Name: רגיש מאוד מהיר קרינת איתור עם Analyzer Portable סריג (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: למד כיצד לכמת תכולת סוכר במשקאות באמצעות ניתוח FRET נייד ורגיש. שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של מולקולות קטנות כמו מלטוז בטמפרטורה אופטימלית של 53 מעלות צלזיוס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענקים ממרכז ביולוגית Intelligent הסינטטי של פרויקט Frontier גלובל (2011-0031944) ותכנית יוזמת מחקר KRIBB.

1. הכנת biosensor <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות את הפלסמיד pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 ידי ביצוע הפרוטוקול בעבר המבוסס 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מ&quot;ל של מרק לוריא (LB) עם מושבה אחת של זן Escherichia coli DE3 לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 מ&quot;ל של התרבות O / N לתוך בקבוק 500 מ&quot;ל המכיל 100 מ&quot;ל LB ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה רועד עד צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) מגיע 0.5 (כ -3 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים צינור חרוטי 50 מ&quot;ל על ידי צנטריפוגה ב g 1,000 × במשך 20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה במהירות בצינור אחד עם 50 מ&quot;ל מים מזוקקים קר כקרח (DW) ו צנטריפוגות ב 1000 גרם × במשך 20 דקות ב 4 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 50 μl של DW קר כקרח עם 10% (v / v) גליצרול ידי מתערבל בעדינות עד הפתרון (תאי electrocompetent) מגיעה OD 600 </sub&gt; של 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התערובת של תאים electrocompetent (50 μl של התאים ב OD של 600 100) ו -10 ננוגרם של פלסמיד pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 בתוך קובט electroporation קר כקרח בהתקן electroporation ו electroporate את התערובת (ס&quot;מ / 18 ק, 25 μF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף במהירות בינונית SOC 1 מ&quot;ל ל קובט ו resuspend התאים בעדינות, ואחריו התאוששות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם רעד עדין בתוך 15 מ&quot;ל צינור מסביב לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את התאים על צלחת LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד מושבה אחת באמצעות לולאה ולחסן את המושבה ב 10 מ&quot;ל של LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב 37 מעלות צלזיוס שייקר במשך 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של התרבות הזרע עד 500 מ&quot;ל של LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו דגירה תרבות חממה רועד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;מ איזופרופיל β-D-thiogalactoside (IPTG) כאשר מגיע OD 6000.5 דגירת תרבות חממה רועדת 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 4500 גרם × במשך 20 דקות (4 ° C) ובעדינות להסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 5 חיץ מחייב מ&quot;ל (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 מ&quot;מ PMSF, 0.5 mM EDTA, ו 1 מ&quot;מ DTT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate תאים על קרח עם שש התפרצויות של 10 שניות ב 200-300 W, לאחר כל פרץ עם 10 שניות של הקירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב 10,000 × גרמנו במשך 30 דקות ב 4 ° C עד גלולת פסולת הסלולר. העברת supernatant (חלבון מסיס) לתוך צינור אוסף חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג טיהור הזיקה של חלבונים חיישן סריג, עומס 4 מ&quot;ל של lysate התא פינה על עמודה זיקה Ni-נ.ת.ע (נפח של 5 מ&quot;ל) ולבצע assay כרומטוגרפיה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC) 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה פעם עם חמישה כרכים הטור של חיץ לשטוף לי (חיץ פוספט 50 מ&quot;מ, נתרן כלורי 300 מ&quot;מ, 10 מ&quot;מ imidazole, pH 7.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב לשטוף עם חמישה כרכים הטור של חיץ לשטוף II (חיץ פוספט 50 מ&quot;מ, נתרן כלורי 300 מ&quot;מ, 20 מ&quot;מ imidazole, pH 7.