תיוג ספין בימוי אתר ולימודי ספקטרוסקופיות EPR של pentameric ליגנד מגודרת יון ערוצים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים את הטיהור, סימון הספין המכוון לאתר (site directed spin labeling) וההרכבה מחדש (reconstitution) של תעלה פנאמרית (penameric) מופעלת-ליגנד לצורך מחקרי תהודה פאראמגנטית של אלקטרונים (EPR). חקר הדינמיקה של חלבוני ממברנה בסביבה רלוונטית פיזיולוגית הוא קריטי להבנה מלאה של אופן הפעולה של חלבון הובלה זה בממברנה. בשל צרכים אלו, אני סבור כי טכניקת ה-EPR וסימון ספין מכוון לאתר הן מתאימות באופן אידיאלי.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא אינה מוגבלת על ידי גודל החלבון. לכן, סימון ספין מכוון-אתר (site directed spin labeling) וספקטרוסקופיית EPR יהיו הטכניקה המועדפת אם ברצונכם לחקור דינמיקה של חלבונים גדולים או חלבונים ששוחזרו בממברנות. הכניסו מוטציות של ציסטאין בודד בגן GLIC באמצעות מוטגנזה מכוונת-אתר.

הכינו תרבית לילה של מוטציית הציסטאין של GLIC כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הוסיפו 100 milliliters של בופר פוטסיום פוספאט סטרילי למצע terrific broth שעבר אוטוקלאב. לאחר מכן, הוסיפו גלוקוז סטרילי, Kanamycin, ו-10 milliliters מהתרבית של הלילה.

דגרו בטמפרטורה של 37 °C במנער במהירות של 250 rpm. הוסיפו 50 milliliters של glycerol והמשיכו בניעור של התרבית עד שהצפיפות האופטית באורך גל של 600 nanometers תגיע ל-1.0 עד 1.2. לאחר השראת התאים באמצעות 200 micromolar IPTG, הגדירו מחדש את המנער ל-250 rpm ודגרו למשך כ-16 שעות בטמפרטורה של 18 °C.

קצרו את התאים בבקבוקי צנטריפוגה של ליטר אחד על ידי סבוב ב-8500 ×g, בטמפרטורה של 4 °C, למשך 15 דקות. שפכו את העלייה (supernatant) ושקלו את הבקבוק עם משקע התאים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. השהו מחדש את משקע החיידקים ב-150 milliliters של בופר A קר מאוד (בטמפרטורת קרח) לכל ליטר אחד של תרבית.

בצע הומוגניזציה לתאים על ידי העברתם דרך מפרק תאים (cell disrupter) בחדר קירור בטמפרטורה של 4 °C. חזור על הפעולה שלוש פעמים כדי להבטיח שרוב הבקטריות יולסו. סבב את התאים בצנטריפוגה ב-14,000 ×g למשך 15 דקות.

לאחר מכן, שאבו את supernatant באמצעות פיפטה והעבירו אותו למבחנת צנטריפוגה נקייה. לאחר סבב צנטריפוגה של ה-supernatant במהירות של 168,000 ×g למשך שעה אחת, שפכו בזהירות את ה-supernatant מבלי להפריע למשקע הממברנה. הוציאו את משקע הממברנה מתוך ליטר אחד של תרבית והשביו אותו ב-Buffer A, בתוספת 10% glycerol, לנפח סופי של 50 milliliters.

הוסיפו 0.5 grams של DDM לתמיחת הממברנה והעבירו במיקסר נוטטור למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius. לאחר המסת הממברנה, הסירו את שיירי התאים מהליזט באמצעות סנטריפוגציה ב-168,000 ×g למשך שעה אחת. במקביל, הכינו שרף amylose.

העבירו שלושה מיליליטר של שרף באמצעות פיפט לתוך עמודת כרומטוגרפיה ריקה מפוליפרופילן. שטפו את השרף על ידי העברת 10 נפחי עמודה של מים שלוש פעמים, ולאחר מכן 10 נפחי עמודה של Buffer A, המכיל 0.5 millimolar DDM. לאחר סרטיפוגציה, הוציאו בעדינות את העלייה באמצעות פיפט והעבירו לשפופרת קונית נקייה של 50 מיליליטר.

