Name: זיהוי Cortex שבר במהלך בקטריאלי Spore נביטה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: למדו לזהות שברי קורטקס וסוכרים מחזרים במהלך נביטת נבגים חיידקיים של Clostridium difficile. שיטת מעבדה זו מאפשרת כימות קל ונגיש של תהליכי הנביטה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרויקט המתואר נתמך על ידי מספר הפרס 5R01AI116895 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות או מכוני בריאות הלאומיים.

1. דוגמאות יצירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים להפעיל ג difficile נבגים על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחסן על הקרח. הערה: ג נבגי difficile ניתן לייצר וטהר כפי שתוארו לעיל 7,9,10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון הנביטה ב X + 1 מ&quot;ל כאשר X הוא מספר דגימות להילקח במהלך assay. הערה: פתרון הנביטה הוא ספציפית המינים של חיידקי Spore נלמדים. עבור assaying ג הנביטה נבג difficile, השתמשנו פתרון של 10 מ&quot;מ טריס (pH 7.5), 150 מ&quot;מ NaCl, 100 גליצין מ&quot;מ ו -10 מ&quot;מ חומצה taurocholic במים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת assay, לצייר מדגם 1.0 מיליליטר של פתרון הנביטה ללא נבגים לשמש ריק לגילוי שבר בקליפת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נבגים ל OD 600 של ~ 3.0 לפתרון נביטת המערבולת במהירות. הערה: מחקרי הנביטה שלנו ב subtilis, השתמשנו באותן OD 600 נבגים ובאשר ג difficile. הערה: סכום זה של נבגים עבד טוב לשחרור שבר בקליפת ניטור במהלך C. נביטת נבג difficile. כמות הנבגים המשמשת assay זה צריכה להיקבע באופן ניסיוני עבור כל חיידק או זן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדגם 1.2 מ&quot;ל מיד לאחר הוספת הנבגים צנטריפוגות בטמפרטורת החדר למשך דקות 1 ב 14,000 × גרם. זוהי נקודת אפס הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 1.0 מיליליטר של supernatant מן המדגם centrifuged לצינור טרי לניתוח שבר בקליפה שלאחר מכן. הערה: האם DPA צריך להיות פיקוח, להסיר מדגם נפרד 100 μl לצורך זיהוי של DPA בתמיסה באמצעות assay המבוסס על הקרינה terbium 9,18,19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את המדגם נאספו ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.4 ו -1.5 במרווחים קבועים עד בכל נקודות הזמן הושלמו. הערה: בגלל הזמן הדרוש צנטריפוגה ודגימה, מועדים לפי שעון ה פחות2 דקות זה מזה לא היו אפשריות במהלך ההליך שלנו, כך מרווחי הדגימה שלנו היו פעם כל 2 דקות במשך 14 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביקורת חיובית להפחתת סוכר איתור וכימות, כוללים את הסכומים הבאים של N -acetylglucosamine (nmol): 0, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500, ו -5,000. הכן דגימות אלה בעת ובעונה אחת כמו דגימות קליפה ולהפעיל יחד עם דגימות הקליפה כך עקום הסטנדרט רלוונטי הנתונים שעלו נבט נבגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל דגימות נקודת הזמן נאספים, Lyophilize הדגימות. הערה: אנו lyophilized דגימות שלנו צינורות 2 מ&quot;ל בורג מכסה. </li></ol> 2. מדידת Cortex שברי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend דגימות lyophilized ב 120 μl של 3 N HCl השלימו עם פנול 1% ו -0.5% β-mercaptoethanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות resuspended לצינורות בורג מכסה 2 מ&quot;ל. הערה: שחזור, להבטיח שכל המדגם lyophilized הוא resuspended והועבר. </li> &lt;li&gt; דגירת הדגימות באמבט מים הסירקולציה המחודשת על 95 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, מניח את הדגימות על קרח עד שהם מגניבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את הדגימות עם 120 μl של 3 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 μl של פתרון סודיום ביקרבונט רווי 80 μl של פתרון אנהידריד אצטית 5% לטעום כל מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הדגימות חזרה באמבט מי C ° 95 בדיוק 3 דקות. הערה: שלב זה הוא זמן פעמים רגישות יותר יכולות להשפיע על התפתחות אות במורד זרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דגימות מן האמבטיה במים מגניב על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 400 μl של 6.54% K 2 B 4 O 7 · 4H 2 O כדי צינור כל מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הדגימות באמבט מים הסירקולציה המחודשת ב 95 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות בדיוק. הערה: שלב זה הוא זמן פעמים רגישות יותר יכולות להשפיע על התפתחות אות במורד זרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְהַסִירהדגימות ומניחות על קרח למשך 5 דקות. </li></ol> 3. צבע מגיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד דגימות הן על קרח (שלב 2.12), להכין את מגיב הצבע. ממיסים 0.320 גרם של p -dimethylaminobenzaldehyde (DMAB; מגיב של ארליך) ב 1.9 מ&quot;ל של חומצה אצטית קרחונית. הערה: מגיב זמן, טמפרטורה רגישה לאור ולא צריך להיעשות מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר DMAB מתמוסס לחלוטין, להוסיף 100 μl של 10 N HCl ו מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של חומצה אצטית קרחונית מערבולת. </li></ol> 4. תגובת מדד-צבע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl של כל מקורר מדגם קליפת לצינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 700 μl של פתרון צבע טרי מוכן מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את דגימות באמבט מים 37 ° C ו דגירה של בדיוק 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 200 μl של כל דגימה לצלחת 96-גם ברורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הדגימות ב 585 ננומטר על צלחתקוֹרֵא. דוגמאות צריכות להתחיל בכל צבע צהוב תגובה חיובית תעבור לסגול. ככל נוכחי הקליפה, הצבע הסגול העמוקה. </li></ol>