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute החלבון החיישן עם חמישה כרכים הטור של חיץ elution (חיץ פוספט 50 מ&quot;מ, 300 מ&quot;מ נתרן כלורי, 500 imidazole מ&quot;מ, pH 7.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתרכז desalt המדגם eluted, למלא concentrator (גודל הממברנה של 10,000 מגוואט) עם עד 20 מ&quot;ל של מדגם צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 3000 גרם ×. מילוי concentrator עם בופר פוספט 0.8% (PBS). חזור על פעולה זו פעמים, ראשון ממלא את הרכז עם 20 מיליליטר של מדגם, ולאחר מכן מילוי עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את החלבון החיישן מרוכז-מומלחים דה ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> מדידת 2. תכולת הסוכר באמצעות מנתח הסריג הערה: הפרטים של בניית מנתח הסריג תואר בעבודה הקודמת שלנו 7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון זיהוי של 0.8% PBS המכיל 0.2מיקרומטר של חלבוני החיישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל נתח הסריג. לחץ על כפתור &quot;UP&quot; למשך 2 שניות כדי לכייל את הטמפרטורה האופטימלית. כוונו את הטמפרטורה ל -53 מעלות צלזיוס באמצעות לחצני &quot;UP&quot; או &quot;למטה&quot; ולחץ על כפתור &quot;SET&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כיול, לחץ לחיצה ממושכת על &quot;UP&quot; או &quot;למטה&quot; כפתורים בו זמנית למשך 2 שניות. ודא צגי LED &quot;CALIB&quot; ולחץ על הכפתור &quot;SET&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 12.5 × 12.5 × 45 מ&quot;מ (אורך × רוחב × גובה) מלבני כלי-הפאות (קובט) המכיל PBS רק חיץ לתוך מחזיק קובט של הנתח ולחץ על כפתור &quot;SET&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את קובט עם אחד המכיל את פתרון זיהוי בלבד (ראה 2.1) ללא סוכר (מלטוז / סוכרוז) ולחץ על כפתור &quot;SET&quot; כדי לכייל את הבסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את קובט עם אחד המכיל את פתרון זיהוי עם סוכר 10 מ&quot;מ ולחץ על &quot;SET&quot;לַחְצָן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את תכולת הסוכר של מדגם משקה, לשים 1 מ&quot;ל מדגם משקה צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge ו צנטריפוגות ב g 16,000 × 1 דקות. הערה: סריג מבוסס חיישן מדידת קרינה יש את היתרון של לא הדורשים טיפול קדם מיוחד של המדגם כי רק 1% (v / v) של המדגם כלול מהנפח הכולל. עם זאת, אנו ממליצים להסיר כל חומר עלול להשפיע על מדידת הקרינה (למשל, תאים, חלקיקים מסיסים, שומנים, שומן, או כל חומר עם autofluorescence). בנוסף, אם חומצה חזקה, בסיס חזק, ניקוי סוכן (חומרי ניקוי), או חומר מתחלב (מתחלב) נמצאת בריכוז גבוה ועלולה להשפיע על המאפיינים של החיישן הביולוגי הסריג, יש להסירו באמצעות ממס אורגני או מנטרל. לדוגמא, כאשר שומן מתחלבים חלב מסולקים מן קפוא חטיפים, הדגימות הן centrifuged בתוך שפופרת microfuge ב 16,000 × g למשך 30 דקות, ואת betwee הנוזלn משקע בתחתית ואת השכבה העליונה של שומן חלב מופק. כמות שווה של הקסאן אז הוא הוסיף, ואחריו צנטריפוגה ב 15,000 g × למשך 30 דקות כדי לחסל שומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant עם מזרק 1 מ&quot;ל ולסנן אותו דרך פילטר מזרק (גודל נקבובי 0.2 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 0.1 מ&quot;ל מסוננים מדגם משקה בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל המכיל 0.9 מ&quot;ל PBS ו מערבולת בעדינות. הערה: זה קריטי כדי לדלל את המדגם משקה כראוי. במקרה זה, דילול 1,000 פי בוצע כך ריכוז הסוכר ייפול בתוך הטווח הדינמי של המכשיר. אנו ממליצים הערכת ריכוז סוכר היעד מראש על ידי פנייה תכולת הסוכר בתווית של המשקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של המדגם משקה מדולל (1%, V / V) כדי קובט המכיל 0.495 מ&quot;ל של פתרון זיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את קובט בבעל קובט של נתח סריג מחממי הפתרון מדגם ל -53 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;SET&quot; כדי למדוד את תכולת הסוכר. הערה אפשר להעריך את מדידת הסריג באמצעות קורא צלחת multilabel או ספקטרופוטומטר קרינה מצויד בהתקן פלטייה של בקרת טמפרטורה על ידי קריאת היחס ב 488/535 7,8 ננומטר. לגילוי סוכרוז, ובצע את הצעדים שיוצגו 1.1 כדי 2.12 עם חיישן CSY-LH 2. </li></ol>

