הדור של בוגר, בוגרת Tolerogenic דנדריטים תאים, עם שינוי פנוטיפים מטבולית

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לייצר תאים דנדריטיים טולרוגניים ובוגרים ממונוציטים לצורך ניסויים או פיתוח חיסונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה על ידי מתן מודל לחקר ההתפתחות, ההתבגרות והצגת האנטיגן של תאים דנדריטיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת יצירת מספר רב של תאים דנדריטיים במבחנה לצורך ניסויים.

התחל בהעשרת מונוציטים על ידי ערבוב של 20 מיקרוליטר של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי שהוכנו בעבר, או תרחיף תאי PBMC עם 20 מיקרוליטר של טריפאן כחול, כדי לספור את מספר התאים החיים באמצעות ציטומטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את תרחיף התא. שאפו את הסופרנטנט לחלוטין, והשעו מחדש את כדור התא לריכוז של 80 מיקרוליטר של מאגר צביעה למשך 10 עד התאים השביעי.

הוסף 20 מיקרוליטר של חרוזי מיקרו CD-4 לכל 10 לתאים השביעיים. מערבבים היטב ומדגרים את התאים למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את התאים עם מיליליטר אחד של מאגר מכתים לכל 10 לתאים השביעיים, וצנטריפוגה את התאים.

שאפו את הסופרנטנט לחלוטין, והשעו מחדש את כדור התא. השג עמודה בינונית לכל היותר פעמיים 10 עד התאים הכוללים השמיניים, והנח את העמודה בשדה המגנטי של המפריד. לאחר מכן, שטפו את העמוד עם 500 מיקרוליטר של מאגר מכתים.

הצמיד את מתלה התא אל העמוד, ואסוף את התאים הלא מסומנים העוברים דרך העמוד בצינור של 15 מיליליטר. החלף צינור חדש של 15 מיליליטר מתחת לעמוד ושטוף את העמוד שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של מאגר מכתים. ודא שמאגר העמודים ריק לפני הוספת מאגר מכתים חדש בין כביסות.

הסר את העמוד מהמפריד והניח אותו על צינור טרי של 15 מיליליטר. פיפט מיליליטר אחד של מאגר מכתים על העמוד, ושטוף מיד את התאים המסומנים מגנטית על ידי דחיפה חזקה של הבוכנה לתוך העמוד. לאחר מכן, חזור על שלבי ההפרדה המגנטית באמצעות השבר המאויר בעמודה חדשה כדי להגביר את הטוהר של תאי CD14 פלוס.

זרע ארבע קבוצות של CD14 בתוספת מונוציטים בריכוז של נקודת אפס שלוש עד נקודת אפס חמש פעמים 10 עד השישית למיליליטר של מדיום תרבית תאים של IL-4 בשש צלחות באר. דגרו את התאים בחממת תרבית רקמה ב-37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוזי CO2. ביום הרביעי, הסר 850 מיקרוליטר מדיום מהתרבית, והצנטריפוגה.

שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים. מוסיפים את תערובת התאים בחזרה לתרבית. ביום החמישי, הוסף מיקרוליטר אחד של ציר ויטמין D3 ומיקרוליטר אחד של ציר דקסמתזון לליטר אחד של בינוני עד שניים מהסטים, כדי ליצור moDCs טולרוגניים.

ביום השישי, הוסף 200 ננוגרם למיליליטר של GMCSF ו-200 ננוגרם למיליליטר של IL-4 לכל הסטים. הוסף מיקרוגרם אחד למיליליטר של LPS לאחת מהערכות שטופלו רק ב-GMCSF ו-IL-4 כדי ליצור moDCs בוגרים. הוסף מיקרוגרם אחד למיליליטר של LPS לקבוצה אחת של moDCs טולרוגניים כדי ליצור moDCs טולרוגניים של LPS.

לבסוף, ביום השביעי, קצרו את הסוגים השונים של moDCs על ידי שטיפת צלחת התרבות עם PVS EDTA. ה-moDCs הלא בשלים נוצרו על ידי הוספת GMCSF ו-IL-4 ל-CD-14 מטוהר בתוספת מונוציטים בימים אפס, ארבע ושש. תוספת של ויטמין D3 ודקסמתזון לאחר GMCF ו-IL-4 הביאה להתמיינות של moDCs לא בשלים ל-moDCs טולרוגניים.

LPS נוסף כדי לגרום להבשלה של moDCs לא בשלים ל-moDCs בוגרים. ו-moDCs טולרוגניים עוררו עם LPS כדי לוודא עמידות להתבגרות. ניתוח של סמני משטח DC גילה כי מודיקים בוגרים מבטאים את הרמות הגבוהות ביותר של סמני התבגרות HLA-DR, CD80, CD83 ו-CD86.

לעומת זאת, moDCs טולרוגניים הראו ביטוי מוגבר של CD14, BDCA3 ותעתיקים דמויי אימונוגלובולין בהשוואה ל-moDCs לא בשלים ובוגרים. באמצעות CMXRos אדום כדי לשקף פעילות מיטוקונדריאלית, נצפו moDCs טולרוגניים בעלי פעילות מיטוקונדרית גבוהה יותר בהשוואה לתת-סוגים אחרים של moDC. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור תכונות מטבוליות בתאים דנדריטיים לפיתוח חיסונים ואימונותרפיה.