<ol><li>Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clostridium+sporulation+programs%3A+diversity+and+preservation+of+endospore+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).</li>
<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+of+spores+of+Bacillus+species%3A+what+we+know+and+do+not+know%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).</li>
<li>Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+formation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Spore formation in Bacillus subtilis.</a> Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).</li>
<li>Fimlaid, K. A., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+mechanisms+regulate+sporulation+sigma+factor+activity+in+the+Firmicutes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes.</a> Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).</li>
<li>Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+peptidoglycan+structure+of+Bacillus+subtilis+endospores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores.</a> J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).</li>
<li>Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+168+endospore+peptidoglycan+and+its+role+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation.</a> J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).</li>
<li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salts+and+glycine+as+cogerminants+for+Clostridium+difficile+spores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores.</a> J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+spore+biology%3A+sporulation%2C+germination%2C+and+spore+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins.</a> Trends Microbiol. 22 (7), (2014).</li>
<li>Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+cortex+hydrolysis+precedes+DPA+release+during+Clostridium+difficile+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination.</a> J Bacteriol. 197 (14), (2015).</li>
<li>Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acid+recognition+by+the+Clostridium+difficile+Germinant+Receptor%2C+CspC%2C+is+important+for+establishing+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection.</a> PLoS Pathog. 9, e1003356(2013).</li>
<li>Moir, A., Smith, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetics+of+bacterial+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Genetics of bacterial spore germination.</a> Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).</li>
<li>Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Raman+tweezers+and+quantitative+differential+interference+contrast+microscopy+for+measurement+of+dynamics+and+heterogeneity+during+the+germination+of+individual+bacterial+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores.</a> Journal of biomedical optics. 15, 056010(2010).</li>
<li>Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+that+degrade+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymes that degrade bacterial cell walls.</a> Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).</li>
<li>Park, J. T., Johnson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+submicrodetermination+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A submicrodetermination of glucose.</a> J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).</li>
<li>Thompson, J. S., Shockman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modification+of+the+Park+and+Johnson+reducing+sugar+determination+suitable+for+the+assay+of+insoluble+materials%3A+its+application+to+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls.</a> Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SleC+is+essential+for+cortex+peptidoglycan+hydrolysis+during+germination+of+spores+of+the+pathogenic+bacterium+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens.</a> J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+cortex-lytic+enzyme+SleC+from+non-food-borne+Clostridium+perfringens+on+the+germination+properties+of+SleC-lacking+spores+of+a+food+poisoning+isolate%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate.</a> Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).</li>
<li>Hindle, A. A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipicolinic+acid+%28DPA%29+assay+revisited+and+appraised+for+spore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection.</a> The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).</li>
<li>Kort, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+heat+resistance+of+bacterial+spores+from+food+product+isolates+by+fluorescence+monitoring+of+dipicolinic+acid+release%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).</li>
<li>Elson, L. A., Morgan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+method+for+the+determination+of+glucosamine+and+chondrosamine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine.</a> The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).</li>
<li>Ramirez, N., Abel-Santos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+germination+of+Clostridium+sordellii+spores+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro.</a> J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).</li>
<li>Akoachere, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indentification+of+an+in+vivo+inhibitor+of+Bacillus+anthracis+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination.</a> J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).</li>
<li>Duncan, C. L., Strong, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+medium+for+sporulation+of+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens.</a> Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).</li>
<li>Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+four+cortex+lytic+enzymes+to+germination+of+Bacillus+anthracis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores.</a> J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).</li>
<li>Meador-Parton, J., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+spore+peptidoglycan+during+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation.</a> J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).</li>
<li>Lambert, E. A., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacillus+anthracis+SleL+%28YaaH%29+protein+is+an+N-acetylglucosaminidase+involved+in+spore+cortex+depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization.</a> J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).</li>
<li>Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Dynamic+Germination+of+Individual+Clostridium+difficile+Spores+Using+Raman+Spectroscopy+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

