Name: תיוג ספין בימוי אתר ולימודי ספקטרוסקופיות EPR של pentameric ליגנד מגודרת יון ערוצים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: למד שיטות לתיוג ספין מכוון אתר וספקטרוסקופיית EPR בערוצים מוגדרי ליגנד פנטמריים. פרוטוקול זה מאפשר חקר דינמיקת חלבוני ממברנה בסביבה פיזיולוגית רלוונטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו מאוד מודים לחברים בהווה ובעבר מעבדת Chakrapani לקריאה והערות קריטיות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק (1R01GM108921) ואת איגוד הלב האמריקני (NCRP המדען פיתוח גרנט 12SDG12070069) וכדי SC.

למחברים אין מה לחשוף.

ספקטרוסקופיה EPR הוכיחה להיות גישה מבנית ללא תחרות בכימות שינויי קונפורמציה החלבונים בממברנה בסביבה כמעט טבעית. גישה זו מאפשרת לנו הצצה אל תוך הפרטים המולקולריים של הדינמיקה חלבון כי הם מוסתרים במבנים ברזולוציה גבוהה מ קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ו מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים. עם זאת, חשוב לשקול את המגבלות הטכניות של גישה זו שעשויה להשפיע על התחולה הכללית למערכות אחרות וגם לזכור מחסומים פוטנציאל הניסיונות לאורך הדרך. אנו דנים כמה היבטים אלה בהמשך יחד עם אסטרטגיה מומלצת תקלות. <...