<ol><li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li>
<li>Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+highly+responsive+fluorescence+resonance+energy+transfer+biosensors+for+detection+of+sugar+in+living+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).</li>
<li>Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+dynamic+range+of+fluorescent+indicators+for+Ca%282%2B%29+by+circularly+permuted+yellow+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).</li>
<li>Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+glutamate+release+from+neurons+by+genetically+encoded+surface-displayed+FRET+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).</li>
<li>Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+detection+of+protein+interactions+in+surface-supported+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers.</a> Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).</li>
<li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).</li>
<li>Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portable+FRET+analyzer+for+rapid+detection+of+sugar+content%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content.</a> Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).</li>
<li>Gam, J., Ha, J. -S., Kim, H., Lee, D. -H., Lee, J., Lee, S. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+analyses+at+critical+temperatures+can+magnify+the+signal+intensity+of+FRET-based+sugar+sensors+with+periplasmic+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins.</a> Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).</li>
<li>Hessels, A. M., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically-encoded+FRET-based+sensors+for+monitoring+Zn2%2B+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells.</a> Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).</li>
<li>Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+FRET+sensor+for+intracellular+heme%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme.</a> ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).</li>
<li>Addgene. Fluorescent Protein Guide: Biosensors. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/">https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/</a> (2015).</li>
<li>Rajendran, R., Rayman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+blood+glucose+testing+for+diabetes+care+in+hospitalized+patients%3A+an+evidence-based+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Diabetes+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review.</a> J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).</li>
<li>American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes-2013. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://care.diabetesjournals.org/site/misc/2016-Standards-of-Care.pdf">http://care.diabetesjournals.org/site/misc/2016-Standards-of-Care.pdf</a> (2015).</li>
<li>Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+and+signal-transducer+binding+sites+of+the+Escherichia+coli+galactose+chemoreceptor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein.</a> Science. 242, 1290-1295 (1988).</li>
<li>Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-containing+beverage+intake+in+toddlers+and+body+composition+up+to+age+6+years%3A+The+Generation+R+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study.</a> Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).</li>
<li>Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+food%2C+fat+and+sugar+sweetened+beverage+items+are+related+to+children%27s+dietary+energy+density%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density.</a> FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).</li>
<li>Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweetened+beverage+consumption+is+associated+with+increased+risk+of+stroke+in+women+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men.</a> J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).</li>
<li>Melkko, S., Neri, D. Calmodulin as an affinity purification tag. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMelkko%2C+S+%22E.+coli+Gene+Expression+Protocols%22">E. coli Gene Expression Protocols</a>. Vaillancourt, P. E. , Methods in Molecular Biology; 205. Humana Press. Totowa, NJ. 69-77 (2003).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

פרוטוקול זה מאפשר כימות מהיר ויעיל של תכולת הסוכר בדגימות משקות, באמצעות נתח מחוייט סריג 7 בטמפרטורה אופטימלית עבור חיישני סריג. המנתח נועד עם א-שפותח לאחרונה, להקת 405 ננומטר זול אולטרה סגול-LED כמקור האור ושני photodetectors עם פוטודיודה סיליקון. מכשיר זה הוא יותר יעיל וחסכוני יותר מאשר fluorometers הדומה. המכשיר הראה רגישות גילוי גבוהה, במיוחד כאשר מדידת היחס בין שתי להקות אורך גל פליטה (530 ננומטר ו -480 ננומטר) וזאת בזכות מגוון טמפרטורה אופטימלי עבור חיישני סריג. ה...