על הגירוי, נבגים עוברים תהליך הנביטה לאבד התכונות העמידות שלהם ללא צורך סינתזת macromolecular. כאשר נביטת נבג מופעלת, ליבת הנבג משחררת DPA תמורת מים 2. בשל תכולת DPA הגבוהה של הנבג הרדום, ליבת הנבג היא בלחץ האוסמוטי אינטנסיבי ואת פפטידוגליקן המיוחד, קליפה, עוזר למנוע את הליבה של נפיחות המבצע במשחק, ככל הנראה, כמחסום רחב 2. השיטה המתוארת לעיל משתמשת מגיבה של ארליך (פתרון צהוב) כדי לזהות את נו...

Endospores הם מטבולית צורות רדומות של חיידקים המאפשרים חיידקים להתמיד בסביבות שליליות. אצל חיידקים רבים יוצרי נבגים, יצירת נבגים היא מושרה על ידי מחסור באבות מזון אך תהליך זה יכול להיות נשלט על ידי שינויי pH, חשיפה לחמצן או מדגיש אחרים 1. בעוד בצורה מטבולית הרדומה הנבג שלהם, חיידקים להתנגד קרינת UV, התייבשות, בטמפרטורות גבוהות, והקפאת 2. רוב הידע על תהליך נביגה מגיעה ממחקרים באורגניזם מודל, subtilis Bacillus. תהליך נביגה מתחיל עם שכפול הדנ&quot;א ואת ההיווצרות של 3,4 נימה צירית. מחץ סימטרית אז מחלק התא לשני תאים בגודל שווה. התא הגדול יותר, התא האם, בולע את התא הקטן יותר, forespore. שניהם תא אמא forespore לתאם ביטוי גנים להבשיל לנבגים ואת התא האם בסופו של דבר lyses, שחרור דורמןt נבג לתוך הסביבה 1. מבנה הנבג וההרכב נשמרים על פני מינים רבים של חיידקים. ליבת הנבג יש תכולת מים נמוכה יותר מאשר בתא וגטטיבי והוא עשיר בחומצת dipicolinic (DPA) 1,2. במהלך יצירת נבגים, DPA נשאב לתוך ליבת נבג תמורת מים. המקיף את הליבה הוא קרום נבג פנימי שבו, רוב החיידקים ויוצרים נבג, הקולטנים אשר מזהים את המולקולות הקטנות המעודדות נביטה (germinants) ממוקמים 2. ממוקם ממש מחוץ הקרום הפנימי של הנבג היא שכבה של פפטידוגליקן דופן תא. שכבת פפטידוגליקן מיוחדת (קורטקס) המקיפה את פפטידוגליקן דופן תא והוא מורכב רב של אותם הרכיבים כמו פפטידוגליקן דופן תא [לסירוגין N-acetylglucosamine (נאג) וחומצת N-acetylmuramic (NAM)]. עם זאת, כ -50% של שאריות NAM בקליפה הומרו muramic-δ-לקטם 5,6 </sעד&gt;. במהלך נביטת נבג, שאריות muramic-δ-לקטם אלה מוכרות על ידי האנזימים הממסים קליפת נבג (SCLEs), ובכך מאפשרות את הקליפה להיות מושפלת (תהליך חיוני כדי להשלים נביטה) אבל לא את דופן התא. המקיף את הקליפה הוא קרום חיצוני וכמה שכבות של מעייל חלבונים 2. שליטה על תהליך הנביטה היא חשובה ביותר עבור חיידקים יוצרי נבגים. נביטה מופעלת כאשר קולטנים germinant אינטראקציה עם germinants שלהם 2. אצל חיידקים רבים יוצרי נבגים, germinants אלה הם חומצות אמינו, סוכרים, נוקלאוטידים, יונים או צירופם של אלה 2. ג נביטת נבג difficile היא שיזמה שילובים של חומצות מרות מסוימות, [למשל, חומצת taurocholic (ת&quot;א)] וחומצות אמינו (למשל, גליצין) 7-10. אמנם יש הבדלים בין ג מסלול נביטת difficile ואת המסלולים למדו אחרים נבג יוצריםחיידקים, כגון B. subtilis, משותף לכל הוא הדרישה ההכרחית כדי לבזות את קליפת הנבג לאפשר תא צמח לצמוח מן הנבג ניבט 2,8. השפלה Cortex ניתן להשיג על ידי SCLEs CwlJ / SleB (כפי שנמצאו ב subtilis) או SleC (כפי שנמצאו רבים וקלוסטרידיאה.