בעשור האחרון, ההבנה המבנית של תעלות יונים ליגנד מגודרת pentameric (pLGIC) גדלה בצעדים ענקים, בשל המוני מבנים ברזולוציה גבוהה של כמה מחברי המשפחה. גורמים מרכזיים אשר הובילו ההתקדמות הנוכחית בתחום כוללים, גילוי ערוצי pLGIC פרוקריוטים, 1-3 התקדמות מרכזית ביטוי חלבון קרום האיקריוטים, 4-6 ופריצות דרך עצומות בגישות קביעת מבנה. 7 מבנים אלו מספקים קונסנסוס ברור על השימור הכולל של הארכיטקטורה תלת-הממדים של pLGIC. עם זאת, שני תחומים עיקריים שנראים נשרכים הם האפיון הפונקציונלי של הכנות אלו בערוץ והתיאור מכניסטית של פונקצית ערוץ. שינויי מרחביים gating הם מורכבים המתרחשים על פני מרחק 60 Å לאורכו של הערוץ ומעברים אלה הם מווסתים על ידי בהרחבהליפידים קרום. בפרט, שומנים שליליים, כולסטרול, פוספוליפידים הוכחו לווסת את תפקוד pLGIC 8-11. בעוד התפקיד המדויק של מרכיבי השומנים האלה בתפקוד ערוץ נותר עלום, הבנה מולקולרית מלאה של gating תדרוש לימוד תעלות אלה בסביבת מולדתם. לאתר בימוי ספין תיוג (SDSL) ואלקטרון פאראמגנטיים תהודה (EPR) ספקטרוסקופיה הן טכניקות של בחירה ללימוד הדינמיקה חלבון במערכות מחדש. ספקטרוסקופיה EPR אינה מוגבל על ידי הגודל המולקולרי (כמו NMR) או הנכס האופטי של המדגם (כמו ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי), ובכך מאפשרת מדידות של מבנים באורך מלא מחדש בתנאי שומני ילידים. הטכניקה היא רגישה מאוד ויש לו דרישות מדגם נמוכות יחסית (בטווח פיקו-השומה). שני היבטים אלה להפוך את הטכניקה גם מתאימה ללימוד חלבונים בממברנה גדול שקשה לבטא בלמעלה מיליגרםכמיות. שימוש ספקטרוסקופיה EPR בשילוב עם תיוג ספין מכוון אתר נבנה על ידי וויין Hubbell ועמיתים, הותאם בלימוד מגוון של סוגי חלבון. 12-24 נתונים EPR שמשו לחקור מבנים משניים, שינויים בחלבון קונפורמציה, עומק קרום-הכנסה, וכן חלבונים / אינטראקציות ליגנד חלבון. השיטה כרוכה החלפת ציסטאין בעמדות של הריבית על ידי mutagenesis באתר ביים. כדי להבטיח תיוג אתר ספציפי, יש צורך להחליף cysteines הילידים עם חומצת אמינו נוספת (למשל., סרין) כדי ליצור תבנית ציסטאין-פחות. By רחוק, את תווית הספין הפופולרית ביותר היא MTSL תיאול ספציפי: (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-מתיל) methanethiosulfonate שמתחבר החלבון דרך גשר אג&quot;ח דיסולפיד. בשל סגולי הגבוה שלה, גודל קטן יחסית (מעט גדול יותר טריפטופן), ו Flexibility של האזור המקשר, התווית ספין זה הוכח יש תגובתיות מעולה אפילו עם ציסטאין קבור. יתר על כן, על מנת למקסם את תגובתיות, תגובת התיוג של החלבון מתבצעת בצורה דטרגנט-solubilized. לאחר ההפרדה של ספין-תווית חינם עודף ידי כרומטוגרפיה הדרה גודל, החלבון מחדש לתוך ליפוזומים או מערכות מחקי bilayer של רכב שומנים מוגדר. באופן כללי, mutagenesis ציסטאין נסבל היטב ברוב החלקי של החלבון, ואת הגודל קטן יחסית של-חללית ספין גורם הפרעות מינימאליות למבנים השניוניים ושליישונים. כדי להבטיח כי השינוי שומר פונקציות סוג ברות, הערוצים שהכותרת ומשוחזרים ניתן ללמוד על ידי מדידות תיקון- clamp. החלבון הנקרא תפקודי אז הוא נתון מדידות ספקטרוסקופיות, אשר למעשה לספק שלושה סוגים עיקריים של מידע: 12,14,15,20,22,23,25-27 דינמיקת ספין-חללית על ידי lineshניתוח קוף; נגישות של החללית לסוכני הרפיה פאראמגנטיים; ומרחק הפצה. 27 מרחקי EPR נמדדים על פי שתי גישות שונות. הראשון מבוסס על טכניקת הגל (CW) הרציפה, שבו הרחבת ספקטרלי הנובעת מתגובות בין dipolar בין ספין-תוויות (ב 8 - טווח מרחק 20 א). משמשת לקביעת מרחק 28,29 השני הוא פעם-EPR שיטה שבה מדידות מרחק יכולות להתארך עד 70. 30-34 בכפול אלקטרוני אלקטרוני תהודה (צבי), תנודות משרעת-הד הספין מנותחות כדי לקבוע מרחקי הפצות מרחק. כאן הד הספין הוא מווסת בתדר של אינטראקצית dipolar. יחד, פרמטרים אלה משמשים כדי לקבוע טופולוגיה חלבון, אלמנטים מבניים משניים, ושינויי חלבון-קונפורמציה.