אנרגית העברת תהודת פורסטר (סריג) כבר בשימוש נרחב כחיישן ביומטרי לזיהוי מולקולות קטנות כגון סוכרים, יוני סידן, וחומצות אמינו 1-4. biosensors סריג מכילים חלבוני ניאון, חלבוני ניאון ציאן (CFPs), וחלבונים פלואורסצנטי צהוב (YFPs), אשר התמזגו בשני הקצוות של חלבונים קושרי periplasmic (PBPs). סוכרים להיקשר PBPs ממוקם באמצע חיישן סריג, ולגרום לשינויים מבניים לחיישן כי לאחר מכן לשנות את כיוון דיפול מרחק המעבר של שני חלבוני ניאון בכל צד של PBPs. שינוי זה מאפשר ניתוח כמותי של תכולת הסוכר על ידי מדידת היחס בין אורכי גל הפליטה של ​​EYFP (530 ננומטר) ECFP (480 ננומטר). בזכות הרגישות, סגוליות גבוהה, יכולת ניטור בזמן אמת, וזמן תגובה מהיר של חיישנים ביולוגיים סריג, חיישנים אלה נמצאים בשימוש נרחב ביישומים הסביבה, תעשייה, רפואה 5. יתר על כן, ratiomמדידת etric באמצעות חיישנים ביולוגי סריג יש יתרונות מעשיים חשובים, כפי שהוא יכול לשמש כדי למדוד רכיבים בדגימות ביולוגיות מורכבות שבו ריכוז החיישן לא ניתן לשלוט בקלות קרינת רקע הוא תמיד נוכחת. למרות יתרונות אלה של חיישנים מבוססים סריג להדמיה כמותית, שינויים מבניים קטנים עם העברת תנועת תחום שלם אל חלבוני הניאון לייצר עוצמת אות חלשה מטבעו. אות חלש זה מגביל את היישום של חיישנים מבוססי סריג עבור במבחנה או in vivo ניתוח 6. כתוצאה מכך, רוב הסריג biosensors דורש שימוש בציוד יקר ורגיש מאוד. בעבר, פתחנו מנתח סריג זול ונייד עם יכולות דומות לאלה של מנתחי הקרינה הקיימים 7. במכשיר זה, דיודה האור האולטרה סגול הלהקה 405 ננומטר זולה (LED) שימש כמקור האור לגרום עירור של הדואר אותות הקרינה, החלפת מנורה או לייזר יקר. מערכת זיהוי של הנתח ביעילות מתמקדת אות הקרינה שמגרש גבי שני photodetectors עם פוטודיודה סיליקון. במחקר שנערך לאחרונה יותר, הראינו כי אופטימיזציה של טמפרטורת זיהוי ב 50 - C ° 55 יכולה משמעותית להגדיל את אות סריג ratiometric 8. טמפרטורה ספציפית זה שיפור אות, יחד עם מנתח מחוייט הסריג, מאפשר שימוש חיישני סריג ביישומי אבחון כלליים יותר ברגישות מהירה וגבוהה. בפרוטוקול זה, הראינו את תחולתה הכללית של הנתח סריג בתנאי טמפרטורה סריג אופטימלי על ידי כימות שתכולת הסוכר משקאות זמינים מסחרית. פרוטוקול זה מספק את הפרטים של פעולת מכשיר סריג, וכן תיאור קצר של חיישן הכנת מדגם. אנו צופים כי דו&quot;ח זה יקדם את התחולה הפוטנציאלית של ניידמנתח בסביבות מעבדה בקנה מידה קטן לספק בסיס להמשך פיתוח של מכשיר אבחון באתר זול עם חיישנים ביולוגיים מבוססי סריג.

<table><tbody><tr><td>LB</td><td>BD</td><td>#244620</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל &בטא;-D-thiogalactoside (IPTG)</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Tri-HCl</td><td>Bioneer</td><td>C-9006-1</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioneer</td><td>C-9007</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Junsei</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4</td></tr><tr><td>SOC</td><td></td><td></td><td>2% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים, 10 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 10 מ"מ MGCl<תת>2, 20 מ"מ משאב גלוקוז</td></tr><tr><td>Q</td><td>Amersham Biosciences</td><td>17-1177-01</td><td>6 & פעמים; 30 מ"מ טור כרומטוגרפיה של חילופי אניונים&nbsp;</td></tr><tr><td>HisTrap HP1</td><td>Amersham Biosciences</td><td>29-0510-21</td><td></td></tr><tr><td>קובטה קוורץ</td><td>Sigma</td><td>Z802875</td><td></td></tr><tr><td>AK&Auml; KTAFPLC</td><td>Amersham Biosciences</td><td>18-1900-26</td><td>כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבון (FPLC)</td></tr><tr><td>Cary Eclipse</td><td>VarianInc</td><td></td><td>ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>VICTOR&nbsp; &nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td>קורא צלחות מרובות תוויות</td></tr> <tr><td>E. coli JM109 (DE3)</td><td>Promega</td><td></td><td>Electrocompetence Cells</td></tr><tr><td>A (משקה)</td><td>Korea Yakult Co. (קוריאה)</td><td>משקאות מותססים</td><td></td></tr> <tr><td>Birak B (משקה)</td><td>Lotte Foods (קוריאה)</td><td>Epro</td><td>משקה קל</td></tr><tr><td>C (משקה)</td><td>Lotte Foods (קוריאה)</td><td>Getoray</td><td>משקה ספורט</td></tr></tbody></table>

