Name: אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: למדו שיטה לאפיון לימפוציטים מעיים בחולדות באמצעות ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול מאפשר בידוד אוכלוסיות תאים בודדים מרקמות שונות במעי הדק לחקר אימונולוגיה רירית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NKS נתמך על ידי פרס NIH K08 AI108690.

כל המחקרים נערכו בבדיקה הנחיות קפדניות על פי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד, אשר עומדת בסטנדרטים וטרינריים שקבעה האגודה האמריקאית למדע בעלי חיים מעבדה (AALAS). 1. הילוכים אופקיים של חיידקים באמצעות Co-דיור (אופציונלית) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למזער זיהום אקסוגניים (במיוחד אם באמצעות עכברי gnotobiotic), לתרגל את הטכניקה ספטית בעוד רכבת כלובים פנויים סטרילי, באמצעות מזון ומים כי יש את שניהם כבר autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשו אגרופי אוזן או תגים בנפרד לסמן 6 בן שבוע C57BL / 6 עכברים כי נמל microbiotas שונה לשכן אותם באותו כלוב. בהתחשב בכך עכברים קופרופאגי ולאכול כדורי צואה מן רצפת הכלוב, חיידקים יועברו באופן טבעי אופקי בין העכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Co-בית עכברים ≥1 בשבוע כדי לאפשר זמן העברת חיידקים ושינוי אימונולוגית לפני הניתוח. </li></ol&gt; 2. הכנת תרחיף תא בודד משכבת ​​אינטרה-אפיתל קטן-מעי Lamina propria <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת החילוץ (מחיר המעי הדק): 30 מ&quot;ל RPMI + 93 μl 5% (w / v) dithiothreitol (DTT) + 60 μl 0.5 M EDTA + 500 μl עוברי בסרום שור (FBS). מוסיפים את DTT מיד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת העיכול (מחיר המעי הדק): 25 מ&quot;ל RPMI + 12.5 מ&quot;ג dispase + 37.5 מ&quot;ג collagenase II + 300 FBS μl. מוסיפים את dispase ו collagenase מיד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל incubations ביצע ב 37 מעלות צלזיוס, פתרונות prewarm ל -37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי מחנק 2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הצד הגבי העכבר למטה ולרסס את הבטן עם אתנול 70%. השתמש במספריים לבצע פיום בטן ברצף על ידי חיתוך העור ולאחר מכן fascia הצפק לאורך קו האמצע הגחון הלוך ושובמ &#39;מאחת הערווה לתהליך xiphoid, ובכך חושף את חלל הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי להפריד את המעי הדק מהקיבה על ידי חוצים את הסוגר השוער. הוצא בעדינות את המעי הדק מן הצפק, מנסה לשחזר את שומן mesenteric. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את המעי הדק היטב, לעשות חתך שני בצומת ileo-cecal. מניח את המעי הדק מבודד לתוך קר (כלומר., 4 ° C) RPMI המכיל 10% FBS כדי למקסם כדאי תא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות חתיכות גדולות של שומן באמצעות מלקחיים מעוקלים. היזהר כדי למנוע קריעה של רקמת המעי עצמו בעת שניסה להסיר שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר תוכן המעיים, המעיים סומק בעדינות עם 15 - 20 מ&quot;ל של PBS קר באמצעות מחט האכלה 18 G מודבקת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים שיחתוך PPS, ולהכניס אותם לתוך RPMI קר המכיל FBS 5%. PPS ממוקמים בצד antimesenteric של המעי הדק להופיע בתור רב lobulated לבןמסה. בהתאם לזן הספציפי, עכבר בדרך כלל יש 8 - 12 PPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המעי הדק לתוך 3 - 4 מגזרים אינץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שומן שייר ידי גלגול בכל מגזר קטן-מעיים על מגבת נייר טבולה RPMI, באמצעות אזמל משעמם להקניט את השומן מן הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הרקמות מבפנים החוצה על ידי cannulating מגזרי המעיים עם מלקחיים מעוקלים לתפוס את הקצה הדיסטלי של הרקמה. לאחר מכן השתמש זוג ישר מלקחיים כדי להסיר את קטע הרקמה בעדינות מן המלקחיים המעוקלים (החל בסוף הפרוקסימלי), וכתוצאה מכך הרקמה להיות הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים קטעי רקמה בתוך כוס המכילה 30 מ&quot;ל של התקשורת החילוץ ובר ומערבבים. אבטח את המכסה על הכוס, ומערבבים