אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד אוכלוסיות תאים בודדים מתאי מעיים דקים שונים שניתן להשתמש בהם לאחר מכן לניתוח ציטומטרי זרימה או אמצעי אפיון חלופי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באימונולוגיה רירית כמו כיצד המיקרוביוטה משפיעה על התפתחות מערכת החיסון של המעי. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהם מהירים, ניתנים לשחזור ואינם דורשים שיפועי פרקול מייגעים.

כדי להתחיל בהליך זה, הניחו את הצד הגבי של העכבר כלפי מטה ורססו את הבטן באתנול של 70 אחוז, בצעו לפרוטומיה על ידי חיתוך ברצף של העור ולאחר מכן פאשיה צפקית לאורך קו האמצע הגחוני מסימפיזה הערווה לתהליך הקסיפואיד, ובכך לחשוף את חלל הצפק. לאחר מכן, הפרד את המעי הדק מהקיבה על ידי מעבר הסוגר הפילורי. הסר בעדינות את המעי הדק מהצפק והקניט את השומן המזנטרי.

כדי להסיר את המעי הדק במלואו, בצע חתך שני בצומת האילאוצקלי. הנח את המעי הדק המבודד למדיום RPMI של ארבע מעלות צלזיוס המכיל 10 אחוז FBS כדי למקסם את כדאיות התא. הסר בעדינות חתיכות שומן גדולות באמצעות מלקחיים מעוקלים והיזהר כדי להימנע מקריעת רקמת המעי עצמה במהלך התהליך.

כדי להסיר את תכולת המעי, יש לשטוף את הקצה הפרוקסימלי של המעי הדק בעזרת מחט הזנה בגודל 18 המודבקת למזרק ולשטוף בעדינות את המעי עם 15 עד 20 מיליליטר PBS קר. השתמש במספריים כדי לכרות את מדבקות פייר הממוקמות בצד האנטימזנטרי של המעי הדק ומופיעות כמסה לבנה מרובת אונות. לאחר מכן, הנח אותם במדיום RPMI קר המכיל חמישה אחוז FBS.

לאחר מכן, חתכו את המעי הדק למקטעים של שלושה עד ארבעה סנטימטרים, הסירו את שאריות השומן על ידי גלגול כל קטע מעי דק על מגבת נייר לחה ב-RPMI והשתמשו באזמל עמום כדי להרחיק את השומן מהרקמה. הקפדה על הסרה מוחלטת של שומן מזנטרי היא קריטית להבטחת כדאיות הלימפוציטים מכיוון שאפילו חתיכות שומן זעירות עלולות לגרום לתאים. לאחר מכן, הפוך את הרקמה מבפנים החוצה על ידי קנולציה של מקטעי המעי עם מלקחיים מעוקלים ואחיזה בקצה הדיסטלי של הרקמה, ולאחר מכן השתמש בזוג מלקחיים ישרים כדי להסיר בעדינות את קטע הרקמה מהקצה הפרוקסימלי, וכתוצאה מכך הרקמה מתהפכת.

מניחים את מקטעי הרקמה בכוס המכילה 30 מיליליטר של אמצעי מיצוי ומוט ערבוב. מהדקים את המכסה על הפקק ומערבבים במשך 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. הערבוב צריך להיות נמרץ, אך לא סוער.

לאחר 15 דקות, השתמש במסננת פלדה כדי להפריד את חלקי הרקמה מהאפיתל המכיל סופרנטנט שאמור להיראות מעונן. ערבב ידנית את חלקי הרקמה במדיום RPMI כדי לשטוף את שאריות אמצעי החילוץ. לאחר מכן, הניחו את הטישו על מגבת נייר יבשה, והפכו אותה מספר פעמים כדי להקל על הסרת שאריות הריריות שלא שוחררו על ידי מדיום החילוץ.