רגיש מאוד מהיר קרינת איתור עם analyzer portable סריג

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

שיפורים שנעשו לאחרונה תהודה העברת אנרגיה פורסטר חיישנים (סריג) אפשרו את השימוש בהם כדי לזהות מולקולות קטנות שונות כולל יונים וחומצות אמינו. עם זאת, את עוצמת האות החלשה המולד של חיישני סריג הוא אתגר גדול שמונע בקש בתחומים שונים והופך את השימוש יקר, high-end fluorometers צורך. בעבר, בנינו מנתח סריג חסכוני, בעל ביצועים גבוהים שיכול למדוד את היחס במיוחד של שתי להקות אורך גל פליטה (530 ו -480 ננומטר) כדי להשיג רגישות זיהוי גבוהה. לאחרונה, התגלה כי חיישני סריג עם חלבונים מחייבים periplasmic חיידקי לזהות הליגנדים ברגישות המקסימלית בטווח הטמפרטורה הקריטי של 50 - 55 מעלות צלזיוס. דו&quot;ח זה מתאר פרוטוקול להערכת תכולת הסוכר בדגימות משקות, זמינות מסחרי באמצעות מנתח הסריג הנייד שלנו עם חיישן טמפרטורת סריג ספציפי. התוצאות שלנו הראו כי preheating הנוסףתהליך של חיישן הסריג מגביר באופן משמעותי את אות יחס הסריג, כדי לאפשר מדידה מדויקת יותר של תכולת סוכר. מנתח הסריג מחוייט החיישן יושמו בהצלחה לכמת את תכולת הסוכר בשלושה סוגים של משקאות מסחריים. אנו צופים כי שיפור ביצועים והקטנת גודל נוסף של הציוד יקל על שימוש מנתחי כף יד בסביבות שבן ציוד high-end אינו זמין.

<html> כדי לבצע ניתוח כמותי של תכולת הסוכר באמצעות מנתח הסריג, יש צורך לבנות עקום מצוידת אמיד סוכר ריכוז היעד מייחס הסריג ציין. בואו r להגדיר את היחס בין עוצמת הפליטה של CFP ב 480 ננומטר ואת עוצמת הפליטה של YFP שנוצר ב 530 ננומטר (Eq. 1). <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/54144/54144equation1.jpg" /><p class="jove_content" fo:ke...

פרוטוקול זה מתאר את הכימות המהיר ורגיש מאוד של העברת אנרגית תהודת פורסטר נתוני חיישנים (סריג) באמצעות נתח סריג נייד מחוייט. המכשיר שימש לאיתור מלטוז בטווח טמפרטורה קריטית הממקסם רגישות זיהוי, שמאפשרים להעריך מעשית ויעילה של תכולת הסוכר.

