משטר phenotyping עבור עכברים מהונדסים גנטית בשימוש ללמוד גנים מעורבים מחלות אנושיות של הזדקנות

המטרה הכוללת של משטר בדיקות זה היא להקים סדרה של בדיקות פשוטות שיכולות לשמש כצינור פנוטיפ ראשוני כדי לכוון חקירות מפורטות לאחר מכן על פנוטיפים התנהגותיים ועל המבנה והתפקוד של רקמות. האם הפנוטיפים ההתנהגותיים והתאים של מחלות אנושיות מסוכמים במודל העכבר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע את הבדיקות במעבדות ללא ניסיון קודם בניסויים כאלה ללא השקעה משמעותית אך עדיין מחקרים מפורטים נוספים.

ערכו את בדיקת הגפיים האחוריות מדי יום מהיום הרביעי עד ה-10 לאחר הלידה כדי להעריך את חוזק שרירי הגפה האחורית הפרוקסימלית, חולשה ועייפות. כדי להתחיל, תנו לעכברים להתאקלם באזור הבדיקה למשך 30 דקות. בינתיים הכינו צינור חרוטי חדש של 500 מיליליטר על ידי שטיפתו עם אתנול 70% ולאחר מכן דחיפה של צמר גפן אחד או שניים לתחתית הצינור.

אבטח את הצינור הזה במצב אנכי לבדיקה. כאשר לא נבדקים, שמרו את הגורים עם הסכר כדי לשמור על הטמפרטורה שלהם. לאחר חצי שעה של התאקלמות, הוציאו גור מהכלוב ורשמו את משקלו.

לאחר מכן תלו בעדינות את היילוד בגפיו האחוריות מעל שפת הצינור, כך שהגור פונה לכותנה. לאחר מכן ספרו את מספר ניסיונות המשיכה שביצע הגור ומדדו את זמן ההשהיה שלו ליפול. לאחר המתנה של 30 שניות, חזור על הבדיקה.

לאחר הבדיקה השנייה, סמנו את הגור בטוש. לאחר מכן שפשפו את הגור בעדינות עם מצעים מהכלוב הביתי והחזירו אותו לסכר. מכיוון שלא ניתן לסמן גורי P8 מבוגרים יותר, זהו אותם עם גזירה של הבוהן.

לפני שתמשיך לגור הבא, נגב את המבחנה עם 70% אתנול. נהל את מבחן תצפית הגמילה מדי יום מ-P19 עד P21 כדי להעריך את רמות התנועה והפעילות הכללית. התחל בלתת לעכברים להתאקלם באזור הבדיקה למשך 30 דקות.

בזמן שהגורים מתאקלמים, הכינו את הזירה. סמן קופסת בדיקה פרספקס עם רשת של שישה על שש של ריבועים בגודל שני אינץ'. לפני השימוש בקופסה, נקה אותה עם 70% אתנול.

לאחר מכן מקם מצלמת וידאו כך שתצוגה צדדית של הקופסה כולה תמלא את שדה הראייה. תקנן את מראה הסביבה כדי להימנע מהכנסת חידוש. לפני הבדיקה, העבירו את הגמילה לכוס אחיזה נקייה ורשמו את משקלה.

ואז החלה הקלטת וידאו. ראשית, צלם תעודת זהות לבדיקה עם מספר זיהוי העכבר, גילו והתאריך הנוכחי. לאחר מכן העבירו את העכבר מכוס האחיזה לריבוע המרכזי.

במשך שלוש דקות, ספרו את מספר הקווים שנחצו על ידי שתי הכפות הקדמיות. לאחר שלוש דקות, החזר את העכבר לכלוב נקי וסיים את הקלטת הווידאו. בין כל בדיקה, נקה את הקופסה עם 70% אתנול.

מהסרטונים, ספרו את אירועי הגידול, כלומר כאשר עכבר עומד עם שתי הכפות הקדמיות נקיות מתמיכה. ספרו גם את אירועי הטיפוח, המתרחשים כאשר שתי הכפות הקדמיות עוסקות בניקיון. ערכו את מבחן חוזק האחיזה בימים לסירוגין בין P22 ל-P26 כדי להעריך את החוזק העצבי-שרירי.

