גילוי Anastasis In Vivo מאת CaspaseTracker ביוסנסור

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות ולעקוב אחר היפוך תהליך מוות התאים לאחר הפעלת קספאז בבעלי חיים חיים באמצעות Drosophila melanogaster כמודל. בתגובה לגירוי המוות, תאים עוברים מוות תאי מתוכנת כגון אפופטוזיס שנחשב באופן מסורתי כמפל בלתי הפיך המוביל למוות תאי. עם זאת, מעניין לציין שלאחר הסרת גירוי המוות, חלק מהתאים הגוססים יכולים להפוך את תהליך המוות של התאים אפילו בשלב מאוחר.

באמצעות תופעת התאוששות תאים שהתגלתה לאחרונה הנקראת אנסטאזיס. מיקרוסקופ תאים חיים מראה שתאים גוססים אפופטוטיים מציגים סימני היכר מורפולוגיים ייחודיים, כגון קרום פלסמיד, עיבוי גרעיני והתכווצות תאים. באופן כללי, תאים אלה צפויים למות.

עם זאת, לאחר שטיפה ודגירה של התאים הגוססים במדיום טרי, הם עוברים אנסטאזיס, מתאוששים ויכולים להתחלק מאוחר יותר. קשה לזהות ולעקוב אחר אנסטאזיס בבעלי חיים מאחר שלא ניתן להבחין בין התאים המשוחלמים מבחינה מורפולוגית לבין התאים הבריאים שמסביב. כדי לפתור בעיה זו, פותחה מערכת החיישנים הביולוגיים CaspaseTracker של יונקים כדי לזהות ולעקוב אחר התאים שהופכים את תהליך מוות התאים לאחר ביצוע או הפעלת קספאז, סימן ההיכר של אפופטוזיס.

מערכת חיישנים ביולוגית זו מורכבת משני רכיבים: הטרנס-אקטיבטור הניתן להפעלה של קספאז, rtTA, ומדווח פעילות rtTA מבוסס Cre LoxP. בתאים בריאים, ללא פעילות קספאז, rtTA קשור לעוגן קרום פלזמה באמצעות מקשר DEVD הניתן לניתוק קספאז. מכיוון ש-rtTA קשור אינו יכול לעבור מציטוזול לגרעין, מדווח rtTA נשאר לא פעיל.

עם זאת, עם ההפעלה בתגובה לאינדוקציה של מוות תאי, קספאזות מבקעות את מקשר ה-DEVD, ומשחררות את ה-rtTA לעבור לגרעין כדי להפעיל את מדווח ה-rtTA. ברגע שנכנס לגרעין, ה-rtTA נקשר לאלמנט תגובת הטט, או TRE, ומפעיל ביטוי חולף של Cre recombinase, מה שמוביל לאירוע רקומבינאז בלתי הפיך שמסיר את קלטת קודון העצירה בין מקדם ה-CAG לרצפי הקידוד של החלבון הפלואורסצנטי האדום DsRed. התוצאה היא ביטוי קבוע של DsRed המשמש כסמן פלואורסצנטי קבוע לתאים שיכולים להישאר בחיים לאחר שחוו פעילות קספאז כמו גם צאצאיהם.

מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים מראה כי לאחר אינדוקציה של מוות תאי חולף, תאי החיישן הביולוגי של CaspaseTracker מבטאים DsRed במהלך ואחרי התאוששותם, ולכן מבדילים אותם מהתאים שלא התאוששו, המסומנים על ידי חיצים לבנים, כמו גם תאי החיישן הביולוגי של הבקרה שלא נחשפו לגירוי המוות התאי. מוות תאי מתוכנת, כגון אפופטוזיס, נחשב בדרך כלל לבלתי הפיך מכיוון שהוא מבוצע על ידי הרס תאים משתולל ומסיבי. עם זאת, אנו מוצאים כי התא הגוסס יכול למעשה להתאושש גם בשלב מאוחר שנחשב כנקודת האל-חזור, כגון לאחר שחרור ציטוכרום c, הפעלת קספאז-3, נזק ל-DNA, קרום פלזמה, התכווצות תאים והיווצרות גופים אפופטוטיים.

