אסטרטגית ראפיד עבור הבידוד של ניו Faustoviruses ממדגמים סביבת שימוש

המטרה הכללית של אסטרטגיית הבידוד החדשה הזו היא להגדיל את מספר בידודי הנגיפים החדשים כדי לחקור את הפאן-גנום של משפחת נגיפים חדשה זו, ולהבין טוב יותר את המערכות האקולוגיות שלהם ואת הפתוגניות הפוטנציאלית שלהם לבני אדם. שיטה זו יכולה לספק תשובות לשאלות מפתח בתחום הווירולוגיה, ולסייע לווירולוגים ברחבי העולם המעוניינים בחיפוש נגיפי ענק ובמיוחד Faustoviruses. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מציגה שיפורים במספר שלבים, כגון תערובת האנטיביוטיקה והאנטי-פטרייתיים, מצע הרעב החדש המותאם לאמבה והשימוש בציטומטריית זרימה לזיהוי ליזיס מהיר ורגיש יותר. לאחר איסוף דגימות מים מזוהמים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכינו את תא המאחסן, V. vermiformis, על ידי הוספת האמבות לבקבוק תרבית תאים של 75 square centimeter עם 30 milliliters של protease peptone yeast extract glucose, או מצע PYG, והדגירו בטמפרטורה של 28 °C למשך 48 שעות. השתמשו בלוחיות ספירה כדי לספור את האמבות, וכאשר הן מגיעות לריכוז של 5×10⁵ עד 10⁶ תאים ל-milliliter, אספו את התאים באמצעות סרימרגציה ב-720 ×g למשך 10 דקות.

שאבו את הנוזל העליון, והשתמשו ב-30 milliliters של תמיסת Page's amoebal saline סטרילית או PAS כדי להשעות מחדש את משקע האמבה. לאחר שטיפת המשקע פעם שנייה, השתמשו ב-30 milliliters של מצע הרעבה, המכיל אנטיביוטיקה וחומר נוגדי פטריות, כדי להשעות את התאים בריכוז של כ-10 to the 6th אמבות ל-milliliter. מצע ההרעבה מאפשר לאמבות להישאר בחיים ללא התכנסות לציסטות או התרבות.

בשלב הבא, זרעו 200 µL של אמבה לבארות של פלטת 96 באערים בעלת תחתית שטוחה והדגירו בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, לאחר ערבול ב-vortex של דגימות המים למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, החדירו 25 µL מכל דגימה אל תאי האמבה, והשאירו שתי בארות ללא דגימה כביקורות שליליות. כדי למנוע התאיידות, הניחו את הפלטה המכילה את התרבית הראשונית בתוך שקית עם קומפרס רטוב, והכניסו את התא הלח הכולל את הפלטה לאינקובטור בטמפרטורה של 30 °C.

שלושה ימים לאחר ההחדרה הראשונה, העבירו תרבית משנית (sub-culture) מצעת התרבית הראשונית אל פלטת 96 בארות רעננה של אמבה כפי שהודגם כעת, ללא תצפית מיקרוסקופית. הדגירו בטמפרטורה של 30 °C למשך שלושה ימים. לאחר מכן, בעזרת התרבית המשנית, הדרימו פלטה שלישית כפי שמתואר לעיל, והדגירו למשך יומיים.

על מנת לזהות ליזיס בצלחת השיתוף-תרבות הסופית, הפעילו את הציטומטר והריצו תהליך ניקוי ושטיפה בהתאם לפרוטוקול היצרן כדי להפחית את רעש הרקע. לביצוע רכישה אוטומטית מלאה של 40 דקות, הפעילו את הדוגם בעל התפוקה הגבוהה (high throughput sampler או HTS) כדי להטעין באופן אוטומטי דגימות מתוך פלטת 96 הבארות בהתאם לפרוטוקול היצרן. תכנתו את הגדרות ה-HTS כפי שרשום כאן, הכוללות נפח דגימה של 150 µL, נפח ערבוב של 50 µL, מהירות ערבוב של 180, מספר ערבובים של 5, נפח שטיפה בין דגימות של 400 µL, קצב זרימה של 2.5 µL לשנייה, ומספר אירועים מוקלטים של 10,000. לחצו על home כדי לאפשר ל-HTS לאתר את הפלטה. לאחר מכן, העריכו תחילה את בארות הביקורת השלילית המכילות את תאי האמיבה המארחים, על מנת לבצע gating לאוכלוסיית האמיבות ולקבוע את אחוז התאים בהתאם למאפייניהם הפיזיים. ודאו כי קיימת אוכלוסיית אמיבות הומוגנית ואוכלוסייה שנייה של אירועים מועטים יותר המתאימה לשאריות (debris) ולרעש. לאחר מכן, התחילו את ה-gating על ידי לחיצה על acquire sample.