לאחר מכן, הניחו את שברי הרקמה בצינור של נקודה אחת של חמישה מיליליטר עם 600 מיקרוליטר של מדיום עיכול. טוחנים את הרקמה עד שהחלקים כבר לא נדבקים למספריים והתמיסה נראית הומוגנית. שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח עיכול אנזימטי מלא של הרקמה.

טחינת הרקמה עד שהחלקים כבר לא נדבקים למספריים והתמיסה נראית הומוגנית הם קריטיים להבטחת תשואה תאית כמו גם להבטחת שחזור התוצאות. מוסיפים את המעי הדק הטחון לכוס המכילה 25 מיליליטר מצע עיכול ומערבבים במשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. באמצע העיכול, צנרת אותו למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית כדי לעזור לפרק כל גושי רקמה גדולים.

לאחר מכן, סנן את רקמת העיכול דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור של 15 מיליליטר. שוטפים את המסננת עם 20 מיליליטר מדיום RPMI המכיל 10 אחוז FBS. לאחר מכן, צנטריפוגה את התמיסה המסוננת למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

שפכו בזהירות את הסופרנטנט ותלו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום RPMI המכיל 10 אחוז FBS. סנן את התאים התלויים מחדש דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור של 15 מיליליטר. שוטפים את המסננת עם 20 מיליליטר RPMI המכיל 10 אחוז FBS.

לאחר מכן, צנטריפוגה את התמיסה המסוננת למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שפכו בזהירות את הסופרנטנט ותלו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום RPMI, המכיל שני אחוז FBS. בהליך זה, העבירו את מדבקות פייר שנכרתו לכוס עם 25 מיליליטר של מצע עיכול ומוט ערבוב

אבטח את המכסה וסובב במשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, סנן את מדבקות פייר המעוכלות דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך שפופרת של 15 מיליליטר. אם נותרו גושים, לחץ אותם דרך המסננת באמצעות הקצה השטוח של הבוכנה ממזרק מיליליטר אחד.

לאחר מכן, שטפו את המסננת עם 10 מיליליטר של מדיום RPMI, המכיל 10 אחוז FBS. צנטריפוגה את התמיסה המסוננת למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שפכו בזהירות את הסופרנטנט ותלו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום RPMI המכיל שני אחוז FBS.

ניתוח זרימה ציטומטרי של תרחיפי תאים בודדים של לימפוציטים במעי הדק, אמור להניב אוכלוסייה דיסקרטית של תאים בעלי מאפייני פיזור קדימה וצדדים דומים לטחול. הלימפוציטים עלולים להתחיל למות אם הרקמה לא נשמרת בארבע מעלות צלזיוס במהלך השלבים הראשונים של הבידוד, וכתוצאה מכך לאוכלוסיית הלימפוציטים יש פיזור קדמי נמוך יותר וקשה יותר להפריד אותה מתאי אפיתל ומתים אחרים. יתר על כן, אם השומן המזנטרי לא יוסר לחלוטין מרקמת המעי הדק, יהיה אובדן כמעט מוחלט של לימפוציטים.

בדרך כלל, מתקבלת כדאיות של 80 אחוז עבור לימפוציטים LP במעי הדק. לאחר השליטה, ניתן לעבד ארבעה עכברים ולהכין תרחיפי תא בודד לצביעה תוך פחות מארבע שעות. במהלך הליך זה, חשוב להסיר לחלוטין את כל השומן המזנטרי ולטחון היטב את הרקמה כדי להבטיח עיכול מלא.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בתרחיפים של תאים בודדים למטרות אחרות מלבד ציטומטריית זרימה, כגון ניסויים במבחנה, ניתוח ביטוי גנים או העברה מאמצת כדי לאפיין עוד יותר את תפקודם של תאים אלה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים באימונולוגיה רירית לחקור את האונטוגניה וההשלכות התפקודיות של מערכת החיסון של המעי בעכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תרחיפי תאים בודדים מתאי מעיים קטנים שונים, על ידי ניקוי השומן המזנטרי, חילוץ שכבת האפיתל ועיכול הרקמה בקולגנאז.