfold+symmetry+of+gp210+proteins+around+the+nuclear+pore+complex+and+resolves+the+central+channel+with+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution.</a> J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).</li>
<li>Gottfert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coaligned+dual-channel+STED+nanoscopy+and+molecular+diffusion+analysis+at+20+nm+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution.</a> Biophys J. 105, L01-L03 (2013).</li>
<li>Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+incorporation+by+isolated+amphibian+oocytes%3A+III.+Optimum+incubation+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions.</a> J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).</li>
<li>Bridger, J. Fluorescence in situhybridization to DNA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBridger%2C+J+%22Cells%3A+A+Laboratory+Manual%22">Cells: A Laboratory Manual</a>. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111.111-111.136 (1998).</li>
<li>Singer, R. H. In situ hybridization to RNA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSinger%2C+RH+%22Cells%3A+A+Laboratory+Manual%22">Cells: A Laboratory Manual</a>. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111-116 (1998).</li>
<li>Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C. Jr, Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+intronic+sequence+RNA+%28sisRNA%29%2C+a+new+class+of+noncoding+RNA+from+the+oocyte+nucleus+of+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis.</a> Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).</li>
<li>Talhouarne, G. J., Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lariat+intronic+RNAs+in+the+cytoplasm+of+Xenopus+tropicalis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes.</a> RNA. 20, 1476-1487 (2014).</li>
<li>Duryee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+nuclei+and+non-mitotic+chromosome+pairs+from+frog+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Exp.+Zellforsch%22%5BJournal%5D)">Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs.</a> Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

התצפית הראשונה של LBCs &quot;החיים&quot; מתוך Gvs מבודדים יד של צפרדעים וסלמנדרות נעשו לפני כמעט 80 שנה על ידי הביולוג האמריקני ויליאם Duryee, 19 לפני כניסתה של בניגוד שלב מיקרוסקופיה DIC, לפני immunostaining פלורסנט, ולפני FISH. היתרונות של LBCs לחקירת פרטים של מבנה הכרומוזום שעתוק על הפיתוח הנדרש רמת גן היחידה של טכניקות כדי לצרף את LBCs שקופיות זכוכית, לתקן אותם באופן מציאותי, ועל מנת ליישם שיטות מולקולאריות מבלי להרוס המורפולוגיה הבסיסית שלהם. כמעט כל טכניקה כדי להש...