קראנו לזה היפוך של תהליך מוות תאי אנסטאזיס, שפירושו לעלות לחיים ביוונית. באמצעות מיקרוסקופ תאים חיים, אנו יכולים לצפות באנסטאזיס בתאים מתורבתים. עם זאת, זה מאתגר מבחינה טכנית לצפות באנסטאזיס בחיות חיות מכיוון שתא המוות המשוחזר יכול להיראות כמו תאים בריאים רגילים שלא ניסו מוות תאי כלל.

לכן, פיתחנו מערכת חיישנים ביולוגיים CaspaseTracker לאיתור ומעקב אחר אנסטאזיס בבעלי חיים חיים. גרסת הדרוזופילה של מערכת CaspaseTracker היא חיישן ביולוגי כפול המורכב משני רכיבים: גורם השעתוק הניתן להפעלה על ידי קספאז, GAL4, ומדווח הפעילות GAL4, הידוע בשם G-TRACE. בתאים ללא פעילות קספאז, גורם שעתוק השמרים, GAL4, קשור לתחום עוגן של קרום פלזמה באמצעות מקשר DQVD הניתן לניתוק קספאז.

עם הפעלת ה-caspase, caspases מופעלים מבקעים את מקשר ה-DQVD כדי לשחרר את GAL4, אשר לאחר מכן עובר לגרעין כדי להפעיל את מדווח G-TRACE. ה-GAL4 הגרעיני נקשר לרצפי ההפעלה הספציפיים במעלה הזרם, בקיצור UAS, כדי לעורר ביטוי חולף של RFP, המשמש כמדווח על פעילות הקספאז האחרונה או הנוכחית עד להפסקת פעילות הקספאז וה-GAL4 וחלבון ה-RFP מתפרק. GAL4 גם מפעיל את הביטוי של הרקומבינאז FLP, מה שמוביל לאירוע רקומבינאז שמסיר את קלטת העצירה בין היוביקוויטין, הקיצור Ubi, המקדם ורצפי הציפוי עבור ה-GFP הממוקד גרעיני.

התוצאה היא ביטוי קבוע של GFP גרעיני, המשמש כסמן קבוע לתאים שחוו פעילות קספאז אך נשארו בחיים כמו גם לצאצאיהם. לכן, מערכת זו יכולה לזהות תאים עם פעילות קספאז מתמשכת או אחרונה על ידי אות ה-RFP החולף ופעילות קספאז בעבר עם אות ה-GFP הקבוע. לחיישן ביולוגי בקרה יש את המוטציה DQVA באתר מחשוף הקספאז, שאינו רגיש לפעילות קספאז.

זבובים בתוליים GAL4 רגישים ל-Caspase הוכלאו עם זבובים זכרים צעירים G-TRACE, או להיפך, כדי ליצור את זבובי CaspaseTracker. כדי לבדוק את הפיכות תהליך מוות התאים לאחר הפעלת קספאז, הזבובים נחשפים תחילה ללחץ סביבתי חולף הגורם למוות תאי, כגון הלם קור או רעב חלבונים. לאחר מכן הזבובים הלחוצים מועברים בחזרה לתנאי תרבית רגילים להתאוששות.

רקמות התקבלו מתאי הביציות בשחלות מזבובי הביקורת, הלחוצים או המתאוששים. הדגימות עברו מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לזהות את האותות הפלואורסצנטיים של החיישן הביולוגי CaspaseTracker. בתור התחלה, DQVD GAL4 מורדם, שנסגר לאחרונה ורגיש לקספאז, זבוב באמצעות פחמן דו חמצני, ובעזרת מכחול, מעביר 7 עד 10 נקבות בתולות לבקבוקון מזון טרי עם כף קטנה של רסק שמרים.