את). הידרוליזה Cortex מפחיתה את המגבלה על קיר התא לבין הנבג. זה מאפשר התייבשות ליבה מלאה, צעד הכרחי בהפעלה מחדש של רבים מן החלבונים דרושים חילוף חומרים תאיים 2. כאשר נבגים לנבוט, שינויי הנבג הרדומים ממצב שלב בהיר למצב שלב כהה ותהליך זה יכול להימדד על ידי שינוי הצפיפות אופטית (OD) ב 600 ננומטר 11. דו&quot;ח קודם מצביע על כך הרבה מהשינוי הזה ב OD הוא עקב השחרור של DPA מן הנבג 12. במהלך מחקר שנערך לאחרונה שלנו, ביקשנו להשוות עיתוי ג נביטת נבג difficile וליוותה אתשחרורו של שברי DPA ואת קליפת 9. במחקר זה היה חיוני כדי לפקח על שחרורו של שברי קליפה כשהחלו להתפרסם על ידי נובטי נבגים. את assay colorimetric משמש כאן התבסס על שיטה לאיתור סוכרים עם קצות צמצום שפותח Ghuysen et al. 13. מכיוון אחרים תיארו פרוטוקולים לצורך זיהוי של סוכרים הפחתת 14 או שינית אותם פרוטוקולים 15, בספרות העוסקת בנושא זה יכול להיות מבלבל. כאן, אנו בפירוט צעד-אחר-צעד שיטה לאיתור colorimetric הפחתת סוכרים ששוחרר נובטת ג נבגי difficile. למרות מחקר זה משתמש ג נבגי difficile, סוכרי הצמצום שפורסמו במהלך הנביטה של נבגים מחיידקים אחרים להרכיב נבג מסוגלים להתגלות עם פרוטוקול זה 9,16,17.

<table><tbody><tr><td>2.0 מ"ל צינור כובע בורג</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 צינור אפנדורף</td><td>אפנדורף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 צינור אפנדורף</td><td>אפנדורף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 פיפט אפנדורף</td><td>אפנדורף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,250 & #956; l טיפים לפיפט</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 & #956; ll pipt tips</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-D-glucosamine</td><td>Sigma</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית - 10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>אצטי אנהידריד</td><td>אלפא Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן טטרבוראט טטרהידרט</td><td>אלפא אסאר</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4-(דימתיל-אמינו) בנזלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>156477-100 גרם</td><td></td></tr><tr><td>פנול רווי</td><td>פישר</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>אולדריץ'</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td><td>מכשירים</td><td></td><td></td>מולקולריים</tr><tr><td>חומצה אצטית, קרחון</td><td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים מחומם, במחזור</td><td>VWR דגם מדעי</td><td>1136</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-טסט 96</td><td>פלקון</td><td>353072</td><td>96 צלחות תרבית רקמות שקופות היטב</td></tr><tr><td>צינורות תרבית</td><td>VWR</td><td>89000-506</td><td></td></tr><tr><td>מכונת</td> מערבולת בלוקי חום ליופילייזר <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי cortex שבר במהלך בקטריאלי spore נביטה