רוב בעלי החוליות, למעט, יש לציין של חיות כיס ויונקי שליה, לייצר ביציות yolky גדולות. למרות גודלם לפעמים עצום, ביצים אלה הם תאים בודדים שמגיעים מימד הסופי שלהם ועדיין בשחלה של הנקבה. ביצי השחלות נקראות ביציות וכל בדרך כלל בנוי מגרעין ענק יחיד, ידוע מאז 19 בתחילת המאה ה כמו השלפוחית הנבטיה או פשוט GV. 1 ביציות צפרדעי המעבדה המשותפות, laevis Xenopus ו tropicalis Xenopus, להגיע בקוטר מקסימאלי של 1.2 מ&quot;מ ו 0.8 מ&quot;מ בהתאמה (איור 1). Gvs מ ביציות בוגרות של שתי צפרדעים אלה הם 0.3 - 0.4 מ&quot;מ קוטר (איורים 2, 3). סלמנדרות בדרך כלל יש גם ביציות גדולות Gvs. מלא ביציות בוגרות של אקסולוטל המקסיקני, Ambystoma mexicanum, יותר מ -2 מ&quot;מ קוטר ואת GV היא כ 0.5 מ&quot;מ. לפיכך, גרעינים אלה גלויים בקלות בעין בלתי מזוינת פחיתלטפל בדרכים רבות כי הם בלתי אפשריים עם הגרעינים של תאי סומטיים טיפוסיים. לא פחות מדהים הוא בגודל הענק של הכרומוזומים בתוך GV, עובדה המוכרת כבר בסוף המאה ה -19. כרומוזומים בודדים של Ambystoma וסלמנדרות אחרות יכולים להיות עד 1 מ&quot;מ האורך (איורים 4, 5). אלה של Xenopus הם ניכרים קטנים, אם כי עם אורכים עד 100 מיקרומטר או יותר, הם מגמדים את הכרומוזומים סומטיים הטיפוסיים של רוב האורגניזמים. תכונה חשובה של כרומוזומים ביצית היא פעילות התעתיק יוצאת הדופן שלהם, מה שמוביל לאחת תכונות המורפולוגיות האופייניות להם - מאות לולאות לרוחב לזווג (איור 5). לולאה כל מורכב אחד או כמה יחידות שעתוק כי פעיל לסנתז RNA. הלולאות לתת ביצית הכרומוזומים מראה מטושטש, מה שהוביל את השם &quot;lampbrush&quot; כרומוזום לאחר השטחי שלהםדמיון המברשות בשימוש בתקופות קודמות לנקות ארובות מנורת נפט. 2 ההתמקדות של מאמר זה היא על השימוש Gvs מבודד ללמוד LBCs האברונים גרעיניים (nucleoli, גופי מוקד היסטון, ואת כתמים). שני די טכניקות שונות יתוארו. בחלק הראשון, הטכניקה הנפוצה יותר, Gvs מבודד בתוך תמיסת מלח באמצעות המלקחיים של צורף, שטוף בקצרה להסיר חלמון חסיד, ואת מעטפת הגרעין מוסרת, שוב עם המלקחיים של צורף. התכנים הדביקים, המכילים את LBCs האברונים גרעיניים, מותר להתיישב לשקופית מיקרוסקופ זכוכית או coverslip. הכנות כזה ניתן לבדוק באופן ישיר על ידי בניגוד שלב או מיקרוסקופיה DIC. לחלופין, ההכנות ניתן centrifuged לצרף את LBCs האברונים לשקופית או coverslip. הכנות כזה יכול להיות מעובד מכן לניתוח מולקולרי מפורט של חומצות גרעין וחלבונים, בעיקר על ידי immunofluorescence ו fluorescent הכלאה באתרו (FISH). 3-7 טכניקה שנייה כרוכה בידוד של GV בשמן מינרלים. 8 Gvs-מבודד שמן נשאר פעיל תעתיק במשך שעות רבות מועיל פוטנציאלי עבור מחקרים שבם אחד לא רוצה את התוכן הגרעיני להיות מציאותי ככל האפשר. 9,10 בגלל מקדם השבירה של &quot;מוהל&quot; הגרעין קרובה לזו של LBCs האברונים גרעיניים אחרים (איור 3), טכניקות Microscopical יכול להיות אתגר עם Gvs שמן-מבודד. לבסוף, בגלל הגודל וקל מניפולציה שלהם, Gvs הוא חומר אידיאלי עבור מחקרים על מעטפת הגרעין. המתחם הנקבובי הגרעין תואר לראשונה ממחקרים מיקרוסקופים אלקטרונים על מעטפות GV דוחות 11 ותצפיות superresolution אחרונות יותר השתמש באותו חומר. 12,13

<table><tbody><tr><td>פרפורמלדהיד (דרגת ריאגנט, גבישי)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6148-500G</td><td>למרות אזהרות בפרוטוקולים רבים, ניתן לאחסן תמיסה מרוכזת ללא הגבלת זמן ב-RT</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-100G</td><td>המכונה לפעמים MS-222</td></tr><tr><td>Ethicon RB-1 1/2 נקודת התחדדות מעגל 3-0 תפרים</td><td>VWR&nbsp;</td><td>95057-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast (שעוות פרפין)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3558-1KG</td><td></td></tr><tr><td>p-Phenylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>מכולת</td><td></td><td>מסחרית Knox ג'לטין עובד בסדר</td></tr><tr><td>ProLong זהב אנטי-דהייה Mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי חותם זהב&nbsp; 22 x 22 מ"מ #1 1/2 (עובי 0.16 - 0.19 מ"מ)מדעי</td> <td>מיקרוסקופיית אלקטרונים</td><td>63786-01</td><td>כיסויים אלה הם העובי המומלץ למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה</td></tr><tr><td>מלקחיים דומונט #5</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>72700-D</td><td></td></tr><tr><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx שמן פרפין (קל)&nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>PX0047-1</td><td>לבידוד GVs בדבק שמן</td></tr><tr><td>in situ PCR ותאי הכלאה (25 ומיקרו; L)</td> <td>תאי שקופיות מסגרת-איטום</td> <td>של BioRad</td> #SLF0201 <td>http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers</td></tr><tr><td>מבודדי סיליקון</td><td>Grace-Biolabs</td><td>בחר מתוך קישור לקטלוג</td><td>http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html</td></tr><tr><td>צנצנות קופלין וכלי צביעה</td> מדעי <td>מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>בחר מקישור</td> <td>הקטלוגhttp://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx</td></tr></tbody></table>