רגיש מאוד מהיר קרינת איתור עם Analyzer Portable סריג

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים את הישימות הכללית של מנתח ה-FRET תחת תנאים אופטימליים, באמצעות כימות תכולת הסוכר במשקאות זמינים מסחרית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום החשיפה והניטור של מולקולות קטנות, כגון סוכר. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לנטר ביעילות תגובת אות רעננה למולקולות קטנות ללא צורך בפלואורומטרים יקרים ומתקדמים.את הפרוצדורה תדגים ד"ר Han מהמעבדה שלנו. ראשית, הכינו את הפלסמיד של החיישן הביולוגי הפלואורסצנטי בכחול ובצהוב הספציפי למלטוז או לסוכרוז. לאחר מכן, זרעו מושבה בודדה של DE3 E.Coli בתוך חמישה מיליליטר של מצע Luria broth, והדגרימו את התרבית בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור מדחף למשך 16 שעות.בשלב הבא, העבירו מיליליטר אחד של התרבית לבקרה המכילה 100 milliliters של LB. דגרו את הבקרה בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם ניעור עד שהצפיפות האופטית ב-600 nm תהיה כ-0.5. סובב את התרבית בצנטריפוגה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C. השביו במהירות את המשקע ב-50 milliliters של מים מזוקקים קרים מאוד, וסובבו שוב בצנטריפוגה למשך 20 דקות.שחזר את המשקע ב-50 µL של תמיסה הכוללת 10% נפח של גליצריול ומים מזוקקים קרים מאוד. סובב בעדינות את התערובת עד שהצפיפות האופטית ב-600 nm מגיעה ל-100. בקוvette לאלקטרופורציה קרה מאוד, ערבב את התערובת עם 10 ng של פלסמיד CMY.בצעו אלקטרופורציה לתערובת. בקוובט, השתהו את התאים ב-1 millileter של מצע SOC, ולאחר מכן העבירו אותם לפ attrib-tube בעל תחתית עגולה בנפח של 15 milliliter. המתינו להחלמה של התאים על ידי ניעור עדין ב-37 degrees למשך שעה אחת.פזרו את התאים על צלחת LB agar עם 100 µg/mL ampicillin. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 12 שעות. באמצעות לולאה, העבירו מושבה בודדת ל-10 mL של LB המכיל 100 µg/mL ampicillin.דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות תוך כדי ניעור למשך 12 שעות כדי להכין את תרבית הזרעה. העבירו חמישה מיליליטר של תרבית הזרעה ל-500 מיליליטר של LB עם ampicillin, ודגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות באינקובטור עם ניעור. כאשר הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר תגיע ל-0.5, הוסיפו IPTG עד להגעה לריכוז סופי של 0.5 מילימולאר.לאחר דגירה של התרבית למשך 24 שעות, סובבו את התאים בצנטריפוגה למשך 20 דקות. הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) והשעיקו מחדש את המשקע בחמישה מיליליטר של binding buffer. בצעו סוניקציה לתאים על קרח למשך 10 שניות, ולאחר מכן קררו את התאים למשך 10 שניות.חזור על פעולות הסוניקציה והקירור חמש פעמים נוספות. סנטריפוג את הליזט למשך 30 דקות. העבר את העילאי למבחנה נפרדת.טהרו את הנוזל העליון (supernatant) בעזרת עמודת זיקה מסוג nickel NTA. מלאו רכז תרכיזים של 10,000 milliwatt ב-20 milliliters של הדגימה המטוהרת. סובבו את הדגימה בצנטריפוגה למשך 10 דקות, ולאחר מכן מלאו שוב את רכז התרכיזים ב-0.8% phosphate buffered saline.חזרו על תהליך זה עם שאר הדגימה באופן זה, 20 milliliters בכל פעם, עד שכל החלבון ירוכז ויסור ממנו המלחים. אחסנו את חיישן ה-FRET הביולוגי המופק ב-80 degrees Celsius. הכינו תמיסת זיהוי המורכבת מתמיסה של 0.2 micromolar של חלבון חיישן CMY ו-0.8%PBS.הפעילו אנליזר FRET נייד. הגדירו את טמפרטורת האנליזה ל-53 °C. לאחר מכן, הגדירו את המכשיר למצב כיול.מלאו קיובטה ב-0.8% PBS כרקע. חממו מראש את הדגימה ל-53 degrees Celsius באנלייזר, ולאחר מכן הגדירו את הרקע. לאחר מכן, מלאו קיובטה בתמיסת גילוי.הניחו את הקובטה בתוך האנלייזר וקבעו את קו הבסיס. החליפו את הקובטה באחת המכילה תמיסת זיהוי וסוכר בריכוז של 1 millimolar. קבעו את העוצמה ברוויה כדי להשלים את הכיול.כדי להתחיל בהכנת דגימת משקה לניתוח תכולת סוכר, סנטריפוגו מיליליטר אחד של המשקה באמצעות מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. הסירו את העילוי באמצעות מזרק של מיליליטר אחד וסננו את העילוי דרך מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר. ערבבו 0.1 מיליליטר של התסנן ו-0.9 מיליליטר של 0.8%PBS במבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.ערבבו בעדינות את התערובת באמצעות וורטקס כדי להבטיח דילול מלא. העבירו לקובטה חמישה מיקרוליטרים (5 µL) של דגימת המשקה המדוללת ו-495 מיקרוליטרים (495 µL) של תמיסת הגילוי. הניחו את הקובטה באנלייזר וחממו מראש את הדגימה ל-53 °C.לחצו על כפתור ההגדרה (set) כדי למדוד את תכולת הסוכר של הדגימה. בשיטה זו, נצילות ה-FRET נמדדת על ידי היחס בין עוצמת הפליטה של החלבון הפלואורסצנטי הצהוב לבין החלבון הפלואורסצנטי הציאני בביוסנסור. טמפרטורת המדידה האופטימלית עבור ביוסנסורי CMY אלו היא בין 50 ל-55 מעלות צלזיוס, שכן בטווח זה ההבדל ביחס עוצמת הפליטה בין תמיסת ביקורת לתמיסה רוויה של מלטוז הוא הגבוה ביותר.הביוסנסור CMY-BII שימש להערכת תכולת המלטוז בשלושה משקאות בטמפרטורה של 53 מעלות. עקומת תגובה למינון נוצרת מקבלת יחס זה בריכוזי מלטוז שונים בטמפרטורה נתונה. יחס הפליטה מקושר לריכוז המלטוז באמצעות הערכים שהתקבלו במהלך הכיול.תכני המלטוז שנמדדו מוצגים לצד תכני הסוכר הכוללים שדווחו על ידי יצרני המשקאות. משקה A הכיל מקורות למלטוז כגון אורז ושעורה. בהתאם לכך, כמות המלטוז שנצפתה מהווה כחצי מכלל תכן הסוכר שדווח.למשקה C, משקה ספורט, היה תכולת מאלטוז נמוכה מאוד. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להפעיל את המכשיר ואת חיישני ה-FRET בטמפרטורה של בין 50 ל-55 מעלות צלזיוס. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת מולקולות קטנות שכאלה באמצעות אנלייזר FRET ידני המיוצר בהתאמה אישית.