הזדווג את הנקבות עם 7 עד 10 זכרים צעירים, מדווח G-TRACE GAL4. זבובים בתוליים שזה עתה נסגרו מראים את המקוניום הירוק הכהה, המסומן על ידי חיצים, שהם שאריות של מזון זחלים. הזבובים הסגורים החדשים נוטים להיות גדולים יותר מהזבובים הבוגרים.

לזכרים יש בטן כהה יותר, המסומנת על ידי עיגולים, והם נוטים להיות קטנים יותר מהנקבות. הגדר את הצלב ב-18 מעלות צלזיוס כדי להפחית אותות לא ספציפיים מהחיישן הביולוגי CaspaseTracker בצאצאים מכיוון שפעילות GAL4 עולה עם הטמפרטורה. כל שלושה עד שבעה ימים, העבירו את הבוגרים לבקבוקון חדש עם רסק שמרים עד שהפרודוקטיביות שלהם פוחתת.

כאשר הצאצאים סגורים, חברו את הזבובים לשני הטרנסגנים של GAL4 רגיש לקספאז ו-G-TRACE, אשר יתפקדו כצאצאי CaspaseTracker זבובים. שתי התוספות מאוזנות על ידי Curly-O. אז לזבובים המכונפים שאינם מתולתלים יהיו שני טרנסגנים.

לבקרה שלילית, אסוף צאצאים טרנסגנים כפולים מהכלאה בין נקבות DQVA GAL4 שאינן רגישות לקספאז וזכרים מדווחים G-TRACE GAL4 או להיפך. מהכלאות הניסוי, העבירו קבוצות של 10 עד 20 זבובים נקבות סגורות לאחרונה לבקבוקונים חדשים עם רסק שמרים. הוספת כמה זכרים תעזור לנקבות לייצור ביציות.

העבירו את הזבובים שניזונו היטב ל-18 מעלות צלזיוס למשך יממה, כך שהשחלות שלהם ייצרו תאי ביצים באמצעות OO-genesis. לאחר מכן, כדי לגרום לתאי הביצים שלהם לעבור אפופטוזיס, השתמשו בשוק קר. מעבירים את הזבובים לבקבוקון חדש ללא אוכל ומקפיאים אותם בחום של 7 מעלות למשך שעה.

שיטה חלופית לגרום לאפופטוזיס בתא הביצים היא להשתמש בהרעבת חלבון על ידי שיכון הזבובים על 8 אחוז סוכרוז ומזון אגר 1 אחוז ב-18 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. החלף את בקבוקוני המזון ללא חלבון מדי יום בעת שימוש בשיטה זו. לאחר הלחץ, הזבובים בכל אחת מהשיטות מחזירים אותם למצב הדיור הרגיל ואוכלים עם משחת שמרים למשך שלושה ימים כדי לאפשר להם להתאושש.

מאוחר יותר נתחו את הזבובים הללו כדי לבודד את תאי הביציות והשחלות שלהם. לאחר הרדמתם, השתמשו בשני זוגות מלקחיים כדי להסיר את ראשם. לאחר מכן משוך את הזבובים בבסיס הבטן כדי להסיר את השחלות שלהם.

התכוננו לאסוף את השחלות על ידי ציפוי קצות פיפטות פלסטיק ב-1 אחוז BSA מומס במים או PBS כך שתאי הביצים לא יידבקו לקצות הפיפטה. לאחר ניתוח תאי הביצים, אספו אותם בקצוות מוכנים עם כחצי מיליליטר PBS. לאחר מכן העבירו אותם לצינור צנטריפוגה של מיליליטר אחד ואפשרו לביצים להתייצב.

המשך בהליך בתנאי תאורה חלשה או חשוכה לחלוטין כדי למנוע הלבנת תמונות של תגי הפלורסנט. שאפו מה-PBS וטענו 500 מיקרוליטר של ארבעה אחוז פרפורמלדהיד ב-PBS לתוך צינור הצנטריפוגה. נותנים לביצים לתקן במשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין.