ב 500 סל&quot;ד במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס; ערבוב צריך להיות נמרץ אבל לא מעורבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להשתמש מסננת פלדה להפריד חתיכות רקמה מן supernatant המכיל האפיתל, שאמורה להופיע מעונן. supernatant זה מכיל iלימפוציטים ntraepithelial כי ניתן לנתח עוד יותר, אם תרצה בכך, על ידי שתמשיך סינון המדגם בצעדים 2.18 - 2.23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני להתסיס את פיסות הרקמה ב RPMI לשטוף תקשורת חילוץ שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח רקמות על מגבת נייר יבשה להעיף אותו מקצה אל מספר פעמים כדי להקל על הסרה של ריר שיורית כי לא שוחרר על ידי מדיום החילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שברי רקמת צינור 1.5 מיליליטר עם 600 μl של מדיום עיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי לקצץ את הרקמה עד חתיכות כבר לא מקלות על המספריים והפתרון נראה הומוגני. שלב זה הוא קריטי על מנת להבטיח עיכול אנזימטי מלא של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את המעי הדק טחון כוס המכילה 25 מ&quot;ל של התקשורת העיכול. מערבבים ב 500 סל&quot;ד במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. באמצע העיכול (כלומר., ב 15 דקות), pipet למעלה ולמטה עם pipet סרולוגיות לעזור לשבור את כל חתיכות גדולות של רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות מסננות מתעכלות (או epithשכבת elial משלב 2.12 אם IELs עיבוד) דרך מסננת תא 100 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ&quot;ל. יש לשטוף את מסננת עם 20 מ&quot;ל של RPMI המכיל 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הפתרון המסונן XG ב 500 במשך 10 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות למזוג גלולה supernatant ו resuspend ב 1 מ&quot;ל של RPMI המכיל 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן resuspended התאים דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. לשטוף מסננת עם 20 מ&quot;ל של RPMI המכיל 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מסונן פתרון XG ב 500 במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות למזוג supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של RPMI המכיל 2% FBS. </li></ol> 3. הכנת ההשעיה תא בודד מתוך תיקונים של Peyer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת נכרת PPS לכוס עם 25 מ&quot;ל של התקשורת העיכול ובר ומערבבים. מכסה מאובטח, ספין ב 500 סל&quot;ד במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן מתעכל PPS דרך מסננת 40 מיקרומטר התא לתוך צינור 50 מ&quot;ל. אם כל הרמ&quot;א גושיםב, ללחוץ אותם דרך מסננת בעזרת קצה השטוח של הבוכנה של מזרק 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מסננת עם 10 מ&quot;ל של RPMI המכיל 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מסונן פתרון XG ב 500 במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות למזוג supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של RPMI המכיל 2% FBS. </li></ol> 4. מכתים שטחי cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח Aliquot המתאים של תאים (למשל., 200 μl של LPLs) לתוך צלחת 96-היטב מסביב לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 90 μl של RPMI המכיל 2% FBS ו דילול 1: 100 של אנטי CD16 / 32 (בלוק Fc). דגירה של 10 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 250 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. supernatant למזוג ידיהיפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונליים) תאי כתם עם צבע כדאיות, אם ירצו בכך, על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend בפורמלין 100 μl 1% לתקן את התאים. דגירה עבור שעה 1 בחושך ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 250 μl PBS. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. למזוג supernatant על ידי היפוך לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 200 μl PBS. לנתח תאים באמצעות cytometer זרימה. </li></ol>

