מניעת חום מתח תופעות לוואי בחולדות על ידי Subtilis Bacillus זנים

תיארנו פרוטוקול למניעת השפעות עקת חום בחולדות על ידי טיפול מקדים דרך הפה בחיידקים מועילים. ניתן לשנות פרוטוקול זה ולהשתמש בו לדרכי מתן שונות ולניתוח תרכובות שונות.

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להעריך את ההשפעה המונעת של זן B.subtilis BSB3 כנגד סיבוכים לאחר עומס חום. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במניעת השפעה שלילית של עומס חום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי להעריך גישות שונות להפחתת הסיבוכים של מתח חום.

מדגימה הליך זה תהיה לודמילה גלובה. ואולג פוסובי, עמיתי מחקר מהמעבדה שלנו. בתור התחלה, עם מושבה אחת של Bacillus subtilis BSB3 שגדלה בן לילה על צלחת אגר מזינה.

חסנו עשרה מיליליטר מרק תזונתי בבקבוק. גדל את התרבית בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס. הכינו 500 מיליליטר מדיום נבגים לפי המתכון המוצג כאן.

וחיטוי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הניחו למדיום להתקרר ל -50 מעלות צלזיוס לפני הוספת התמיסות הסטריליות הבאות. בארון סטרילי מצננים את המדיום המוכן בטמפרטורת החדר ל 40 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

ושופכים 25 מיליליטר לכל אחת מ -20 צלחות פטרי סטריליות. הניחו למדיום להתמצק למשך הלילה. לאחר מכן, מורחים 0.5 מיליליטר מתרבית Bacillus subtilis BSB3 הלילה על פני הלוחות הבינוניים של הנבגים.

דגרו על הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים עד ל-90% נבגים. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה כדי לבדוק אם יש נבגים בהירים פאזה. כדי לקצור את החיידקים, הוסיפו מיליליטר אחד של PBS לצלחות, והשתמשו במפזר תאים סטרילי כדי לגרד את החיידקים מפני השטח.

אחסן את המתלה בארבע מעלות צלזיוס עד הצורך. אשר את כדאיות החיידקים על ידי ציפוי של 0.1 מיליליטר מהדילול המתאים של תרחיף חיידקי על צלחות בינוניות נבגים ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 24 שעות. השתמש במונה מושבות כדי לספור מושבות חיידקים ולחשב את טיטר החיידקים בתרחיף שנבדק.

לאחר מכן הכינו תרחיף חיידקים ב-PBS בריכוז סופי של אחד כפול עשר עד ה-CFUs השמיני למיליליטר. לאחר טיפול בחולדות על ידי גבאז' דרך הפה עם B.subtilis BSB3 או PBS במשך יומיים, ולאחר מכן חלוקת החיות ומדידת הטמפרטורה שלהן, שמור את החולדות מקבוצות 1 ו-2 בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות. הניחו בעלי חיים מקבוצות 3 ו-4 בתא אקלים בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס ו-55% לחות יחסית למשך 25 דקות.

לאחר מדידת טמפרטורת פי הטבעת של כל חולדה שוב, הניחו את כל בעלי החיים בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות. לאחר מכן, לאחר המתת חסד של בעלי החיים, איסוף דם הגזע ובידוד איברים בהתאם לפרוטוקול הטקסט, הכניסו כל דגימת איבר לצינורות סטריליים שנשקלו מראש ושקלו. הוסף PBS סטרילי לכל צינור כדי לקבל משקל אחד עד עשרה לדילול נפח של הדגימה, והשתמש בהומוגנייזר רקמת זכוכית סטרילי כדי ליצור תרחיפי רקמות הומוגניים.

לאחר מכן, השתמש ב-PBS סטרילי כדי לבצע דילולים סדרתיים של כל דגימה. לאחר מכן צלחת 0.1 מיליליטר מכל הדילולים על פני השטח של MacConkeys ואגר דם של 5%. ואגר דם ברוצלה עם המין וויטמין K1. לאחר הדגירה של הצלחות, השתמש במונה מושבות כדי לספור את המושבות על כל קבוצת צלחות.

בטא את התוצאות כמספר היחידות היוצרות מושבה, או CFUs, לגרם רקמה. לאחר הכנה וצביעה של חלקים במעי הדק על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את וילי המעי ואת עובי דופן הרירית הכולל. נתח לפחות ארבע דגימות מכל חולדה ובצע לפחות 20 מדידות בכל דגימה.

כדי לבצע מיקרוסקופ אור ברזולוציה גבוהה של דגימות דם, השתמש בפלטפורמת בידוד הרטט כבסיס למערכת המיקרוסקופ עם מצלמת וידאו ומחשב להקלטת תמונות חיות. לאחר כיול תמונות הבדיקה על פי פרוטוקול הטקסט, הניחו שבעה מיקרוליטרים של דם טרי שנשאב מכל חולדה על שקופית זכוכית והוסיפו כיסוי. לאחר מכן צלם והקלט עשר מסגרות תמונה של 72 על 53.3 מיקרומטר בריבוע בכל דגימה.

לבסוף, באמצעות תוכנה המספקת תמונות אופטיות ברזולוציה גבוהה בזמן אמת, מודדים את ריכוז השלפוחיות. טמפרטורת הגוף הממוצעת של בעלי חיים לפני ומיד אחרי עקת חום הייתה 36.7 פלוס מינוס 07 מעלות צלזיוס ו-40.3 פלוס מינוס 0.17 מעלות צלזיוס בהתאמה. חשיפת חולדות לחום הביאה לעיכוב משמעותי של גובה הווילי ועובי הרירית הכולל.

עם זאת, טיפול בזן BSB3 לפני לחץ, הגן על המעי מפני ההשפעה המזיקה של החום. לצורך טרנסלוקציה של חיידקים מהמעיים, נותחו בלוטות לימפה מזנטריות, כבד וטחול. כפי שמודגם כאן, חיידקים בודדו בריכוז של 1.7 כפול עשר לשלושה פלוס מינוס 4.6 כפול עשר לשני CFUs לגרם רקמה רק בדגימות מבלוטות לימפה מזנטריות וכבד של חולדות שטופלו ב-PBS שנחשפו לחום.

מצד שני, כל הדגימות שנבדקו מחיות ביקורת ולחץ חום שקיבלו את זן BSB3 היו סטריליות. לא נרשם שינוי ברמות ציטוקינים של IL 1beta, IL-6, TNFalpha או אינטרפרון גמא בחולדות בלחץ חום. עם זאת, רמות IL-10 ו-LPS היו גבוהות בבעלי חיים שטופלו ב-PBS לפני טיפול בחום.

לכן, טיפול מקדים ב-B.subtilis BSB3 מנע את עליית IL-10 ו-LPS בסרום לאחר טיפול בחום. לבסוף, נמצאה עלייה משמעותית בריכוז השלפוחיות החופשיות בדם של חולדות שקיבלו PBS לפני עומס חום, אך לא בבעלי חיים שטופלו ב-BSB3. חשוב לזכור להשתמש בחומרים פירוגניים לאיסוף דם ודיוק כדי לשמור על נוזלי הסרום במינוס 20 מעלות צלזיוס עם הקפאה והפשרה חוזרות ונשנות, ולבצע הליך סטרילי במהלך ניתוח טרנסלוקציה של חיידקים.

ניתן לבצע הליך זה כמו מתן חיידקים לאחר עומס חום על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי סיבוכים של עומס חום.