<table><tbody><tr><td>מוטגנזה מכוונת אתר ומוטציות</td><td></td><td></td><td></td>Cys</tr><tr><td>10x PfuUltra HF מאגר תגובה</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-52</td><td></td></tr><tr><td>dNTPS</td><td>ניו אינגלנד BioLabs Inc&lrm;</td><td>N0447L</td><td>10 מ"מ כל אחד dNTP</td></tr><tr><td>pfu אולטרה DNA פולימראז</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-51</td><td>2.5 U/ul</td></tr><tr><td>DPNI</td><td>ניו אינגלנד BioLabs Inc&lrm;</td><td>R0176S</td><td>20,000 U/ml</td></tr><tr><td>XL10 GOLD</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>SOC media</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP905</td><td></td></tr><tr><td>LB מדיה</td><td>Invitrogen</td><td>127957084</td><td></td></tr><tr><td>ערכת Miniprep</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>C43 תאים מוכשרים</td><td>Lucigen</td><td>60446</td><td></td></tr><tr><td>ביטוי וטיהור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Fisher Scientfic</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>אמרסקו</td><td>J850</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0705</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0781</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (איזופרופיל-תיו-ובטא;-גלקטוזיד)</td><td>I2481C25</td><td></td> <td>ביוטכנולוגיה זהב</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Life Science</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Life Science</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>M145</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptine</td><td>Amresco</td><td>J580</td><td></td></tr><tr><td>פפסטאטין</td><td>אמרסקו</td><td>J583</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-&beta;-D-Maltopyranoside)</td> <td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>שרף עמילוז</td><td>ניו אינגלנד BioLabs Inc&lrm;</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Amresco</td><td>K831</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Acros Organics</td><td>329915000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr><tr><td>עמודה כרומטוגרפיה פוליפרופילן ריקה</td><td>BioRad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>תיוג ספין מכוון אתר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-אוקסיל-2,2,5,5-טטרמתיל-3-פירולין-3-מתיל) Methanethiosulfonate</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>(1-אצטוקסי-2,2,5,5-טטרמתיל-ודלתא; 3-פירולין-3-מתיל) methanethiosulfonate</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>A167900</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>Reconstitution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asolectin lipid</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads (חרוזי פוליסטירין)</td><td>Bio Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>כימיקלים מתנול</td><td>פישר</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>FRET</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-maleimide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine-maleimide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T-6027</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td> E.coli תמצית ליפידים קוטביים</td><td>Avanti Polar Lipids Inc</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>מדידת</td><td></td><td></td><td></td>EPR</tr><tr><td>TPX נימי פלסטיק</td><td>Bruker</td><td>ER221</td><td></td></tr><tr><td>EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid)</td><td>Aldrich</td><td>158186</td><td></td></tr><tr><td>Ni(OH)2</td><td>Aldrich</td><td>283622</td><td></td></tr></tbody></table>

תיוג ספין בימוי אתר ולימודי ספקטרוסקופיות epr של pentameric ליגנד מגודרת יון ערוצים

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

שער תעלות יונים הוא תזמור מונע גירוי של תנועות חלבון המוביל למעברים בין מצבים סגורים, פתוחים וחסרי רגישות. הבסיס למעברים אלה הוא הגמישות הפנימית של החלבון, אשר מווסתת באופן קריטי על ידי הרכב השומנים של הממברנה. כדי להבין טוב יותר את הבסיס המבני של תפקוד הערוץ, יש צורך לחקור דינמיקת חלבונים בסביבת ממברנה פיזיולוגית. ספקטרוסקופיה של תהודה פרמגנטית אלקטרונית (EPR) היא כלי חשוב לאפיון מעברי קונפורמציה בין מצבים פונקציונליים. בהשוואה ל-NMR וקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, המידע המתקבל מ-EPR הוא באופן מהותי ברזולוציה נמוכה יותר. עם זאת, בניגוד לטכניקות אחרות, ב-EPR אין גבול עליון למשקל המולקולרי של החלבון, דרישות הדגימה נמוכות משמעותית, וחשוב מכך החלבון אינו מוגבל על ידי כוחות הסריג הגבישיים. לכן, EPR מתאים באופן ייחודי לחקר קומפלקסים גדולים של חלבונים וחלבונים במערכות משוחזרות. במאמר זה, נדון בפרוטוקולים כלליים לתיוג ספין מכוון אתר ובנייה מחדש של הממברנה באמצעות תעלת יונים פנטאמרית מגודרת פרוטונים פרוקריוטית (pLGIC) מבית Gloeobacter violaceus (GLIC) כדוגמה. יתואר שילוב של גישות EPR של גל רציף במצב יציב (CW) ופעימה (תהודה אלקטרונית כפולה-DEER) שיאפשרו אפיון כמותי מלא של דינמיקת הערוצים.

אפיון ביוכימיים של מוטאנטים GLIC שכותרתו ספין בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל בדרך כלל יניב חלבון היתוך GLIC-MBP בטווח של 10 - 12 מ&quot;ג / L של התרבות. למרות הערך עשוי להשתנות על פני מוטנטים שונים, במיוחד עבור עמדות הקבורות בתוך החלבון, התשואה עלולה לסכן באופן משמעותי. במקרים אלה, כרכי התרבות עשויים לדרוש בגמלון. המחשוף של ההיתוך לבנ...

מאמר זה מתאר שיטות לתיוג ספין מכוון אתר ובנייה מחדש של תעלות מגודרות ליגנד פנטמרי למחקרי תהודה פרמגנטית אלקטרונית. ניתן להתאים פרוטוקול זה לכל חלבון ממברנה. שיטת הבנייה מחדש המתוארת כאן יכולה לשמש גם למדידות מהדק טלאי של זרמים מקרוסקופיים וחד-ערוציים במערכת שומנים מוגדרת.