<ol><li>Cummings, D. E., Overduin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+regulation+of+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal regulation of food intake.</a> J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).</li>
<li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Round, J. L., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+shapes+intestinal+immune+responses+during+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).</li>
<li>Sartor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+influences+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microbial influences in inflammatory bowel diseases.</a> Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).</li>
<li>Tlaskalova-Hogenova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+%28normal+microflora%29%2C+mucosal+immunity+and+chronic+inflammatory+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases.</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).</li>
<li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+and+intestinal+microbiota+in+the+development+of+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes.</a> Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).</li>
<li>Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+lymphocytes+and+plasma+cells+and+the+role+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut.</a> Trends Immunol. 29 (5), author reply 209-210 206-208 (2008).</li>
<li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+yang+of+bacterial+polysaccharides%3A+lessons+learned+from+B.+fragilis+PSA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA.</a> Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).</li>
<li>Surana, N. K., Kasper, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+tete-a-tete+between+the+microbiota+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system.</a> J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).</li>
<li>Gauguet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+microbiota+of+mice+influences+resistance+to+Staphylococcus+aureus+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia.</a> Infect Immun. , (2015).</li>
<li>Ochoa-Reparaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polysaccharide+from+the+human+commensal+Bacteroides+fragilis+protects+against+CNS+demyelinating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).</li>
<li>Wu, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-residing+segmented+filamentous+bacteria+drive+autoimmune+arthritis+via+T+helper+17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells.</a> Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striking+phenotypic+and+functional+differences+in+lamina+propria+lymphocytes+from+the+large+and+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice.</a> Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).</li>
<li>Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lymphocyte+isolation+methods+for+endoscopic+biopsy+specimens+from+the+colonic+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa.</a> J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).</li>
<li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד וזרימת אפיון cytometric של לימפוציטים קטנים-מעיים, כולל LPLs, IELs, ואת הלימפוציטים PPS. למעוניינים בהערכה כיצד שינויי החיידקים להשפיע על המערכת החיסונית הקטנה-מעיים, נפרטנו את השלבים הפשוטים המעורבים בהעברה האופקית של אורגניזמים בין עכברי מחסה microbiotas שונה. למרות בפרוטוקול זה מתמקד המעי הדק, ההליך הוא זהה לניתוח של המעי הגס, עם ההבדל היחיד הוא שאין PPS להסיר (אם כי תיקונים גסים נוכחים, אלה הם בדרך כלל לא גסים גלויים). <p class="jove_content...