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

תהליך נביטת האנדוספורים ב-Clostridium difficile, ובקלוסטרידיות אחרות, נמצא יותר ויותר שונה מהחיידק היוצר נבגים, Bacillus subtilis. הנביטה מופעלת על ידי נביטות מולקולות קטנות ומתרחשת ללא צורך בסינתזה מקרומולקולרית. למרות שקיימים הבדלים בין מנגנוני נביטת הנבגים במינים של Bacillus ו-Clostridium, דרישה נפוצה היא הידרוליזה של קליפת המוח דמוית הפפטידוגליקן המאפשרת לליבת הנבגים להתנפח ולהתייבש מחדש. לאחר החזרת נוזלים, חילוף החומרים יכול להתחיל וזה, בסופו של דבר, מוביל לצמיחה של תא וגטטיבי. איתור שברי קליפת המוח שעברו הידרוליזה במהלך נביטת נבגים יכול להיות קשה והשינויים במבחנים שתוארו קודם לכן יכולים להיות מבלבלים או קשים לשחזור. לפיכך, בהתבסס על הדוח האחרון שלנו המשתמש בבדיקה זו, אנו מפרטים פרוטוקול שלב אחר שלב לזיהוי קולורימטרי של שברי קליפת המוח במהלך נביטת נבגי חיידקים.

טבלת 1 מראה תוצאות אופייניות באמצעות סטנדרטים נאג. נתונים משמשים ליצירת עקומה סטנדרטית. טבלה 2 מראה תוצאות אופייניות מתוך assay נביטה במאגר נביטה בתוספת 100 גליצין מ&quot;מ ו -10 המ&quot;מ ת&quot;א (תנאים לקידום נביטה) או 100 גליצין מ&quot;מ בלבד (תנאים שאינם נובטים). בהעדר ת&quot;א, ג נבגי difficile לא לנבוט ויש שינוי קטן בנוכחות שברת קליפה בתמיסה. עם זאת, בנוכחות שני ת&quot;א גליצין, ג ...

כאן, אנו מתארים בדיקה קולורימטרית לאיתור נוכחות של סוכרים מפחיתים במהלך נביטת נבגי חיידקים.