תיוג ספין בימוי אתר ולימודי ספקטרוסקופיות EPR של pentameric ליגנד מגודרת יון ערוצים

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים את הטיהור, סימון הספין המכוון לאתר (site directed spin labeling) וההרכבה מחדש (reconstitution) של תעלה פנאמרית (penameric) מופעלת-ליגנד לצורך מחקרי תהודה פאראמגנטית של אלקטרונים (EPR). חקר הדינמיקה של חלבוני ממברנה בסביבה רלוונטית פיזיולוגית הוא קריטי להבנה מלאה של אופן הפעולה של חלבון הובלה זה בממברנה. בשל צרכים אלו, אני סבור כי טכניקת ה-EPR וסימון ספין מכוון לאתר הן מתאימות באופן אידיאלי.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא אינה מוגבלת על ידי גודל החלבון. לכן, סימון ספין מכוון-אתר (site directed spin labeling) וספקטרוסקופיית EPR יהיו הטכניקה המועדפת אם ברצונכם לחקור דינמיקה של חלבונים גדולים או חלבונים ששוחזרו בממברנות. הכניסו מוטציות של ציסטאין בודד בגן GLIC באמצעות מוטגנזה מכוונת-אתר.הכינו תרבית לילה של מוטציית הציסטאין של GLIC כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הוסיפו 100 milliliters של בופר פוטסיום פוספאט סטרילי למצע terrific broth שעבר אוטוקלאב. לאחר מכן, הוסיפו גלוקוז סטרילי, Kanamycin, ו-10 milliliters מהתרבית של הלילה.דגרו בטמפרטורה של 37 °C במנער במהירות של 250 rpm. הוסיפו 50 milliliters של glycerol והמשיכו בניעור של התרבית עד שהצפיפות האופטית באורך גל של 600 nanometers תגיע ל-1.0 עד 1.2. לאחר השראת התאים באמצעות 200 micromolar IPTG, הגדירו מחדש את המנער ל-250 rpm ודגרו למשך כ-16 שעות בטמפרטורה של 18 °C.קצרו את התאים בבקבוקי צנטריפוגה של ליטר אחד על ידי סבוב ב-8500 ×g, בטמפרטורה של 4 °C, למשך 15 דקות. שפכו את העלייה (supernatant) ושקלו את הבקבוק עם משקע התאים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. השהו מחדש את משקע החיידקים ב-150 milliliters של בופר A קר מאוד (בטמפרטורת קרח) לכל ליטר אחד של תרבית.בצע הומוגניזציה לתאים על ידי העברתם דרך מפרק תאים (cell disrupter) בחדר קירור בטמפרטורה של 4 °C. חזור על הפעולה שלוש פעמים כדי להבטיח שרוב הבקטריות יולסו. סבב את התאים בצנטריפוגה ב-14,000 ×g למשך 15 דקות.לאחר מכן, שאבו את supernatant באמצעות פיפטה והעבירו אותו למבחנת צנטריפוגה נקייה. לאחר סבב צנטריפוגה של ה-supernatant במהירות של 168,000 ×g למשך שעה אחת, שפכו בזהירות את ה-supernatant מבלי להפריע למשקע הממברנה. הוציאו את משקע הממברנה מתוך ליטר אחד של תרבית והשביו אותו ב-Buffer A, בתוספת 10% glycerol, לנפח סופי של 50 milliliters.הוסיפו 0.5 grams של DDM לתמיחת הממברנה והעבירו במיקסר נוטטור למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius. לאחר המסת הממברנה, הסירו את שיירי התאים מהליזט באמצעות סנטריפוגציה ב-168,000 ×g למשך שעה אחת. במקביל, הכינו שרף amylose.