המשימה העיקרית של המעי הדק נחשב לעתים קרובות להיות עיכול וספיגה של חומרים מזינים 1. בעוד תפקוד המטבולי זה חיוני בבירור, המעי הדק יש תפקיד משמעותי לא פחות בהגנת המארח מן המטח המתמיד של אנטיגנים סביבה נמצאים בתוך לומן 2. המעי מפרידה בין העולם החיצוני (למשל., אנטיגנים לומינל) מהסביבה הפנימית של המארח עם שכבת האפיתל כי היא שכבה תא בודד רק עבה. ככזה, המערכת החיסונית הקטנה-מעיים יש את המשימה האדירה של איזון הסף שלה עבור תגובתיות, המאפשר אנטיגנים זרים מן חיידקי דיאטת commensal להיכנס רירי עם מינימאלי, אם בכלל, תגובה חיסונית תוך גובר תגובה חזקה נגד פתוגנים הפולשים &quot;מזיקים&quot; אנטיגנים אחרים. תגובות חיסוניות מוגזמות או לא מתאימות לאנטיגנים אלה יכולים להוביל למחלות פתולוגיים (למשל., Inflammaמחלות מעי טור, סוכרת מסוג I, טרשת נפוצה) ויש להימנע מהם 3-6. בסך הכל, מערכת העיכול הוא חשב לייצג את איבר החיסון הגדול ביותר בגוף, המכיל מעל 70% מכלל התאים מפרישי נוגדן 7. המערכת החיסונית קטן-מעיים מורכב מ -3 תאים עיקריים - שכבת הרירית המיוחדת (LP), השכבה intraepithelial, וטלאים של Peyer (PPS) - שכל אחד מהם מכיל קבוצה ייחודית של לימפוציטים 2. הלימפוציטים LP (LPLs) הם בעיקר תאי TCRαβ + T עם תאים ~ 20% B; לימפוציטים intraepithelial (IELs) מכילים תאי B מעט מאוד עם יותר תאי TCRγδ + T מאשר תאי TCRαβ + T; ו- PPS, שהן איברים הלימפה משני מוטבע בקיר הקטן-מעיים, מכיל ~ 80% תאי B. למרות שכל אחד האזורים האנטומיים הללו יש פונקציות נפרדות מעט ובסיסים אונטולוגית, הם מתפקדים אהאופנה armonized להגן המארח מפני עלבונות פתוגניים. יתר על כן, יש הערכה גוברת כי החיידקים הוא קובע קריטי להתפתחות של מערכת חיסון במעי, עם הכרה גוברת של קשר מאותו המקור בין חיידקים ספציפיים ואת ontogeny של שושלות תאים מסוימות 8,9. יתר על כן, בהתחשב בכך החינוך של מערכת החיסון במעי משפיע התגובה החיסונית לאתרים מרוחקים מבחינה אנטומית (למשל., דלקת פרקים, טרשת נפוצה, דלקת ריאות), זה הפך להיות ברור כי פיתוח של מערכת החיסון במעי רלוונטי יותר תהליכי מחלה מאשר שהוכר בעבר 10 -12. ככזה, עניין בהערכת כמותית מערכת החיסון במעי האריך מעבר אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן עכשיו כולל אינטראקציות בין מאכסן commensal ואת בפתוגנזה של מחלות מערכתיות רבות גם כן. בהתחשב בשונות של שיטות קיימות בהבידוד של לימפוציטים מעיים, שיטה כי הוא מותאם במיוחד תשואה, הכדאיות, ועקביות תוך איזון ראוי בין הזמן הנדרש הוא קריטי יותר ויותר. פרוטוקולים שכוללים הדרגתיים Percoll הם זמן העבודה אינטנסיבית יותר, אשר נוטה טעות אנושה, מוביל התשואה משתנית ואת כדאיות 13. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול אופטימיזציה עבור הבידוד והאפיון של לימפוציטים מכל 3 תאי החיסון קטנים-המעיים. בנוסף, עניין גובר נתון שינויים מושרי חיידק במערכת החיסונית ברירית, נכלולי צעדים שיכולים לשמש כדי לאפשר את ההעברה האופקית של מיקרואורגניזמים בין העכברים להעריך כיצד שינויים אלה כמותית להשפיע על המערכת החיסונית של המעי.