עבור קישור באצוות, הוסף שרף עמילוז שעבר שיווי משקל מוקדם לשפופרת הקונית. קשור את החלבון שבודד לשרף העמילוז על ידי ערבוב התערובת במכשיר נוטטור (nutator) למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבר את כל התוך (slurry) דרך עמודת כרומטוגרפיה ואסוף את השטוף (flow-through).

דללו את חלבון ה-GLIC עם 10 milliliters של Buffer A המכיל 40 milliomolar מלטוז בנוסף ל-0.5 millimolar DDM ו-05 millimolar TCEP. TCEP מונע חמצון של שרשראות צד של ציסטאין. אספו את כל ה-eluite.

רכז את החלבון שנאלוט באמצעות מרכז צנטריפוגלי עד לריכוז של בין 4 ל-6 mg/mL. הוסף HRV 3C protease והדגר למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. לצורך ביצוע סימון ספין מכוון לאתר (site directed spin labeling), הוסף תחילה עודף מולרי של פי עשרה של MTSL spin label לדגימה שעברה עיכול על ידי הפרוטאז, כדי להגיע ליחס מולרי של 1:10 בין מונומר GLIC ל-MTSL.

לאחר דגירה של שעה אחת, הוסף תגית ספין נוספת ביחס של עודף מולרי פי חמישה ודגור למשך שעה נוספת. העבר את הדגימה דרך עמודת כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבונים להפרדה לפי גודל (size exclusion FPLC), שהועמדה מראש בשיווי משקל עם Buffer A ו-0.5 millimolar DDM, כדי להפריד את תגית ה-MBP שהוסרה ואת עודפי תגית הספין החופשית מהפנטמרים של GLIC. רכז את תמיסת החלבון באמצעות מרכז צנטריפוגלי לריכוז סופי של כ-8 עד 10 mg/mL והנח אותה על קרח.

הדגימה מוכנה כעת לשחזור. כדי להכין את הליפוזומים, שטפו בקבוק עגול תחתית נקי בנפח 25 milliliter עם חמישה milliliters של כלורופורם ויבשו את הבקבוק תחת זרם של גז חנקן במנדף. לאחר מכן, העבירו 10 milligrams של asolectin אל הבקבוק ויבשו את הליפידים תחת זרם רציף של גז חנקן.

לאחר התאדות הכלורופורם, הניחו את הבקבוק בוואקום למשך שעה אחת כדי להבטיח ייבוש מלא. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של Buffer A לשחזור לליפיד המיובש וערבבו את הבקבוק ב-vortex בעוצמה כדי להביא את משקע הליפיד למצב של סספנסיה. להכנת וזיקולות יחיד-שכבתיות קטנות (small unilamellar vesicles), בצעו סוניקציה לסספנסיית הליפיד בתוך מכשיר סוניקטור עם אמבט קר, עד שתמיסת הוזיקולות תהפוך לשקופה פחות או יותר ולא ייראו גושים.

לתערובת זו, הוסף DDM לריכוז סופי של 4 mM והדגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. כדי לשחזר את החלבון, הוסף את החלבון המטוהר לתערובת הליפידים. לאחר הדגרת הדגימה בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה אחת תוך סיבוב עדין, דלל את הדגימה ל-15 mL באמצעות Buffer A. הסר את שאריות הדטרגנט מהתליה באמצעות חרוזי פוליסטירן בעלי נקבוביות הידרופוביות הלוכדות דטרגנט.