הימנע מקיבוע ממושך, מכיוון שהוא ידלדל את האות של החלבונים הפלואורסצנטיים בתאי הביצים. לאחר התיקון, הסר את ה-PFA ושטוף את תאי הביצים עם 500 מיקרוליטר PBS-T שלוש פעמים. לאחר מכן דגרו את תאי הביצים עם PBS-T למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין כדי לחלחל לתאי הביצים.

למחרת בבוקר, הוסיפו 500 מיקרוליטר של PBS-T עם 5 מיקרוגרם של צבע גרעיני כחול, כמו Hoechst, לתאי הביצים. תנו להם לדגור בסיבוב עדין בטמפרטורת החדר למשך שעה עד שעתיים, אך לא יותר, אחרת האותות יהפכו ללא ספציפיים. לאחר מכן, שטפו את תא הביצים עם PBS-T שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל שטיפה.

לאחר מכן, בעזרת פיפטה עדינה, שאפו את כל ה-PBS-T ומרחו 200 מיקרוליטר של חומר הרכבה נגד הלבנה. הרקמות צפות על החלק העליון לפני שהן ספגו במלואן את חומר ההרכבה. דגרו את תא הביצים בסוכן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות עד לילה.

לאחר ספיגה מלאה של חומר ההרכבה, הרקמות שוקעות לתחתית הצינורות ומוכנות להרכבה. כדי להתחיל, מרחו ג'לי נפט על מגלשת הזכוכית או על החלקת הכיסוי כדי למנוע הרס תאי הביצים על ידי דחיסת יתר. כדי להרכיב את תאי הביצים המוכתמים, העבירו אותם עם 200 מיקרוליטר של חומר הרכבה למגלשת זכוכית וכסו אותם בתלוש כיסוי זכוכית בגודל 20 מילימטר רבוע.

אטום את החלקת הכיסוי עם לק והמשך באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. בתאי הביציות של השחלה בזבובי CaspaseTracker הבריאים לא הייתה פעילות חיישן ביולוגי של CaspaseTracker, מה שמצביע על היעדר פלואורסצנטיות ירוקה ואדומה. עם זאת, לאחר שחשפו את הזבובים ללחץ סביבתי הגורם למוות תאי, כגון רעב חלבונים במשך שלושה ימים, תאי הביצים עברו את תהליך מוות התאים עם הפעלת קספאז, מה שגרם לאותות חיישנים ביולוגיים של RFP ו-GFP.

לעומת זאת, מוטציה של אתר מחשוף הקספאז בזבובי הביקורת הלא רגישים לקספאז ביטלה את רגישות החיישן הביולוגי, מה שמצביע על כך שאותות החיישן הביולוגי תלויים בפעילות הקספאז. לאחר מכן זבובי החיישנים הביולוגיים המורעבים והרגישים לקספאז קיבלו מזון חלבוני למשך שלושה ימים. תאי הביצים של הזבובים ששוחזרו לא ביטאו את מדווח הקספאז החולף של RFP, מה שמצביע על כך שלא הייתה פעילות קספאז לאחרונה או מתמשכת.

חשוב לציין, תאי הביציות ששוחזרו ביטאו רק GFP, מה שמצביע על כך שהם הפכו את תהליך מוות התאים לאחר הפעלת הקספאז. אנסטאזיס נצפית גם in vivo לאחר מתח טמפרטורה הגורם למוות תאי חולף. בתגובה להלם קור, תאי הביצים הגוססים מבטאים את סמני החיישן הביולוגי RFP ו-GFP, המצביעים על פעילות קספאז עדכנית או מתמשכת, המיוצגת על ידי אות ה-RFP, ופעילות קספאז בעבר, המיוצגת על ידי אות GFP.