<table><tbody><tr><td>כפפות סטריליות</td> כלוב עכבר סטרילי <td>Kimberly-Clark</td><td>555092</td><td></td></tr><tr><td></td><td>חדשני</td><td>MS2-AD</td><td>מכיל מכסה, תחתית כלוב ומצעי אלפא-דרי</td></tr><tr><td>מזין מתכת</td><td>חדשני</td><td>M-FEED</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק מים</td><td>חדשני</td><td>M-WB-300</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק כרטיסים</td><td>חדשני</td><td>CRD-HLD-H</td><td></td></tr><tr><td>מכרסם הניתן לחיטוי צ'או (NIH-31M)</td><td>זייגלר</td><td>4131207530</td><td></td></tr><tr><td>RPMI בינוני 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>GemBio</td><td>100-510</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>הריכוז בפרוטוקול מבוסס על רמת פעילות של 1.878 U/mg</td></tr><tr><td>קולגנאז, סוג II&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17101-015</td><td>הריכוז בפרוטוקול מבוסס על רמת פעילות של 245 U/mg</td></tr><tr><td>מספריים חיתוך</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>מחט האכלה (18 גרם, אורך 2 אינץ')</td> <td>Roboz</td><td>FN-7905</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>אזמל חד פעמי (15 להבים)</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים</td><td>Roboz</td><td>RS-5211</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים ישרים</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td></td></tr><tr><td>כוסות רב תכליתיות, 120 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89009-662</td><td></td></tr><tr><td>מוט ערבוב</td><td>VWR</td><td>58949-062</td><td></td></tr><tr><td>צלחת ערבוב רב-מצבית, 9 מצבים</td><td>VWR</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>חרוטי נירוסטה מסננת, 3 אינץ'&nbsp;</td><td>RSVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל שפופרת</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m מסננת תאים</td><td>Falcon</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m מסננת תאים</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות צלחת, תחתית עגולה</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD16/32 (בלוק Fc)</td> <td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr> <tr><td>(אופציונלי) צבע כדאיות לתיקון eFluor 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-18</td><td></td></tr><tr><td>10% פורמלין, חוצץ ניטרלי</td><td>Thermo Scientific</td><td>5725</td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון בידוד תזרים cytometric של murine קטנים מעיים לימפוציטים

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

המעיים - אשר מכילים את המספר הגדול ביותר של תאי מערכת החיסון של כל איבר בגוף - חשופים כל הזמן אנטיגנים זרים, הן חיידקים תזונתיים. בהתחשב שיש לנו הבנה גוברת כי אנטיגנים לומינל אלה לעזור לעצב את התגובה החיסונית וחינוך של תאים חיסוניים בתוך המעי הוא קריטי עבור מספר המחלות מערכתיות, שם כבר עלה עניין באפיון מערכת החיסון במעי. עם זאת, פרוטוקולים רבים שפורסמו הם מפרך זמן רב. אנו מציגים כאן פרוטוקול פשוט עבור הבידוד של לימפוציטים מתוך שכבת הרירית מיוחדת קטנה-מעיים, שכבת intraepithelial, והטלאים של Peyer כי הוא מהיר, לשחזור, ואינו דורש הדרגתי Percoll מייגע. אף על פי הפרוטוקול מתמקד במעי הדק, זה גם מתאים ניתוח של המעי הגס. יתר על כן, אנו מדגישים היבטים מסוימים שעשויות צריך אופטימיזציה נוספת תלויים בככפרו המדעי הספציפיtion. גישה זו גורמת לבידודה של מספר גדול של לימפוציטים קיימא כי לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ניתוח תזרים cytometric או אמצעים חלופיים של אפיון.

ניתוח תזרים cytometric של המתלים תא בודד של לימפוציטים קטנים-מעיים אמור להניב אוכלוסייה דיסקרטית של תאים בעלי מאפיינים דומים קדימה פיזור בצד כמו splenocytes (איורים 1 א ו -1 B). הלימפוציטים עשויים להתחיל למות אם הרקמה אינה נשמרת ב 4 ° C. במהלך השלבים הראשונים של בידוד, וכתוצאה מכך אוכלוסיית הלימפוציטים בעל פיזור קדימה נמוך ולהיות יותר קשה להפריד מתאי אפיתל מתים אחרים (איור 1 ג) . יתר על כן, אם הרקמה קטנה-מעיים לא נ...