בידוד של ענק lampbrush כרומוזומים מחי ביציות של צפרדעי סלמנדרות

Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

אנו מתארים שיטות ללימוד הכרומוזומים lampbrush הפעילים הענקים תעתיק (LBCs) נמצאים הביצית, או ביצה תאבה מין, צפרדעים וסלמנדרות. LBCs פרט יכול להיות עד 1 מ&quot;מ אורך והם מתגוררים גרעין ענק, עצמו עד 0.5 מ&quot;מ קוטר. גודלו של הכרומוזומים מתיר תצפיות ללא תחרות של גנים פעילים ידי מיקרוסקופיה אופטית האור, אבל בעת ובעונה אחת טכניקות מיוחדות נדרשים לבידוד הגרעין, הסרת מעטפת הגרעין, והפצת הכרומוזומים בשקופית מיקרוסקופ. גרעין הביצית, הנקרא גם השלפוחית ​​הנבטיה (GV), מבודד מדיום המאפשר gelling החלקית של תקטין הגרעיני ושמר את המבנה העדין של LBCs. שלב זה מתבצע באופן ידני תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מלקחיים של צורף. בשלב הבא, מעטפת הגרעין מוסר, שוב באופן ידני עם מלקחיים של צורף. תכני הגרעין מועברים במהירות מדיום disperses הג&#39;ל יקטין ומאפשר LBCs הניזוק להתיישב לשקופית מיקרוסקופ. בשלב זה LBCs האברונים גרעיניים אחרים ניתן לצפות על ידי בניגוד שלב או מיקרוסקופיה התערבות הפרש לעומת זאת, אם כי פרטים עדינים מטושטשים על ידי תנועה בראונית. להסתכלות Microscopical ברזולוציה גבוהה או ניתוח מולקולרי, הכנת כולו centrifuged לצרף את LBCs עדין בתוקף לשקופית. קיבעון קצר paraformaldehyde לאחר מכן על ידי מכתים immunofluorescent או הכלאה באתרו. LBCs נמצא במצב תעתיק פעיל הגודל העצום שלהם מאפשר ניתוח מולקולרי ברמת הגן הבודדה באמצעות confocal או מיקרוסקופ ברזולוציה סופר.

כדי לבחון הכרומוזומים lampbrush ענק אחד מתחיל על ידי בידוד ביציות מתוך צפרדע או סלמנדרה. איור 1 מציג קבוצה של ביציות בוגרות בתמיסה בופר לאחר הסרה מההשחלה של הצפרדע, Xenopus. ביציות כזה להישאר במצב טוב במשך ימים בטמפרטורת החדר. הגרעין (או השלפוחית נבטיה) מוסר אז מן ביצית עם המלקחיים של צורף, בין בהליך תמיסת מלח (איור 2) או בשמן (איור 3). תכני הגרעין של גרעין שמן-מבודדת ניתן לבדוק בעדינות מו...

אנו מציגים טכניקות פשוטות לבידוד הכרומוזומים lampbrush פעיל תעתיק ענק לחיות ביציות של צפרדעים סלמנדרות. בהמשך נתאר כיצד להתבונן הכרומוזומים הללו &quot;חי&quot; על ידי בניגוד שלב או התערבות ההפרש לעומת זאת, וכיצד לתקן אותם ניאון הכלאה באתרו או מכתים immunofluorescent.