העבירו שלושה מיליליטר של שרף באמצעות פיפט לתוך עמודת כרומטוגרפיה ריקה מפוליפרופילן. שטפו את השרף על ידי העברת 10 נפחי עמודה של מים שלוש פעמים, ולאחר מכן 10 נפחי עמודה של Buffer A, המכיל 0.5 millimolar DDM. לאחר סרטיפוגציה, הוציאו בעדינות את העלייה באמצעות פיפט והעבירו לשפופרת קונית נקייה של 50 מיליליטר.עבור קישור באצוות, הוסף שרף עמילוז שעבר שיווי משקל מוקדם לשפופרת הקונית. קשור את החלבון שבודד לשרף העמילוז על ידי ערבוב התערובת במכשיר נוטטור (nutator) למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבר את כל התוך (slurry) דרך עמודת כרומטוגרפיה ואסוף את השטוף (flow-through).דללו את חלבון ה-GLIC עם 10 milliliters של Buffer A המכיל 40 milliomolar מלטוז בנוסף ל-0.5 millimolar DDM ו-05 millimolar TCEP. TCEP מונע חמצון של שרשראות צד של ציסטאין. אספו את כל ה-eluite.רכז את החלבון שנאלוט באמצעות מרכז צנטריפוגלי עד לריכוז של בין 4 ל-6 mg/mL. הוסף HRV 3C protease והדגר למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. לצורך ביצוע סימון ספין מכוון לאתר (site directed spin labeling), הוסף תחילה עודף מולרי של פי עשרה של MTSL spin label לדגימה שעברה עיכול על ידי הפרוטאז, כדי להגיע ליחס מולרי של 1:10 בין מונומר GLIC ל-MTSL.לאחר דגירה של שעה אחת, הוסף תגית ספין נוספת ביחס של עודף מולרי פי חמישה ודגור למשך שעה נוספת. העבר את הדגימה דרך עמודת כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבונים להפרדה לפי גודל (size exclusion FPLC), שהועמדה מראש בשיווי משקל עם Buffer A ו-0.5 millimolar DDM, כדי להפריד את תגית ה-MBP שהוסרה ואת עודפי תגית הספין החופשית מהפנטמרים של GLIC. רכז את תמיסת החלבון באמצעות מרכז צנטריפוגלי לריכוז סופי של כ-8 עד 10 mg/mL והנח אותה על קרח.הדגימה מוכנה כעת לשחזור. כדי להכין את הליפוזומים, שטפו בקבוק עגול תחתית נקי בנפח 25 milliliter עם חמישה milliliters של כלורופורם ויבשו את הבקבוק תחת זרם של גז חנקן במנדף. לאחר מכן, העבירו 10 milligrams של asolectin אל הבקבוק ויבשו את הליפידים תחת זרם רציף של גז חנקן.לאחר התאדות הכלורופורם, הניחו את הבקבוק בוואקום למשך שעה אחת כדי להבטיח ייבוש מלא. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של Buffer A לשחזור לליפיד המיובש וערבבו את הבקבוק ב-vortex בעוצמה כדי להביא את משקע הליפיד למצב של סספנסיה. להכנת וזיקולות יחיד-שכבתיות קטנות (small unilamellar vesicles), בצעו סוניקציה לסספנסיית הליפיד בתוך מכשיר סוניקטור עם אמבט קר, עד שתמיסת הוזיקולות תהפוך לשקופה פחות או יותר ולא ייראו גושים.לתערובת זו, הוסף DDM לריכוז סופי של 4 mM והדגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. כדי לשחזר את החלבון, הוסף את החלבון המטוהר לתערובת הליפידים. לאחר הדגרת הדגימה בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה אחת תוך סיבוב עדין, דלל את הדגימה ל-15 mL באמצעות Buffer A. הסר את שאריות הדטרגנט מהתליה באמצעות חרוזי פוליסטירן בעלי נקבוביות הידרופוביות הלוכדות דטרגנט.