לאחר מכן, בעזרת החץ המגדיר את השערים (gates), localized את אוכלוסיית האמבה הרלוונטית. לאחר הגדרה של לפחות 10,000 אירועים (events), לחצו על run כדי לאפשר למערכת ה-HTS להריץ באופן אוטומטי את כל הפלטה. בצעו רכישת נתונים וניתוח בהתאם לפרמטר הגודל forward scatter ולפרמטר המבנה side scatter. עיינו בטקסט לפרטים נוספים.

לאחר זיהוי הליזיס באמצעות פלוו-ציטומטריה, השתמש בפיפט כדי להעביר את תרביות המעורבבות שעברו ליזיס לצורך השהיית האמבות הנותרות. לאחר העברת 50 µL מכל דגימה לסליידים, בצע ציטוצנטריפוגה ישירה של התוךה במהירות של 800 ×g למשך 10 דקות.

בשלב הבא, השתמש במתנול טהור כדי לקבע את השקופיות, ולאחר מכן השאר אותן לייבוש בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע, טבול את השקופיות בתמיסת ESN שלוש פעמים למשך ארבע שניות בכל פעם, לפני הנחת השקופיות ב-blue-azur למשך שש שניות. לבסוף, טבול את השקופיות ב-PBS למשך 45 שניות.

השאירו את השקופיות להתייבש בטמפרטורת החדר לפני המעבר לתצפית. כדי לצבוע שקופיות מקובעות חדשות ב-DAPI, טפטפו 15 µL של DAPI לתוך השקופיות היבשות. בחנו את השקופיות תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 1000x כדי לבדוק נוכחות של מפעלי וירוס (virus factories).

לביצוע מיקרוסקופיה אלקטרונית, העבירו חמישה µL מהדגימה החיובית על גבי רשת שעברה פריקה 글로ו (glow-discharged), והדגירו בטמפרטורת החדר למשך כ-20 דקות. ייבשו את הרשת בזהירות, לאחר מכן הוסיפו כמות קטנה של 1% ammonium molybdate והדגירו למשך 10 שניות. לאחר הסרה זהירה של הטיפה, הניחו לרשת להתייבש במשך חמש דקות. לאחר מכן, כווןו את המיקרוסקופ האלקטרוני ל-200 keV. לאחר מכן, הניחו את הרשת על התומך והכניסו את התומך לתוך המיקרוסקופ. לחצו על סמל סקירת הוואקום ובדקו את הוואקום. לאחר מכן, סגרו את השסתומים, וכווןו את גודל הנקודה (spot size) ל-5 ואת ההגדלה ל-25,000 לפני תחילת התצפית. לאחר איתור וירוס ענק על מסך הרכישה, השתמשו בכלי המדידה כדי למדוד את הוירוס.

בצע ביולוגיה מולקולרית וריצוף גנום נגיפי בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

איור זה מציג תוצאות מזיהוי של שני Faustoviruses בהשוואה לבקרות שליליות מהימנות. הבקרה השלילית לליזיס הכילה אוכלוסיית אמבה של 86%. לעומת זאת, יותר מ-60% מהאמבות עברו ליזיס, כאשר אחוז השאריות הגבוה ביותר נמצא בדגימות החיוביות.

כפי שניתן לראות כאן, צביעות ESN ו-blue-azur צובעות את הגרעינים של תאי אמבה לא נגועים ונגועים, ואת נוכחותן של מפעלים ויראליים (virus factories) בתוך התאים הנגועים. צביעת DAPI מאשרת אף היא את נוכחותם של מפעלים ויראליים בתוך האמבה. בתמונות אלו, מיקרוסקופיה אלקטרונית חושפת את נוכחותו של Faustovirus במראה האופייני של מגה-ויראליס (mega-virus), המורכב מקפסיד איקוסהדרלי חסר סיבים ובגודל של 200 nanometers.

ברגע שהטכניקה נלמדה ובסיום השיתוף בתרבית (co-culture), ניתן לבצע את שיטת זיהוי הליזיס ואפיון הווירוס תוך שעה אחת, במידה והיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבקר את חיוניות האמבה ולבדוק זיהומים אפשריים. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות נוספות, כגון ביולוגיה מולקולרית המכוונת לווירוסים ענקיים, במטרה להשיב על שאלות נוספות כגון משפחת הווירוס ו/או הגנוטיפ.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הוירולוגיה לחקור משפחה ויראלית זו, את המארח הספציפי שלהם ואת הפתוגניות הפוטנציאלית שלהם. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד בקלות וירוסים ענקיים על ידי הרחבת מספר וסוגי הדגימות ובחירת תא המארח והתנאים התרביתיים המיטביים. זכרו כי עבודה עם וירוסים בעלי פוטנציאל פתוגני לבני אדם עלולה להיות מסוכנת ביותר, במיוחד עם דגימות של מי שופכים.

לכן, יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה במעבדות SB2 בתנאים מאובטחים, בעת ביצוע פרוצדורה זו.