בידוד של ענק Lampbrush כרומוזומים מחי ביציות של צפרדעי סלמנדרות

We describe methods for studying the giant transcriptionally active lampbrush chromosomes (LBCs) found in the oocyte, or unlaid egg, of frogs and ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד את הגרעין הענק, או השלישיית-ביצית (germinal vesicle), מאוציט של דו- amphibian, ולפרוס את כרומוזומות מברשת המנורה (lampbrush chromosomes) ואורגניזים גרעיניים אחרים על סמיכה של מיקרוסקופ לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית, היברידיזציה in situ וטכניקות מולקולריות אחרות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע למבנה הבסיסי של כרומוזומים, גוף הגרעין (nucleoli) ואורגניזים גרעיניים אחרים, וכן לפרטים מולקולריים של תעתוק, שחבור ויצוא של RNA. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא הקלות שבה ניתן לבחון את מבנה הכרומוזומים והתעתוק באמצעות מיקרוסקופיה אורית קונבנציונלית, תוך שימוש באימונופלואורסצנציה, היברידיזציה in situ וטכניקות מולקולריות אחרות.את הפרוצדורה תדגים ד"ר Zehra Nizami, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. לאחר הכנת כל התמיסות הדרושות, הרכיבו שקופיות עם בארות, המורכבות משקופיות זכוכית שעברו תתי-הצמדה, אליהן הוצמדו בארות פלסטיק באמצעות פאראפין, כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, אספו רקמת שחלה שנאספה מבעבר מדוקרסית (נקבה) בוגרת של צפרדע או סלמנדרה, ומלאו צלחת פטרי קטנה בתמי EOF לתרביתB אוציטים.העבירו חלק מהרקמה המבודדת, כזה המכיל כ-10 עד 20 oocytes, אל צלחת זו. לאחר מכן, זהו oocyte בודד והשתמשו בשני זוגות פינצטות עדינות כדי לנתק את הגבעול המחבר אותו לדופן השחלה. לאחר שהושלך, העבירו את ה-oocyte לכלי פטרי חדש המכיל תוך בידוד של שלב ה-germinal vesicle, או GV.תחת הגדלה נמוכה, אתרו את הקוטב האנימלי של התא ביצית, שניתן לזהותו לפי צבעו הכהה. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי ליצור חור גדול ליד הקוטב האנימלי והמשיכו לסחוט בעדינות החוצה את גרעין התא ביצית השקוף, המכונה גם GV. לאחר מכן, גלגלו את ה-GV הרחק מכל חלמון שהוצא גם הוא. כדי להסיר חלמון שנותר דבוק היטב, שאבו את הגרעין פנימה והוציאו אותו מפיפטה עם טיפ שקוטרו גדול מעט מקוטרו של ה-GV. לאחר איסוף ה-GV של צפרדע, העבירו אותו מיד לתווך פיזור (dispersal medium) על מנת למנוע התקשחות גרעינית שתפריע לשלבים הבאים.בשלב הבא, בעזרת שני זוגות פינצטות, תפסו את המעטפת הגרעינית קרוב לחלקו העליון של ה-GV, תוך הקפדה לא ללחוץ כלפי מטה. תוך כדי אחיזה במעטפת, משכו את שתי הפינצטות לצדדים; תכולת הגרעין צפויה לצאת החוצה. כדי לאסוף תכולות אלו, הכינו תחילה פיפטה מתכווננת של 20 microliter בעלת טיפ קטום, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.לאחר מכן, שאי מהצלחית 5 µL של נוזל פיזור, ולאחריהם 5 µL מהתמיסה המכילה את תכולת ה-GV. לאחר איסוף התכנים הללו, העבר אותם לזכוכית עם שקע המלאה בתמיסות פיזור. ודא כי לנוזל שבשקע יש פני שטח קמורים כדי למנוע לכוד בועות בשלבים הבאים.לאחר מכן, מקמו כיסוי זכוכית בן 18 מילימטרים מעל הבאר והניחו את השקף המורכב בתא לחות למשך 10 עד 60 דקות. במהלך זמן זה, צפו שהג'ל הגרעיני יתפזר באיטיות, כך שהכרומוזומים והאברונים הגרעיניים ינחו על פני הזכוכית. לאחר הוצאת גרעין מתא ביצית של סלמנדרה, השאירו אותו במדיום הבידוד.שימו לב שבועות הגרמינליות (GVs) של הסלמנדרה, בניגוד לאלו של מיני הצפרדעים שנעשה בהם שימוש כאן, לא יתקשו יתר על המידה בתמיסה זו. הסירו את המעטפת הגרעינית מה-GV של הסלמנדרה באמצעות אותה טכניקה מבוססת פינצטה כפי שתוארה עבור צפרדעים. לאחר מכן, שאבו את תכולת הגרעין הג'לטינית קלות באמצעות פיפטה בעלת קצה חתוך, והעבירו את הג'ל לצלחת פטרי המכילה תמיסת פיזור.