יש עניין גובר באפיון הכמותי של לימפוציטים במעי עקב ההכרה הגוברת בכך שתאים אלה ממלאים תפקיד קריטי במגוון מחלות מעיים ומערכתיות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד אוכלוסיות תאים בודדים מתאי מעי דק שונים לאפיון ציטומטרי זרימה לאחר מכן.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד אוכלוסיות של תאים בודדים ממדרי המעי הדק השונים, אשר ניתן יהיה להשתמש בהם לאחר מכן לניתוח באמצעות ציטומטריה זרימה או לאמצעי אפיון חלופי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח באימונולוגיה של הריריות, כגון כיצד המיקרוביוטה משפיעה על התפתחות מערכת החיסון של המעי. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם שהיא מהירה, ניתנת לשחזור ואינה דורשת גרדיאנטים מפרכים של Percoll.כדי להתחיל בהליך זה, הניחו את העכבר כאשר הצד הגבי פונה כלפי מטה ורססו את הבטן ב-70% ethanol. בצעו לפרוטומיה על ידי חיתוך רצופי של העור ולאחר מכן של הפסציה הפריטוניאלית לאורך קו האמצע הוונטרלי, מהסימפיזה הפוביס ועד לתהליך החרב, ובכך חשפו את חלל הפריטוניאום. לאחר מכן, הפרידו את המעי הדק מהקיבה על ידי חיתוך הסוגר הפילורי. הוציאו בעדינות את המעי הדק מהפריטוניאום והסדירו את השומן המסרקית.כדי להסיר את המעי הדק במלואו, בצעו חתך שני בצומת האיליו-צקלית (ileocecal junction). העבירו את המעי הדק המבודד לתוך מצע RPMI בטמפרטורה של 4 °C המכיל 10% FBS כדי למקסם את חיוניות התאים. הסירו בעדינות חתיכות שומן גדולות באמצעות פינצטה קמורה, והזהירות כדי להימנע מקריעת רקמת המעי עצמה במהלך התהליך.כדי להסיר את תכולת המעי, בצעו קניולציה של הקצה הפרוקסימלי של המעי הדק באמצעות מחט הזנה בקוטר 18 G המחוברת למזרק, ושטפו בעדינות את המעי עם 15 עד 20 milliliters של PBS קר. השתמשו במספריים כדי להוציא את ה-Peyer's Patches, הנמצאים בצד האנטי-מזנטרי של המעי הדק ונראים כמסה לבנה רב-אמרה. לאחר מכן, העבירו אותם למצע RPMI קר המכיל 5% FBS.בשלב הבא, חתכו את המעי הדק למקטעים של שלושה עד ארבעה אינצ'ים, הסירו את השומן שנותר על ידי גלגול של כל מקטע של המעי הדק על נייר סופג שהורטב ב-RPMI, והשתמשו בסכילה לא חדה כדי להפריד את השומן מהרקמה. הקפדה יתרה על הסרה מלאה של השומן המזנטרי היא קריטית להבטחת חיות הלימפוציטים, שכן אפילו חלקי שומן זעירים עלולים לגרום למות התאים. לאחר מכן, הפכו את הרקמה כאשר היא פונה כלפי חוץ על ידי קנולציה של מקטעי המעי באמצעות פינצטה מעוקלת ותפיסת הקצה הדיסטלי של הרקמה; לאחר מכן, השתמשו בזוג פינצטות ישרות כדי להוציא בעדינות את מקטע הרקמה מהקצה הפרוקסימלי, באופן שיוביל להיפוך הרקמה.הניחו את מקטעי הרקמה בכלי המכיל 30 milliliters של תמיסת מיצוי ומגנט ערבוב. סגרו את המכסה והערבבו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. הערבוב צריך להיות נמרץ, אך לא סוער.לאחר 15 דקות, השתמשו במסננת פלדה כדי להפריד את חלקי הרקמה מהנוזל העליון של האפיתל, אשר אמור להיראות עכור. ערבבו ידנית את חלקי הרקמה במצע RPMI כדי לשטוף את שאריות מדיום המיצוי. לאחר מכן, הניחו את הרקמה על נייר סופג יבש והפכו אותה מספר פעמים כדי להקל על הסרת ריריות שנותרו ולא שוחררו על ידי מדיום המיצוי.לאחר מכן, העבירו את חלקי הרקמה למבחנה בנפח 1.5 ml עם 600 µl של תמיסת עיכול. קצצו את הרקמה עד שהחלקים אינם נדבקים עוד למספריים והתמיסה נראית הומוגנית. שלב זה קריטי כדי להבטיח עיכול אנזימטי מלא של הרקמה.