רגיש מאוד מהיר קרינת איתור עם Analyzer Portable סריג

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים את הישימות הכללית של מנתח FRET בתנאים אופטימליים על ידי כימות תכולת הסוכר של משקאות זמינים מסחרית. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום החישה והניטור של מולקולות קטנות, כמו למשל סוכר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לנטר ביעילות אות טרי האחראי למולקולות הקטנות ללא פלואורומטרים יקרים ומתקדמים.

מי שידגים את ההליך יהיה ד"ר האן מהמעבדה שלנו. ראשית, הכינו את פלסמיד החיישן הביולוגי ציאן או סוכרוז או פלואורסצנטי צהוב. לאחר מכן יש לחסן חמישה מיליליטר של מרק לוריא עם מושבה אחת של DE3 E.Coli, ולדגור על התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד למשך 16 שעות.

לאחר מכן, הניחו מילילטר אחד של התרבות לבקבוק המכיל 100 מיליליטר LB. דגרו את הבקבוק ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר היא כ-0.5. צנטריפוגה את התרבית למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השעו במהירות את הגלולה ב -50 מיליליטר מים מזוקקים קרים כקרח, וצנטריפוגה למשך 20 דקות שוב.

השעו מחדש את הגלולה ב-50 מיקרוליטר של תמיסה של 10 אחוזי נפח של גליצרול ומים מזוקקים קרים כקרח. סובבו בעדינות את התערובת עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה ל-100. בקוביית אלקטרופורציה קרה כקרח, שלבו את התערובת עם 10 ננוגרם של פלסמיד CMY.

אלקטרופוראט את התערובת. בקובט, השעו מחדש את התאים במיליטר אחד של מדיום SOC, ולאחר מכן העבירו אותם לצינור תחתון עגול של 15 מיליליטר. שחזר את התאים על ידי ניעור עדין ב -37 מעלות למשך שעה.

מורחים את התאים על צלחת אגר LB עם 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות למשך 12 שעות. בעזרת לולאה, העבירו מושבה בודדת ל-10 מיליליטר LB המכילה 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין.

דגרו את התערובת בחום של 37 מעלות תוך כדי ניעור במשך 12 שעות ליצירת תרבית הזרעים. העבירו חמישה מיליליטר מתרבית הזרעים ל -500 מיליליטר LB עם אמפיצילין, ודגרו את התאים ב -37 מעלות בחממה רועדת. ברגע שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה ל-0.5, הוסף IPTG כדי ליצור ריכוז סופי של 0.5 מילימולר.

לאחר דגירה של התרבית למשך 24 שעות, יש לצנטריפוגה את התאים למשך 20 דקות. הסר בזהירות את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מאגר קשירה. סוניקציה של התאים על קרח למשך 10 שניות, ולאחר מכן קררו את התאים למשך 10 שניות.

חזור על הסוניקציה והקירור חמש פעמים נוספות. צנטריפוגה את הליזאט למשך 30 דקות. העבירו את הסופרנטנט לצינור איסוף אחר.

טהר את הסופרנטנט על עמוד זיקה של ניקל NTA. מלאו רכז של 10,000 מילי-וואט ב-20 מיליליטר מהדגימה המטוהרת. צנטריפוגה את הדגימה למשך 10 דקות, ולאחר מכן מלאו מחדש את הרכז במי מלח חוצצים של 0.8% פוספט.

חזור על תהליך זה עם שאר הדגימה בדרך זו, 20 מיליליטר בכל פעם, עד שכל החלבון מרוכז ומומלח. אחסן את החיישן הביולוגי FRET המטוהר בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. הכן תמיסה של 0.2 מיקרו-מולרית של חלבון חיישן ביולוגי CMY ו-0.8% PBS כפתרון הזיהוי.

הפעל מנתח FRET כף יד. הגדר את טמפרטורת הניתוח ל-53 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הגדר את המכשיר למצב כיול.

מלאו קובטה עם 0.8% PBS כרקע. מחממים את הדגימה ל-53 מעלות צלזיוס במנתח, ולאחר מכן מגדירים את הרקע. לאחר מכן, מלאו קובטה בתמיסת זיהוי.

הנח את הקובט לתוך המנתח והגדר את קו הבסיס. החלף את הקובט בתמיסת זיהוי המכילה וסוכר מילימולרי אחד. הגדר את העוצמה ברוויה כדי לסיים את הכיול.

כדי להתחיל בהכנת דגימת משקה לניתוח תכולת סוכר, באמצעות צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, צנטריפוגה מיליליטר אחד מהמשקה. הסר את הסופרנטנט עם מזרק מיליליטר אחד וסנן את הסופרנטנט באמצעות מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר. שלב 0.1 מיליליטר פילטר ו-0.9 מיליליטר של 0.8% PBS בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

מערבבים בעדינות את התערובת כדי להבטיח דילול מלא. מניחים חמישה מיקרוליטר מדגימת המשקה המדולל ו-495 מיקרוליטר של תמיסת זיהוי בקובטה. מניחים את הקובט במנתח ומחממים את הדגימה ל-53 מעלות צלזיוס.

לחץ על כפתור ההגדרה כדי למדוד את תכולת הסוכר של הדגימה. בשיטה זו, יעילות ה-FRET נמדדת על ידי היחס בין עוצמת הפליטה של החלבון הפלואורסצנטי הצהוב לחלבון הפלואורסצנטי הציאן בחיישן הביולוגי. טמפרטורת המדידה האופטימלית עבור חיישנים ביולוגיים CMY אלה היא בין 50 ל-55 מעלות צלזיוס, שכן ההבדל ביחס עוצמת הפליטה בין תמיסת בקרה לתמיסה רוויה של מלטוז הוא הגדול ביותר.

החיישן הביולוגי CMY-BII שימש להערכת תכולת המלטוז של שלושה משקאות ב-53 מעלות. עקומת תגובת מינון נוצרת מהשגת יחס זה בריכוזי מלטוז שונים בטמפרטורה נתונה. יחס הפליטה קשור לריכוז המלטוז באמצעות הערכים המתקבלים במהלך הכיול.

תכולת המלטוז הנמדדת מוצגת עם תכולת הסוכר הכוללת המדווחת על ידי יצרני המשקאות. משקה A הכיל מקורות מלטוז כגון אורז ושעורה. בהתאמה, כמות המלטוז הנצפית מהווה כמחצית מכלל תכולת הסוכר המדווחת.

משקה C, משקה ספורט, היה בעל תכולת מלטוז נמוכה מאוד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להפעיל את המכשיר וחיישני FRET בין 50 ל-55 מעלות צלזיוס. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת מולקולות כה קטנות עם מנתח FRET כף יד בהתאמה אישית.