שטפו במהירות את הפיפט בתוך תמיסת הפיזור, והשתמשו בו כדי לאסוף את הג'ל הגרעיני. לאחר מכן, העבירו את הג'ל לשקף בעל באר, הוסיפו כיסוכית, ואפשרו לג'ל להתפזר כפי שתיארו בעבר. השתמשו במיקרוסקופ ניגודיות פאזה (phase-contrast) כדי לבחון את תכני הגרעין, וזהו את כרומוזומיי מברשת הלמידה, המסומנים כ-LBCs, לפי גודלם הגדול והלולאות הצידיות הזוגיות שלהם.לאחר אישור כי ה-LBCs אינם שבורים, הכין את העגילה לצנטריפוגה על ידי הנחת פיסת נייר סינון על לוכית הכיסוי. לאחר מכן, לחץ כלפי מטה כדי להסיר נוזלים עודפים מהתא. לאחר מכן, הוסף וזלין לשולי לוכית הכיסוי.חממו מוט מתכת לטמפרטורה של כ-70 עד 80 °C והשתמשו בו כדי להמיס את הג'לי ולאטום את זכוכית הכיסוי אל הפלסטיק שמתחתיה. חזרו על הליך זה עבור שקופיות נוספות עם LBCs באיכות טובה. לאחר שהודבקו כל זכוכיות הכיסוי, מקמו את השקופיות במנשאות לצנטריפוגה וודאו שמנשאות מוליות מאוזנות.באמצעות פונקציית ההתנעה האיטית (slow start), סובבו את השקיפות בצנטריפוגה כפי שמתואר בטקסט תוך שימוש בנשאיות שהוכנו באופן מיוחד. לחלופין, ניתן להשתמש בצנטריפוגה שולחנית סטנדרטית, שבה השקיפות מודבקות באמצעות סרט דביק לצלחת ומסובבות. כדי להכין את התכנים הגרעיניים לצביעה אימונוהיסטוכימית או להיברידיזציה in situ, נגבו תחילה את חסם הוואזלין הזמני בעזרת להב תער, ולאחר מכן הניחו את השקיפה למסגרת של כלי צביעה סטנדרטי לשקיפות.בשלב הבא, הוסיפו מספיק פאראפורמאלדהיד כדי לכסות את השקופיות. לאחר השקיעה, השתמשו בפינצטה קהה כדי להסיר ולהשליך כל זכוכית כיסוי. השאירו את השקופיות במקבע למשך 15 עד 30 דקות.לאחר הקיבוע, הניחו שקופית בתוך כלי צביעה המכיל PBS קר במיסוך קרח. לאחר מכן, הכניסו להב תער sharp בקצה הריבוע הפלסטי, ושחררו את הבאר הפלסטית הזו. לאחר שפעולה זו חזזרה על כל השקופיות, המשיכו בצביעה כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט.בתמונה זו, המצולמת בהארת שדה חשוך, נראים התכנים הגרעיניים של GV בודדת של אקסולוטל בשלב הפרופזה של המהלוח הראשון, אשר נאספו והוכנו באמצעות הפרוטוקול המתואר. ניתן להבחין ב-14 LBCs זוגיים וגדולים, וכן בגרעינוני מוגברים. צביעה נוספת של תכשיר זה, באמצעות נוגדן נגד RNA polymerase II זרחני, המוצגת כאן בירוק, חושפת את מיקומי גופי לוקוס ההיסטון ומספקת תובנה לגבי הפעילות התעתית העוצמתית של כרומוזומי התא ביצית אלו.הגדלה גבוהה יותר של LBC בודד של אקסולוטל, במקרה זה כזה שנצבע בירוק עבור RNA polymerase ובכחול עבור DNA, מדגימה את המאפיין המורפולוגי הייחודי ביותר של כרומוזומים אלו. מאות לולאות צדדיות זוגיות, שכל אחת מהן מייצגת לפחות יחידת שעתוק אחת המסנתזת RNA באופן פעיל. השוואה עם LBC של צפרדע שנצבע באופן דומה, אשר צולם באותה הגדלה, מדגישה את הפרש הגדלים העצום בין כרומוזומים של צפרדע לאלו של סלמנדרה, הבדל המתאם את תכולת ה-DNA הכוללת של הגנומים של המינים בהם נעשה שימוש.עם זאת, אפילו בכרומוזום של הצפרדע, ניתן לראות את יחידות השעתוק הבודדות כלולאות של כרומטין הבולטות לצדדים מתווך הכרומוזום, כפי שניתן לראות בתמונה זו בהגדלה גבוהה יותר. ציגות של דגים, עופות, זוחלים וחלק מהחסר-חוליות מכילות אף הן כרומוזומי מברשת-מנורה (lampbrush chromosomes) ענקיים. באופן מרגש, כרומוזומי מברשת-מנורה נוצרים כאשר ראשי זרע מאורגניזמים אחרים, כולל בני אדם, מוזרקים אל תוך השכוית העוברית (germinal vesicle) של דו-חיים.ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן להכין סדרת פריסות AGV תוך שעה אחת, ולאחר מכן לבצע סרכוז וקיבוע בתוך שעה עד שעתיים נוספות. לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה לגבי אופן בידוד GV ופריסת כרומוזומי מברשת המנורה למחקר המשכי באמצעות גששים מולקולריים.