הוסיפו 80 milligrams של חרוצים נקיים והדגירו את תרחיף הליפוזומים למשך לילה בנוטטור בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. למחרת, העבירו את הליפוזום למבחנת אולטרסנטריפוגה בנפח של 25 milliliter באמצעות מסנן עמודה כדי להסיר את החרוצים, ומדללו את הדגימה עוד יותר לנפח של 25 milliliters. לאחר סבוב של הדגימות ב-168,000 ×g למשך שעתיים, שפכו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע (pellet) באמצעות 100 microliters של Buffer B. לצורך ביצוע ספקטרוסקופיית EPR בגל רציף, העבירו תחילה את תרחיף הליפוזומים למבחנה של 200 microliter והשקיעו את הדגימות באמצעות סנטריפוגה.

לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), הדגימה מוכנה למדידות EPR. הסר כמה שיותר בופר מדגימת הליפוזומים. כדי לבצע החלפת בופר, העבר 20 microliters של משקע הליפוזומים למבחנת מיקרו-צנטריפוגה באמצעות פיפטה.

הוסף 180 µL של Buffer D והדגר בטמפרטורה של 42 °C למשך חמש דקות. סבב את הדגימה בצנטריפוגה, הסר את העלייה באמצעות פיפטה, וחזור על התהליך שלוש פעמים כדי להבטיח החלפה מלאה של הבאפר. קפילרות פלסטיק חדירות לגז מתאימות למדידות הן של צורות קווי ספקטרום והן של נגישות ממס.

הקישו את הקפילרה על משקע הפרוטאו-ליפוזום כדי לשאוב את הדגימה פנימה, ואטמו את הקצה באמצעות שעוות עצם. מוצג כאן האפיון הביוכימי של מוטציות GLIC מסומנות בספין באמצעות כרומטוגרפיית סינון ג'ל של GLIC מסומן בספין לאחר שבירה פרוטאוליטית של תג ה-MBP. הפסגות תואמות לפנטמר של GLIC ול-MBP חופשי.

ג'ל SDS-PAGE מציג את חלבון היתוך GLIC-MBP המונומרי שלא נחתך לפני סינון ג'ל, וכן את פראקציות ה-MBP וה-GLIC שהופקו מסינון הג'ל. בוצע מבחן מבוסס FRET לניטור מצב האגרגציה של GLIC ששוחזר בתוך ליפידים ממברנתיים שונים. מדידות FRET בוצעו עבור דגימות לאחר שחזור למשך לילה ואחרי מספר מחזורים של הקפאה והפשרה של הדגימות.

בשיטת inside-out patch שגולש מווסיקולות asolectin ששוחזרו, GLIC מופעל על ידי קפיצות pH באמצעות מחליף תמיסות מהיר. נראה כי התעלות מופעלות תוך כ-10 milliseconds ומגיעות למצב של דה-סנסיטיזציה עם קבוע זמן של שנייה אחת עד שלוש שניות. במהלך הפעלת התעלה נצפו ארגון מחדש מבני.

כאן, ספקטרום של תהודה פראמגנטית של אלקטרונים (EPR) בגל רציף עבור מיקום בסליל M2 המצפה את הנקב, מראה שינויים באמפליטודה ובצורה בתגובה לשינויים ב-pH. ספקטרוסקופיית EPR היא גישה מבנית ללא תחרות למדידת שינויים קונפורמציונליים של חלבוני ממברנה בסביבתם הטבעית, והיא מספקת הצצה לפרטים מולקולריים של דינמיקת חלבונים המוסתרים במבני X-ray ברזולוציה גבוהה או במבני cryo-EM. בעת עבודה עם טכניקה זו, חשוב לזכור שמוטציות מובילות לעיתים קרובות ליציבות אוליגומרית נמוכה ודלה של החלבון.

לפיכך, ייתכן שתצטרכו לגבש אסטרטגיה להתמודדות עם בעיות אלו. שילוב הממצאים ממחקרי EPR אלו עם מדידות פונקציונליות יכול להעניק לנו תמונה מלאה יותר לבחינת הקשר בין המבנה לתפקוד, וההתקדמויות הטכנולוגיות העתידיות שואפות להשתמש בגישה עוצמתית זו כדי לחקור תעלות אנושיות מורכבות יותר בתנאי ליפידים מתוחכמים יותר.