רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לחקור באופן שיטתי את נוף מתילציה של DNA ברחבי הגנום בקבוצות מטופלים גדולות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנטי, במיוחד בכל הנוגע לאילו אזורים בנוף מתילציה של DNA מקבלים דה-ויסות בחולים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לחקור מספר רב של מטופלים בצורה חסכונית.

לטכנולוגיה זו יכולות להיות השלכות חיוביות על הטיפול והאבחון של המטופל מכיוון שאנו יכולים לחקור סמנים ביולוגיים קיימים וגם לזהות סמנים ביולוגיים חדשים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי עוקבת המטופלים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון מתילציה של DNA בתאים שמקורם בקווי תאים מתורבתים מדגימות שמקורן בעכבר. מי שידגים את ההליך הזה יחד עם ד"ר יא-טינג סו יהיה מר ג'וזף ליו, טכנאי במעבדה שלנו.

חלק הרצף יודגם על ידי גב' דון גרסיה שהיא טכנאית בליבת הריצוף שלנו. לאחר בידוד DNA גנומי מגידול או רקמה רגילה על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף 1.2 מיקרוגרם של DNA גנומי כולל ל-96 מיקרוליטר של מאגר TE ו-24 מיקרוליטר של מאגר כביסה 5X כדי ליצור תמיסה של 120 מיקרוליטר. סוניקציה של תמיסת ה-DNA למשך 30 שניות, ואז הניחו לה לנוח במשך 30 שניות.

חזור על הסוניקציה בסך הכל 20 עד 25 פעמים. השתמש במערכת ביו-אנלייזר עם ערכת DNA מסחרית בעלת רגישות גבוהה על פי פרוטוקול היצרן כדי להפעיל מיקרוליטר אחד של תמיסת DNA סוניקטיבית כדי לבדוק את גודל השברים. הם צריכים להיות בטווח של 150 עד 350 זוגות בסיסים.

כדי לבצע פליטת שבר בודד, הכן את מאגר הפליטה על ידי הכנת תמיסה אחד לאחד של מאגר דל מלח ומאגר מלח גבוה. השתמש ב-200 מיקרוליטר של מאגר הפליטה כדי להשעות מחדש את חרוזי ה-DNA או ה-MBD קושרי המתיל ולדגור את המתלה על מערבל מסתובב למשך שלוש דקות. לאחר הדגירה, הנח את הצינור על המתלה המגנטי למשך דקה אחת, ולאחר מכן פיפטה בזהירות את הנוזל מבלי לגעת בקצה הפיפטה על החרוזים והעביר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי ללא DNase.

אחסן את הדגימה הזו על קרח. חזור על הפליטה עבור הדגימה השנייה ואסוף אותה באותו צינור כמו הדגימה הראשונה. לכל שבר שטיפה ודילול שלא נלכד, הוסף מיקרוליטר אחד של גליקוגן, עשירית מהנפח של שלושה נתרן אצטט מולארי, pH 5.2 ושני נפחי דגימה של 100% אתנול.

לאחר ערבוב התמיסה היטב, יש לדגור בחום שלילי של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. לאחר מכן צנטריפוגה את התגובה ב 11, 363 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. השליכו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה והוסיפו 500 מיקרוליטר אתנול קר 70%.

סובב את הצינור שוב לפני שתחזור על שטיפת האתנול. יבש את הגלולה באוויר למשך חמש דקות. לאחר מכן השתמש במים או במאגר ללא DNase כדי להשעות אותו מחדש.

בדוק שהכמות הכוללת של DNA היא מעל 20 ננוגרם לפי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן הניחו את הדנ"א על קרח או אחסנו בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. להכנת ספריית ריצוף DNA, השתמש במערכת בניית ספריות אוטומטית לחלוטין ופעל לפי הפרוטוקול הסטנדרטי שסופק על ידי היצרן.

בחר מקטעי DNA באורך של 200 עד 400 זוגות בסיסים להכנת הספרייה. לאחר הכנת ספריית ריצוף ה-DNA, הסר את התגובה והשתמש במערכת כימות פלואורומטרית כדי לכמת את ספריית ריצוף ה-DNA. כדי להגדיר תגובת הגברה של PCR, בשפופרת PCR הוסף 15 מיקרוליטר של ספריית ריצוף DNA, 25 מיקרוליטר של תערובת מאסטר PCR, שני מיקרוליטר של תערובת פריימר PCR ושמונה מיקרוליטר מים.

השתמש בתוכנית המתוארת בפרוטוקול הטקסט, ובצע התאמות לפי הצורך על סמך המלצות יצרן תערובת ה-PCR. בצע מספיק מחזורים כדי לייצר 2 עד 10 מילימולר של DNA ספרייתי. לאחר ניקוי תגובות ה-PCR, ברקוד כל דגימה ומשוך ארבע דגימות יחד לנתיב אחד של תא זרימה.

השתמש בפרוטוקול הסטנדרטי של 50 זוגות בסיסים לקריאה יחידה של הרצף שלנו. לבצע ביואינפורמטיקה על פי פרוטוקול הטקסט. באמצעות כובע MBD המבקש לזהות איי CpG על פני אזורים גנומיים שונים שעוברים מתילציה דיפרנציאלית בגידול ביחס לרקמה תקינה, מחקר זה גילה כי מתוך סך איי ה-CpG הממוקמים במקדמי גנים, 19.5% הראו מתילציה דיפרנציאלית בגידולים בהשוואה לנורמה.

באופן דומה, 55.2% מאיי ה-CpG התוך-גניים שנחקרו הראו מתילציה דיפרנציאלית. מקדמים תוך-גניים הראו 28.1%ועבור מקדמי גנים ללא איי CpG, 1.8% הראו מתילציה דיפרנציאלית. מפת חום זו מתארת בבירור אזורים שעברו מתילציה דיפרנציאלית על פני 77 גידולי שד, 10 רקמות תקינות בשד ו-38 קווי תאים של סרטן השד.

באיור זה, מתילציה מכומתת בשתי תת-קבוצות של סרטן רירית הרחם, לא חוזר לעומת חוזר, בשתי חולות באתרי CpG שונים באי המקדם CpG של גן המטרה המזוהה SFRP1. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבעה עד חמישה ימים אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק תחילה את איכות ה-DNA הגנומי הנבדק. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כמו pyrosequencing על מנת לענות על שאלות כמו, מהם ה-CpGs המדויקים באזורים המועשרים באופן דיפרנציאלי שזוהו שהשתנו? לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האפיגנטיקה לחקור מתילציה של DNA בקבוצות חולים גדולות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור מתילציה של DNA ברחבי הגנום בדגימות מטופלים באמצעות טכניקת ריצוף כובע MBD. זכור זאת, לפעמים זה יכול להיות קשה לתפוס את האיכות הגבוהה של ה-DNA כגון FFP ודגימות DNA, ולכן הערכה נכונה של ה-DNA הגנומי תמיד נלקחת כאשר אנו מבצעים את ההליך.