isolation-giant-lampbrush-chromosomes-from-living-oocytes-frogs

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

נתאר שיטה אשר מודד את קינטיקה של תחבורה יון של חלבונים בממברנה לצד ניתוח אתר ספציפי של שינויים קונפורמציה באמצעות הקרינה על תאים בודדים. טכניקה זו ניתנת להתאמה תעלות יונים, מובילי משאבות יונים יכול להיות מנוצל כדי לקבוע מגבלות המרחק בין יחידות משנה חלבון.

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

סרטון זה מדגים את הנהלים משמשים לגידול תרביות ראשוניות של...

סימולטני טרום והקלטת אלקטרו פוסט סינפטי מ<em&gt; Xenopus</em&gt; עצבי שרירי Co-תרבויות

אנו מתארים את האוסף של...

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

אנו מתארים שיטות למניפולציה של ביציות לא בשלות Xenopus laevis, הבשלת ביציות במבחנה לביציות והזרקת זרע תוך ציטופלזמית. פרוטוקול זה מאפשר פירוק של כמה חלבונים אימהיים וביטוי יתר של גנים מעניינים בעת ההפריה, ולכן הוא בעל ערך לחקר תפקידים של גורמים ספציפיים בהתפתחות עוברית מוקדמת.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

בקרת סינתזת חלבונים מתרחשת בעיקר בשלב התחלת התרגום, ליקויים בו קשורים להפרעות מגוונות. כדי להבין טוב יותר את האטיולוגיה שלהם, תיארנו כאן פרוטוקול המשתמש בביציות Xenopus laevis המעריך את התרגום של תעתיק mos בנוכחות מוטציה של גורם התחלת התרגום eIF4G1.

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

המנגנונים המולקולריים של דה-קונדנסטציה של כרומטין מיטוטי דחוס מאוד אינם מוגדרים כהלכה. אנו מציגים בדיקה נטולת תאים המבוססת על אשכולות כרומטין מיטוטיים שבודדו מתאי HeLa ותמצית ביצי Xenopus laevis המשחזרת נאמנה את תהליך העיבוי במבחנה.

תא Assay חינם לחקר הכרומטין Decondensation בסוף מיטוזה

אנו מציגים שיטה לדור של במבחנה עצמית מתמשכת mitotic תנודות ברמת תא בודד על-ידי לבצע תמציות ביצה של צפרדע רפואית זריזה microemulsions מים בתוך שמן.

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

למדו לבודד כרומוזומי Lampbrush ענקיים מביציות דו-חיים לצפייה חיה וניתוח מולקולרי. שיטה זו מאפשרת חקר מבנה כרומוזומים, תעתיק RNA ותהליכי מולקולריים בביולוגיה התאית.

בידוד של ענק Lampbrush כרומוזומים מחי ביציות של צפרדעי סלמנדרות

גלה סרטונים נוספים