קיצוץ הרקמה עד שהחלקים אינם נדבקים יותר למספריים והתמיסה נראית הומוגנית הוא קריטי להבטחת התנובה התאית וכן להבטחת שחזור התוצאות. העבירו את המעי הדק המקצוץ לכוס המכילה 25 milliliters של מדיום עיכול וערבבו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C. באמצע תהליך העיכול, העבירו את התוכן למעלה ולמטה באמצעות פיפט סרולוגית כדי לסייע בפירוק גושי רקמה גדולים.בשלב הבא, סננו את רקמת העיכול דרך מסנן תאים של 100 micrometer לתוך מבחנה של 15 milliliter. שטפו את המסנן עם 20 milliliters של מצע RPMI המכיל 10% FBS. לאחר מכן, סבבו את התמיסה המסוננת בצנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius.שפכו בזהירות את supernatant (הנוזל העליון) ושחזרו את ה-pellet (המשקע) במיליליטר אחד של מצע RPMI המכיל 10% FBS. סננו את התאים המשוחזרים דרך מסננת תאים של 40 micrometer לתוך מבחנה של 15 milliliter. שטפו את המסננת עם 20 milliliters של RPMI המכיל 10% FBS.לאחר מכן, סובב במערך צנטריפוגה את התמיסה המסוננת למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. דלק את הנוזל העליון בזהירות והשעה מחדש את המשקע ב-1 מיליליטר של מצע RPMI, המכיל 2% FBS. בהליך זה, העבר את ה-Peyer's Patches שהוצאו לכלי עם 25 מיליליטר של מצע עיכול ומגנט ערבוב.סגרו את המכסה וסובבו במשך 10 דקות ב-37 °C. לאחר מכן, סננו את בלוטות פייר (Peyer's Patches) שעברו עיכול דרך מסנן תאים של 40 µm לתוך מבחנה של 15 mL. אם נותרו גושים, דחפו אותם דרך המסנן באמצעות הקצה השטוח של הבוכנה ממזרק של 1 mL.לאחר מכן, שטפו את המסננת עם 10 milliliters של מצע RPMI, המכיל 10 percent FBS. צנטריפוגו את התמיסה המסוננת למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שפכו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) והשביו מחדש את המשקע (pellet) במיליליטר אחד של מצע RPMI המכיל two percent FBS.ניתוח בציטומטריה של זרימה של תרחיפי תאים בודדים של לימפוציטים מהמעי הדק, אמור להניב אוכלוסייה נפרדת של תכים בעלי מאפייני פיזור קדמי (forward scatter) ופיזור צדי (side scatter) דומים לאלו של ספלנוציטים. הלימפוציטים עלולים להתחיל למות אם הרקמה לא תישמר בטמפרטורה של 4 °C במהלך השלבים הראשוניים של הבידוד, מה שיוביל לאוכלוסיית לימפוציטים עם פיזור קדמי נמוך יותר, אשר יהיה קשה יותר להפרידה מתאים אפיתליאליים ותאים מתים אחרים. יתרה מכך, אם השומן המזנטרי לא יוסר לחלוטין מרקמת המעי הדק, יתרחש אובדן כמעט מוחלט של הלימפוציטים.בדרך כלל, מושגת חיוניות של 80 אחוז עבור לימפוציטים מסוג LP מהמעי הדק. לאחר רכישת מיומנות בשיטה, ניתן לעבד ארבעה עכברים ולהכין תרחיפי תאים בודדים המוכנים לצביעה בפחות מארבע שעות. במהלך הליך זה, חשוב להסיר לחלוטין את כל השומן המזנטרי ולקצץ היטב את הרקמה כדי להבטיח עיכול מלא.בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בתרחיפי תאים בודדים למטרות שאינן ציטומטריה זורמת, כגון ניסויים in vitro, ניתוח ביטוי גנים או העברה אדופטיבית (adoptive transfer) כדי לאפיין יותר את תפקודם של תאים אלו. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האימונולוגיה של הריריות לחקור את האונטוגניה וההשלכות התפקודיות של מערכת החיסון במעי בעכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו מבודדים תרחיפי תאים בודדים ממדורי מעי דקים שונים, על ידי ניקוי השומן המזנטרי, חילוץ השכבה האפיתליאלית ועיכול הרקמה באמצעות קולגנאז.