כרגיל, תנו לעכברים 30 דקות להסתגל לאזור הבדיקה. מנגנון הבדיקה הוא קופסת פרספקס עם רשת רשת. נקו את שניהם עם 70% אתנול.

לאחר מכן מרפדים את תחתית הקופסה בשכבת ניילון בועות לריפוד ומכסים את ניילון הבועות בנייר לספיגת הפרשות. המשך להפריד את עכברי הבדיקה ולהעמיס אותם לכוסות בודדות. כעת, הנח את העכבר הראשון על מרכז רשת התיל והפוך לאט את הרשת לגובה של 10 עד 20 סנטימטרים מעל המשטח הרך של הקופסה.

מדוד את ההשהיה לנפילה או סיים את הבדיקה לאחר 60 שניות, אם העכבר לא נופל. לאחר מכן החזר את העכבר הראשון לכוס האחיזה. בין הבדיקות, נגב את הרשת באתנול 70% והחלף את הנייר מעל ניילון הבועות.

לאחר מכן ערכו את הבדיקה על שני העכברים האחרים בקבוצה. לאחר שכל עכבר נבדק פעם אחת, חזור על התהליך פעמיים נוספות במשך שלושה ניסיונות לכל עכבר. אם יש פחות משלושה עכברים בקבוצה, ודא שיש זמן התאוששות בין ניסויים של לפחות חמש דקות.

להכנת כתמי NADH Diaphorase, יש לשלב כמויות שוות של תמיסת NADH טרייה ותמיסת NBT טרייה. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת מכתים לכל שקופית ודגרו את השקופיות בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עבור כתם סוקסינט הידרוגנאז, הכינו תמיסה של 0.1 נתרן סוקסינט מולרי, 1.25 NBT מולרי ו-0.2 מאגר פוספט מולרי.

לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד לכל שקופית. ארזו את המגלשות בתא לח ודגרו על המגלשות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר הדגירה עם כל אחד מהכתמים, שאפו את תמיסת הצביעה ושטפו את השקופיות שלוש פעמים במים מזוקקים.

לאחר מכן שטפו את המגלשות דרך סדרה של אמבטיות אצטון שמגבירות ויורדות בריכוז. עם כל ריכוז של אצטון, בצע שלוש שטיפות במשך שתי דקות בכל שטיפה. לבסוף, שטפו את השקופיות שלוש פעמים במים מזוקקים.

ואז הרכיבו את השקופיות במדיום מימי. עכברים ללא ביטוי HTRA2 נבדקו באמצעות סוללת הבדיקות המתוארת והושוו לבקרות של בני זוג המלטה. לא נראה שינוי במספר המשיכות או בהשהיה לנפילה בין P4 ל-P6. בין P7 ל-P10 נצפתה ירידה בכוח העצבי-שרירי.

במבחן הפעילות הייתה פעילות מופחתת של עכברי נוקאאוט HTRA2. עכברי נוקאאוט HTRA2 הראו גם ירידה בחוזק במבחן אחיזת רשת התיל. צביעת H ו-E מראים כי לעכברי הנוקאאוט HTRA2 לא היו שינויים נראים לעין במבנה הרשתית בהשוואה לביקורת ב-P35.

לבסוף, צביעה היסטוכימית לפעילות מורכבת של שרשרת הובלת אלקטרונים שימשה לזיהוי שינויים בתפקודי אנזימי הנשימה. הייתה ירידה בכתמים בעכברי נוקאאוט HTRA2 בהשוואה לביקורת. זה נצפה במוח הקטן ובסטריאטום, אך לא בקליפת המוח.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך את הפעילות והחוזק העצבי-שרירי של עכברים מהונדסים גנטית, כמו גם כיצד לשלב מחקרים אלה עם צירים תאיים. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.