רגיש מאוד מהיר קרינת איתור עם Analyzer Portable סריג

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים את הישימות הכללית של מנתח ה-FRET תחת תנאים אופטימליים, באמצעות כימות תכולת הסוכר במשקאות זמינים מסחרית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום החשיפה והניטור של מולקולות קטנות, כגון סוכר. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לנטר ביעילות תגובת אות רעננה למולקולות קטנות ללא צורך בפלואורומטרים יקרים ומתקדמים.

את הפרוצדורה תדגים ד"ר Han מהמעבדה שלנו. ראשית, הכינו את הפלסמיד של החיישן הביולוגי הפלואורסצנטי בכחול ובצהוב הספציפי למלטוז או לסוכרוז. לאחר מכן, זרעו מושבה בודדה של DE3 E.Coli בתוך חמישה מיליליטר של מצע Luria broth, והדגרימו את התרבית בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור מדחף למשך 16 שעות.

בשלב הבא, העבירו מיליליטר אחד של התרבית לבקרה המכילה 100 milliliters של LB. דגרו את הבקרה בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם ניעור עד שהצפיפות האופטית ב-600 nm תהיה כ-0.5. סובב את התרבית בצנטריפוגה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C. השביו במהירות את המשקע ב-50 milliliters של מים מזוקקים קרים מאוד, וסובבו שוב בצנטריפוגה למשך 20 דקות.

שחזר את המשקע ב-50 µL של תמיסה הכוללת 10% נפח של גליצריול ומים מזוקקים קרים מאוד. סובב בעדינות את התערובת עד שהצפיפות האופטית ב-600 nm מגיעה ל-100. בקוvette לאלקטרופורציה קרה מאוד, ערבב את התערובת עם 10 ng של פלסמיד CMY.

בצעו אלקטרופורציה לתערובת. בקוובט, השתהו את התאים ב-1 millileter של מצע SOC, ולאחר מכן העבירו אותם לפ attrib-tube בעל תחתית עגולה בנפח של 15 milliliter. המתינו להחלמה של התאים על ידי ניעור עדין ב-37 degrees למשך שעה אחת.

פזרו את התאים על צלחת LB agar עם 100 µg/mL ampicillin. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 12 שעות. באמצעות לולאה, העבירו מושבה בודדת ל-10 mL של LB המכיל 100 µg/mL ampicillin.

דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות תוך כדי ניעור למשך 12 שעות כדי להכין את תרבית הזרעה. העבירו חמישה מיליליטר של תרבית הזרעה ל-500 מיליליטר של LB עם ampicillin, ודגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות באינקובטור עם ניעור. כאשר הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר תגיע ל-0.5, הוסיפו IPTG עד להגעה לריכוז סופי של 0.5 מילימולאר.

לאחר דגירה של התרבית למשך 24 שעות, סובבו את התאים בצנטריפוגה למשך 20 דקות. הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) והשעיקו מחדש את המשקע בחמישה מיליליטר של binding buffer. בצעו סוניקציה לתאים על קרח למשך 10 שניות, ולאחר מכן קררו את התאים למשך 10 שניות.

חזור על פעולות הסוניקציה והקירור חמש פעמים נוספות. סנטריפוג את הליזט למשך 30 דקות. העבר את העילאי למבחנה נפרדת.

טהרו את הנוזל העליון (supernatant) בעזרת עמודת זיקה מסוג nickel NTA. מלאו רכז תרכיזים של 10,000 milliwatt ב-20 milliliters של הדגימה המטוהרת. סובבו את הדגימה בצנטריפוגה למשך 10 דקות, ולאחר מכן מלאו שוב את רכז התרכיזים ב-0.8% phosphate buffered saline.

חזרו על תהליך זה עם שאר הדגימה באופן זה, 20 milliliters בכל פעם, עד שכל החלבון ירוכז ויסור ממנו המלחים. אחסנו את חיישן ה-FRET הביולוגי המופק ב-80 degrees Celsius. הכינו תמיסת זיהוי המורכבת מתמיסה של 0.2 micromolar של חלבון חיישן CMY ו-0.8%PBS.

הפעילו אנליזר FRET נייד. הגדירו את טמפרטורת האנליזה ל-53 °C. לאחר מכן, הגדירו את המכשיר למצב כיול.

מלאו קיובטה ב-0.8% PBS כרקע. חממו מראש את הדגימה ל-53 degrees Celsius באנלייזר, ולאחר מכן הגדירו את הרקע. לאחר מכן, מלאו קיובטה בתמיסת גילוי.

הניחו את הקובטה בתוך האנלייזר וקבעו את קו הבסיס. החליפו את הקובטה באחת המכילה תמיסת זיהוי וסוכר בריכוז של 1 millimolar. קבעו את העוצמה ברוויה כדי להשלים את הכיול.

כדי להתחיל בהכנת דגימת משקה לניתוח תכולת סוכר, סנטריפוגו מיליליטר אחד של המשקה באמצעות מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר. הסירו את העילוי באמצעות מזרק של מיליליטר אחד וסננו את העילוי דרך מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר. ערבבו 0.1 מיליליטר של התסנן ו-0.9 מיליליטר של 0.8%PBS במבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.

ערבבו בעדינות את התערובת באמצעות וורטקס כדי להבטיח דילול מלא. העבירו לקובטה חמישה מיקרוליטרים (5 µL) של דגימת המשקה המדוללת ו-495 מיקרוליטרים (495 µL) של תמיסת הגילוי. הניחו את הקובטה באנלייזר וחממו מראש את הדגימה ל-53 °C.

לחצו על כפתור ההגדרה (set) כדי למדוד את תכולת הסוכר של הדגימה. בשיטה זו, נצילות ה-FRET נמדדת על ידי היחס בין עוצמת הפליטה של החלבון הפלואורסצנטי הצהוב לבין החלבון הפלואורסצנטי הציאני בביוסנסור. טמפרטורת המדידה האופטימלית עבור ביוסנסורי CMY אלו היא בין 50 ל-55 מעלות צלזיוס, שכן בטווח זה ההבדל ביחס עוצמת הפליטה בין תמיסת ביקורת לתמיסה רוויה של מלטוז הוא הגבוה ביותר.

הביוסנסור CMY-BII שימש להערכת תכולת המלטוז בשלושה משקאות בטמפרטורה של 53 מעלות. עקומת תגובה למינון נוצרת מקבלת יחס זה בריכוזי מלטוז שונים בטמפרטורה נתונה. יחס הפליטה מקושר לריכוז המלטוז באמצעות הערכים שהתקבלו במהלך הכיול.

תכני המלטוז שנמדדו מוצגים לצד תכני הסוכר הכוללים שדווחו על ידי יצרני המשקאות. משקה A הכיל מקורות למלטוז כגון אורז ושעורה. בהתאם לכך, כמות המלטוז שנצפתה מהווה כחצי מכלל תכן הסוכר שדווח.

למשקה C, משקה ספורט, היה תכולת מאלטוז נמוכה מאוד. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להפעיל את המכשיר ואת חיישני ה-FRET בטמפרטורה של בין 50 ל-55 מעלות צלזיוס. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת מולקולות קטנות שכאלה באמצעות אנלייזר FRET ידני המיוצר בהתאמה אישית.