הוסיפו 80 milligrams של חרוצים נקיים והדגירו את תרחיף הליפוזומים למשך לילה בנוטטור בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. למחרת, העבירו את הליפוזום למבחנת אולטרסנטריפוגה בנפח של 25 milliliter באמצעות מסנן עמודה כדי להסיר את החרוצים, ומדללו את הדגימה עוד יותר לנפח של 25 milliliters. לאחר סבוב של הדגימות ב-168,000 ×g למשך שעתיים, שפכו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע (pellet) באמצעות 100 microliters של Buffer B. לצורך ביצוע ספקטרוסקופיית EPR בגל רציף, העבירו תחילה את תרחיף הליפוזומים למבחנה של 200 microliter והשקיעו את הדגימות באמצעות סנטריפוגה.לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), הדגימה מוכנה למדידות EPR. הסר כמה שיותר בופר מדגימת הליפוזומים. כדי לבצע החלפת בופר, העבר 20 microliters של משקע הליפוזומים למבחנת מיקרו-צנטריפוגה באמצעות פיפטה.הוסף 180 µL של Buffer D והדגר בטמפרטורה של 42 °C למשך חמש דקות. סבב את הדגימה בצנטריפוגה, הסר את העלייה באמצעות פיפטה, וחזור על התהליך שלוש פעמים כדי להבטיח החלפה מלאה של הבאפר. קפילרות פלסטיק חדירות לגז מתאימות למדידות הן של צורות קווי ספקטרום והן של נגישות ממס.הקישו את הקפילרה על משקע הפרוטאו-ליפוזום כדי לשאוב את הדגימה פנימה, ואטמו את הקצה באמצעות שעוות עצם. מוצג כאן האפיון הביוכימי של מוטציות GLIC מסומנות בספין באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל של GLIC מסומן בספין לאחר שבירה פרוטאוליטית של תג ה-MBP. הפסגות תואמות לפנטמר של GLIC ול-MBP חופשי.ג'ל SDS-PAGE מציג את חלבון היתוך GLIC-MBP המונומרי שלא נחתך לפני סינון ג'ל, וכן את פראקציות ה-MBP וה-GLIC שהופקו מסינון הג'ל. בוצע מבחן מבוסס FRET לניטור מצב האגרגציה של GLIC ששוחזר בתוך ליפידים ממברנתיים שונים. מדידות FRET בוצעו עבור דגימות לאחר שחזור למשך לילה ואחרי מספר מחזורים של הקפאה והפשרה של הדגימות.בשיטת inside-out patch שגולש מווסיקולות asolectin ששוחזרו, GLIC מופעל על ידי קפיצות pH באמצעות מחליף תמיסות מהיר. נראה כי התעלות מופעלות תוך כ-10 milliseconds ומגיעות למצב של דה-סנסיטיזציה עם קבוע זמן של שנייה אחת עד שלוש שניות. במהלך הפעלת התעלה נצפו ארגון מחדש מבני.כאן, ספקטרום של תהודה פראמגנטית של אלקטרונים (EPR) בגל רציף עבור מיקום בסליל M2 המצפה את הנקב, מראה שינויים באמפליטודה ובצורה בתגובה לשינויים ב-pH. ספקטרוסקופיית EPR היא גישה מבנית ללא תחרות למדידת שינויים קונפורמציונליים של חלבוני ממברנה בסביבתם הטבעית, והיא מספקת הצצה לפרטים מולקולריים של דינמיקת חלבונים המוסתרים במבני X-ray ברזולוציה גבוהה או במבני cryo-EM. בעת עבודה עם טכניקה זו, חשוב לזכור שמוטציות מובילות לעיתים קרובות ליציבות אוליגומרית נמוכה ודלה של החלבון.לפיכך, ייתכן שתצטרכו לגבש אסטרטגיה להתמודדות עם בעיות אלו. שילוב הממצאים ממחקרי EPR אלו עם מדידות פונקציונליות יכול להעניק לנו תמונה מלאה יותר לבחינת הקשר בין המבנה לתפקוד, וההתקדמויות הטכנולוגיות העתידיות שואפות להשתמש בגישה עוצמתית זו כדי לחקור תעלות אנושיות מורכבות יותר בתנאי ליפידים מתוחכמים יותר.