isolation-flow-cytometric-characterization-murine-small-intestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן, אנו פרט מתודולוגיה בידוד מהיר של המעיים עכבר תאים דנדריטים (DCS) ומקרופגים. אפיון פנוטיפי של DCS ומקרופגים המעי מתבצע באמצעות ריבוי צבעים ניתוח תזרים cytometric תוך העשרת חרוז מגנטי ואחריו מיון התא משמש להניב אוכלוסיות טהורות ביותר ללימודי תפקודית.

בידוד ואיפיון של תאים דנדריטים ומקרופגים מהמעי עכבר

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

מאמר זה מתאר ספקטרלי cytometry, גישה חדשה ב cytometry הזרימה המשתמשת צורות של ספקטרום פליטה להבחין fluorochromes. אלגוריתם מחליף פיצויים יכול לטפל קרינה אוטומטית כפרמטר עצמאי. גישה חדשה זו מאפשרת הניתוח הראוי של תאים מבודדים איברים מוצקים.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות הלימפה תאי אנדותל אוכלוסיות בתוך הכבד באמצעות סמנים המתואר. אנו מנצלים collagenase הרביעי ואת DNase לקמץ עדין של רקמות, בשילוב עם cytometry זרימה, לזהות אוכלוסייה ברורים של תאי אנדותל הלימפה.

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול להכנת תאים בודדים של בלוטת התימוס מאתר הלבלב ניקוז הלימפה והטחול ללימוד נוסף תאים אלה באמצעות cytometry זרימה. בנוסף, פרוטוקול זה שימש לקביעת תת-קבוצות של הרגולציה ותאי T באמצעות cytometry זרימה.

קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה

אנו מתארים כאן ניתוח פשוט של ההטרוגניות של תא תאי B החיסוניים המוריניים ברקמות הצפק, הטחול ומח העצם על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול יכול להיות מותאם ומורחב לרקמות עכבר אחרות.

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

זוהי שיטה לבודד תאי לימפה הרחם מעכברים בהריון ולא בהריון. שיטה זו יכולה לשמש עבור יישומים במורד הזרם מרובים כגון פנוטיפינג FACS, מיון תאים, בדיקות פונקציונליות, RNA-seq, ופרוטומיקה. הפרוטוקול כאן מדגים כיצד פנוטיפ קבוצה 1 תאי לימפה מולדים הרחם על ידי ציטומטריית זרימה.

בידוד של תאי לימפה מולדים ברחם לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור כדי לבודד את האוכלוסיות החיסוניות של מערכת הנשימה murine. אנו מספקים גם שיטה לזיהוי של כל תאי החיסון המולדים והמסתגלים השוכנים בריאות של עכברים בריאים, באמצעות לוח ציטומטריית זרימה מבוסס 9 צבעים.

ניתוח ציטומטרי זרימה לזיהוי תאי החיסון המולדים והמסתגלים של ריאות מורין

פרוטוקול זה מציע הוראות מפורטות לביסוס אורגנואידים של המעי הדק של מורין, בידוד תאי לימפואידים מולדים מסוג 1 מהלמינה פרופריה של המעי הדק מורין, והקמת תרביות משותפות תלת-ממדיות (3D) בין שני סוגי התאים כדי לחקור אינטראקציות דו-כיווניות בין תאי אפיתל במעי לבין תאי לימפואידים מולדים מסוג 1.

תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

למדו שיטה לאפיון לימפוציטים מעיים בחולדות באמצעות ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול מאפשר בידוד אוכלוסיות תאים בודדים מרקמות שונות במעי הדק לחקר אימונולוגיה רירית.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

גלה סרטונים נוספים