highly-sensitive-rapid-fluorescence-detection-with-portable-fret

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Droplet מבוססי פלטפורמות microfluidic הם המועמדים המבטיחים לניסויים תפוקה גבוהה שכן הם מסוגלים להפיק, picoliter עצמית מידור כלי ובזול בשיעורים קילוהרץ. באמצעות שילוב עם מהירות, רגישות גבוהה שיטות ספקטרוסקופיות ברזולוציה פלואורסצנטי, כמויות גדולות של מידע שנוצר בתוך מערכות אלה ניתן לחלץ ביעילות, לרתום ולנצל אותו.

שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic

אנחנו מדגימים סריג בין polydiacetylene מצומדת פולימר (PDA) וfluorophore מחובר אל פני השטח של כף יד ליפוזומים את החישה של ביומולקולות. יפוזומים PDA הכילו גם מולקולות הקולטן על משטחיהם לביומולקולות כדי לשמש כחלליות. אינטראקציות יגנד רצפטור להוביל לשינויים ביעילות סריג בין fluorophore ומחשבי כף היד, שהוא הבסיס של מנגנון החישה.

ניטור בזמן אמת של אינטראקציות יגנד רצפטור עם פלואורסצנטי תהודת העברת אנרגיה

העברת אנרגית פורסטר תהודה (סריג) מיקרוסקופית היא טכניקה רבה עצמה לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות חיישנים ביולוגיים שונים כעיתונאים. כאן אנו מתארים כיצד לבנות epifluorescence אישית סריג מערכת הדמיה ממרכיבים מסחריים זמינים וכיצד להשתמש בו לניסויי סריג.