עם זאת, לאחר הפגת מתח על ידי חזרה למצב תרבית רגיל למשך שלושה ימים, תאי הביצים בזבובים ששוחזרו הציגו רק את מדווח הקספאז GFP, מה שמצביע על כך שהתאים בתאי הביצים הללו עברו אנסטאזיס בשלב לאחר הפעלת הקספאז. יש לציין כי אות GFP CaspaseTracker מגלה כי סוגי תאים מרובים בתוך תאי הביציות מסוגלים להפוך את תהליך מוות התאים ולתקן את הנזק מקספזות, כולל תאי קו נבט, כגון ביציות ותאי אחות, ותאי זקיק סומטיים. מעניין לציין ש-GFP תייג גם תאים בגרמריום, המכילים תאי גזע, יחד עם תאי הביציות הקשורים אליו באותה שרשרת שחלות.

לכן, ייתכן שתאי הביציות החיוביים ל-GFP נגזרו מתאי גזע שעברו אנסטאזיס. להלן תמונות המציגות את הרקמות המציגות את פעילות החיישן הביולוגי של CaspaseTracker ללא חשיפה ללחץ סביבתי. אלה הם חלקי הפה, המעי הקדמי, היבול, המעי האמצעי, המעי האחורי, צינוריות מלפיגיות, פי הטבעת, צינור הביצית והשחלות מנקבת זבוב מנותחת, שזה עתה נסגרה, זבוב נקבה ביום 0.

מיקרוסקופיה קונפוקלית חושפת את פעילות הקספאז האחרונה, כפי שמצוין על ידי RFP, ואת פעילות הקספאז הקודמת, המצוינת על ידי GFP. תמונות מוגדלות מראות את פעילות הקספאז האחרונה או המתמשכת והעבר באונה האופטית, הקרדיה, צינוריות מלפיגיאניות, המעי האחורי ודפנות השרירים בתאי הביצים שהתמקמו יחד עם כתם F-actin. רקמות מסוימות, כמו צינור הביצית, מדגימות רק פעילות קספאז בעבר.

פעילויות חיישנים ביולוגיות אלו מצביעות על פעילות הרדמה פוטנציאלית במהלך התפתחות עוברית או הומאוסטזיס תקין. זה יכול גם להצביע על פעילות קספאז לא אפופטוטית בהווה או בעבר. אנא עיין בכתב היד לפרטים נוספים.

החיישן הביולוגי של CaspaseTracker in vivo מדווח באופן ספציפי על פעילות Caspase מכיוון של-CaspaseTracker חסר הרגישות עם הרצף הלא ניתן לניתוק קספאז DQVA אין פעילות חיישן ביולוגי. האות היחיד כאן הוא האות הלא ספציפי של פלואורסצנטיות אוטומטית מפיגמנטים, קוטיקולה וגופי שומן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור לקבל הבנה כללית כיצד אנו יכולים להשתמש במערכת החיישנים הביולוגיים CaspaseTracker כדי לזהות ולעקוב אחר אנסטאזיס בבעלי חיים חיים.

חיישנים ביולוגיים אלה יכולים להקל על חקר המטבע והתפקוד הידוע של אנסטאזיס. לזיהוי טווח ההגעה שלהם יש מגוון רחב של יישומים פיזיולוגיים, פתולוגיים וטיפוליים. בעוד שחיישנים ביולוגיים אלה יכולים לזהות היפוך של אפופטוזיס לאחר הפעלת קספאז, הם יכולים גם לזהות את התאוששות התאים לאחר שהם מנסים צורות אחרות של מוות תאי הכרוכות במישרין או בעקיפין בפעילויות קספאז.

בעת תכנון ניסוי, חשוב מאוד לכלול בקרות הדדיות כדי להבחין בין אות החיישן הביולוגי הפלואורסצנטי שעוקב אחר תאי הרדמה מהתאים הגוססים עם פעילויות קספאז מתמשכות. התאים הבריאים עם פעילויות הקספאז האפופטוטיות הידועות בהווה או בעבר והפלואורסצנציה האוטומטית הלא ספציפית מאותות מהפיגמנט, השומן, וקריטי. אנא מצא את הדיון המפורט בגרסת ה-PDF של כתב יד זה.