site-directed-spin-labeling-epr-spectroscopic-studies-pentameric

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

אנו מתארים פרוטוקול פשוט לזהות חלבונים במוח אשר נקלטות על ידי התחנה הסופית C מלא אורכו של ה-ATP-מגודרת P2X2 קולטנים. הרחבה ויישום שיטתי של גישה זו כל הקולטנים P2X צפוי להוביל להבנה טובה יותר של איתות לקולטן P2X.

Proteomics כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם ליגנד P2X2-מגודרת ערוצי קטיון

נתאר שיטה אשר מודד את קינטיקה של תחבורה יון של חלבונים בממברנה לצד ניתוח אתר ספציפי של שינויים קונפורמציה באמצעות הקרינה על תאים בודדים. טכניקה זו ניתנת להתאמה תעלות יונים, מובילי משאבות יונים יכול להיות מנוצל כדי לקבוע מגבלות המרחק בין יחידות משנה חלבון.

בחינת Dynamics קונפורמציה של חלבונים בממברנה באתרו עם תיוג, האתר מכוון פלואורסצנטי

אנחנו גנטיים מקודדים את חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs ולהראות את הרבגוניות של קבוצת azido ביישומים שונים. אלה כוללים טכנולוגיה ממוקדת photocrosslinking לזהות שאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR, ושינוי bioorthogonal אתר ספציפי של GPCRs עם תג פפטיד epitope או בדיקה ניאון.

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

פרוטוקול דיוק גבוהה ניסויים FRET ברמת מולקולה אחת מוצגת כאן. בנוסף, מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי לזהות שלושה מצבי קונפורמציה בתחום ליגנד מחייב של קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDA). קביעת מרחקים מדויקים היא הצעד הראשון לקראת בניית מודלים מבניים המבוססים על ניסויים סריג.

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

מאמר זה מתאר שיטות ספציפיות כדי לקבל כמויות הביוכימי של solubilized-חומרי ניקוי TRPV1 לניתוח spectroscopic. הפרוטוקולים המשולב לספק כלים הביוכימי biophysical זה ניתן להתאים להקל פונקציונלי מבניים ללימודי תעלות היונים בתרבית של סביבה מבוקרת ממברנה.

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

פרוטוקול זה מציג שיטה למדידת קשירת אדנין נוקלאוטיד לקולטנים בזמן אמת בסביבה תאית. הקישור נמדד כהעברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) בין נגזרות נוקלאוטידים של טריניטרופניל לבין חלבון המסומן בחומצת אמינו פלואורסצנטית לא קנוני.

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

מוצג פרוטוקול ליישום ספקטרוסקופיית NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית לזיהוי אינטראקציות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות חלשות וחולפות בחלבונים בעלי אי-סדר מהותי.

שיפור הרפיה פאראמגנטית לאיתור ואפיון אסוציאציות עצמיות של חלבונים לא מסודרים במהותם

מחקר זה מציג הליך מפורט לביצוע ניסויים של העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) על קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) באמצעות תיוג ספציפי לאתר באמצעות שילוב חומצות אמינו לא טבעיות (UAA). הפרוטוקול מספק מדריך שלב אחר שלב להכנת דגימות smFRET, ניסויים וניתוח נתונים.

הדמיה של הדינמיקה הקונפורמציונית של קולטני ממברנה באמצעות FRET של מולקולה בודדת

פרוטוקול זה מציג את הכלים הזמינים למידול ליגנדות של מולקולות קטנות במפות cryoEM של מקרומולקולות.

מידול ליגנדות למפות הנגזרות מקריומיקרוסקופ אלקטרונים

אלקטרופיזיולוגיה היא תקן הזהב לחקר פעילות תעלות היונים. עם זאת, ישנן גישות חלופיות רבות, כולל שיטות אופטיות. במאמר זה אנו מתארים שיטה לניטור הפעילות של תעלות אניון עשירות בלאוצין המכילות 8 ערוצי אניון (LRRC8) באמצעות שיטה מבוססת העברת אנרגיית תהודה בין תת-יחידות Förster (FRET).

ניטור פעילות חוזרת עשירה בלאוצין המכילה 8 ערוצים (LRRC8/VRAC) באמצעות העברת אנרגיית תהודה של Förster עם פליטה רגישה (SE-FRET)

למד שיטות לתיוג ספין מכוון אתר וספקטרוסקופיית EPR בערוצים מוגדרי ליגנד פנטמריים. פרוטוקול זה מאפשר חקר דינמיקת חלבוני ממברנה בסביבה פיזיולוגית רלוונטית.

תיוג ספין בימוי אתר ולימודי ספקטרוסקופיות EPR של pentameric ליגנד מגודרת יון ערוצים

גלה סרטונים נוספים