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

העברה מתא לתא של אגרגטים חלבונים, או זרעים פרוטאופתיים, עשויה להיות הבסיס להתקדמות הפתולוגיה במחלות ניווניות. כאן, מתוארת בדיקת ציטומטריית זרימת FRET חדשה המאפשרת זיהוי ספציפי ורגיש של פעילות זריעה מדגימות רקומביננטיות או ביולוגיות.

איתור רגיש של פעילות זריעת Proteopathic עם סריג cytometry הזרימה

זיהוי פלואורסצנטי רב צבעוני במיקרופלואידיקה טיפתית כולל בדרך כלל מערכות גילוי מבוססות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי מגושמות ומורכבות. כאן אנו מתארים ערכת זיהוי רב-צבעונית קומפקטית ומודולרית המשתמשת במערך של סיבים אופטיים כדי לקודד זמנית נתונים רב-צבעוניים שנאספו על ידי גלאי פוטו יחיד.

ססגוניות קרינת איתור עבור מיקרופלואידיקה אגל באמצעות סיבים אופטיים

חיישן פיזור אור זוויתי פוטו-תרמי (PT-AS) מאפשר בדיקת המוגלובין מהירה ונטולת כימיקלים של דגימות דם בקנה מידה ננו-ליטר. כאן מסופקים פרטים על מערך PT-AS ופרוטוקול מדידה לריכוז ההמוגלובין בדם. מוצגות גם תוצאות מייצגות לדגימות דם אנמיות.

Assay המוגלובין המהיר ללא כימיקלים עם פיזור photothermal זוויתי אור

אנו מציגים ניתוח תוכן בקוד פתוח גבוה (HCA) מכשיר ניצול הדמית חי קרינה אוטומטי (FLIM) עבור assaying אינטראקציות חלבון באמצעות תהודת העברת אנרגית פורסטר (סריג) readouts המבוסס. רכישת נתונים עבור מכשיר openFLIM-HCA זו נשלטת על ידי תוכנות שנכתבו ב μManager וניתוח נתונים מבוצע FLIMfit.

ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

פרוטוקולי בדיקה מבוססי תאים מבוססי-בסיס של Förster, שנפתרו בזמן, מתוארים עבור הכימות הפשוט, הספציפי, הרגיש והחזק של מתמר אותות זרחן אנדוגני ומפעיל של תמלול (STAT) 1/3/4/5/6 חלבונים בתאים ליסטים בפורמט של 384 בארות.

בדיקות העברת אנרגיה תהודה Förster נפתר זמן למדידה של חלבונים STAT זרחן אנדוגני בתאים אנושיים

מאמר זה מציג שיטה לניתוח spatiotemporal של נייד, מולקולה אחת Förster העברת אנרגיה תהודה (smFRET) מבוסס בדיקות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה. ערכת הכלים החדשה שפותחה מאפשרת לקבוע עקבות זמן smFRET של בדיקות נעות, כולל היעילות הנכונה של FRET ואת העמדות המולקולריות, כפונקציות של זמן.

ניתוח ספטיוטמפורלי דו-ממדי אוטומטי של בדיקות FRET ניידות בעלות מולקולה אחת

פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית לזיהוי הקישור בין תרכובות ומולקולות חלבון, ומציע את היתרונות של אובדן דגימת חלבון מינימלי ודיוק נתונים גבוה.

זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית

עבודה זו דנה בפרוטוקול לתכנון ופיתוח מכשיר E-Eye-Enable POCT לזיהוי Fe, Cr, As ו-F בדגימות סביבתיות, דגימות ביולוגיות ומזון ומשקאות. כמעט 2000 דגימות נבדקו, והתוצאות תואמות את טכניקת תקן הזהב.

טכניקת חישת עין אלקטרונית מתקדמת מונחית TD-DFT לכימות באתר של Fe, Cr, F ו-AS בדגימות סביבתיות, ביולוגיות ומזון

למד כיצד לכמת תכולת סוכר במשקאות באמצעות ניתוח FRET נייד ורגיש. שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של מולקולות קטנות כמו מלטוז בטמפרטורה אופטימלית של 53 מעלות צלזיוס.

רגיש מאוד מהיר קרינת איתור עם Analyzer Portable סריג

גלה סרטונים נוספים