זיהוי Cortex שבר במהלך בקטריאלי Spore נביטה

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה, המפורט שלב אחר שלב, היא לכמת את השפעות של מקטעי קורטקס או סוכרים מחזרים במהלך נביטת נבגים בקטריאליים. שיטה זו תפרט את השלבים הנדרשים כדי לזהות את נוכחותם של מקטעי קורטקס או סוכרים מחזרים במהלך נביטת הנבגים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שבמרבית המעבדות קיימים הריאגנטים והציוד הדרושים להשלמה מוצלחת של הפרוטוקול.התחילו את הפרוצדורה על ידי הנחת מבחנה של נבגי Clostridium difficile בבלוק חימום ודגירה של המבחנה בטמפרטורה של 65 degrees Celsius למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הניחו את המבחנה על קרח. תמיסת הנבטה היא ספציפית למין של הנבג החיידקי הנחקר.לבדיקת נבטות של נבגי C.difficile, אנו משתמשים בתמיסה של 10 millimolar Tris ב-pH 7.5 עם 150 millimolar של sodium chloride, 100 millimolar glycine, ו-10 millimolar taurocholic acid במים דה-יוניים. הכין מיליליטר אחד של תמיסת הנבטות לכל דגימה בתוספת של מיליליטר אחד נוסף. לפני תחילת הבדיקה, העבר מיליליטר אחד של תמיסת הנבטות לפראמבולה של מיקרו-צנטריפוגה והצמדה בצד.זה ישמש כביקורת ריקה (blank) לזיהוי שברים של קורטקס. לאחר מכן, למסלול ההנבטה, הוסיפו נבגים עד לערך OD600 של כ-3.0 ובצעו ערבוב קצר ב-vortex. כמות זו של נבגים פועלת היטב למיתון שחרור שברי הקורטקס במהלך הנבטת נבגי C.difficile.מיד לאחר הוספת הנבגים, העבירו דגימה של 1.2 milliliter לפרובת מיקרו-צנטריפוגה חדשה והכניסו אותה לצנטריפוגה. לאחר מכן, סובבו בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת במהירות של 14,000 ×g. זוהי נקודת הזמן אפס. לאחר הסבוב, העבירו 1 milliliter מהעלילי (supernatant) לפרובת 2 milliliter חדשה בעלת מכסה הברגה והקפיאו אותה בטמפרטורה של 80- °C.חזור על תהליך נטילת המנות (aliquots), הסבב במערך צנטריפוגי וההקפאה במרווחי זמן קבועים, עד להשלמת איסוף הדגימות עבור כל נקודת זמן. בשל הזמן הנדרש לצנטריפוגה ולדגימה, לא ניתן לבצע את הפרוצדורה עבור נקודות זמן קצרות משתי דקות; לפיכך, דגימות אלו נלקחות פעם ב-2 דקות למשך 14 דקות. במהלך הכנת דגימות הקורטקס, במידה ויש צורך בניטור של חומצה דיפיקולינית, הסר דגימה נפרדת של 100 µL והעבר אותה לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה על קרח.הכינו בנוסף דגימות ליצירת עקומת סטנדרט עם הכמויות הבאות של N-acetylglucosamine: אפס, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500 ו-5,000 nanomoles בתמיסת הנבטה. לאחר איסוף דגימה עבור כל נקודת זמן, הוציאו את הדגימות מהמקפיא ובצעו להן ליופיליזציה יחד עם דגימת הבקרה (blank) ודגימות עקומת הסטנדרט.לאחר מכן, אחסנו את כל הדגימות בטמפרטורה של 80- °C עד למועד השימוש. ביום הבדיקה, השביחו את הדגימות הליופיליזיות, כולל הביקרים והדגימות של עקומת הסטנדרט, ב-120 µL של חומצה כלורית עם פנול ובטא-מרקפטואתנול. לאחר מכן, העבירו את כל הדגימות המושבחות למבחנות חדשות בעלות פקק הברגה בנפח 2 mL.לאחר מכן, דגרו אותם באמבט מים עם סחרור בטמפרטורה של 95 °C למשך ארבע שעות. לאחר הדגירה, הניחו את הדגימות על קרח עד לקירורן. לאחר מכן, הוסיפו 120 µL של sodium hydroxide בריכוז 3 M כדי לנטרל אותן.בשלב הבא, הוסיפו 80 µl של תמיסת סודיום ביקרבונט רוויה ו-80 µl של תמיסת acetic anhydride בריכוז 5% לכל דגימה וערבבו באמצעות וורטקס. לאחר מכן, דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, העבירו את הדגימות בחזרה לאמבט מים בטמפרטורה של 95 °C למשך שלוש דקות בדיוק.שימו לב כי שלב זה רגיש לזמן וזמנים ממושכים יותר עשויים להשפיע על התפתחות האות בהמשך. הוציאו את הדגימות מאמבט המים קררו אותן על קרח. הוסיפו 400 µL של 6.54% potassium tetraborate tetrahydrate לכל מבחנה וערבלו במכשיר vortex.דגרו את הדגימות באמבט מים עם סירקולציה בטמפרטורה של 95 °C למשך שבע דקות בדיוק. שלב זה הוא רגיש לזמן. הוציאו את הדגימות והניחו אותן על קרח למשך חמש דקות.בעוד הדגימות על קרח, הכינו את ריאגנט הצבע. המיסו 0.320 גרם של DMAB ב-1.9 מיליליטר של חומצה אצטית קרחית. שימו לב כי ריאגנט זה רגיש לזמן, לטמפרטורה ולאור, ולכן אין להכינו מראש.לאחר שה-DMAB התמוסס לחלוטין, יש להוסיף 100 µL של חומצה כלורית בריכוז 10 N ולערבב את הדגימה במערבל (vortex). לאחר מכן, יש להוסיף 5 mL של חומצה אצטית גלציאלית ולערבב שוב במערבל. לצורך התגובה הצבעית, יש להעביר 100 µL מכל דגימה מקורטקס שהוברדה או מדגימת ביקורת לשפופרת מיקרוצנטריפוגה חדשה בנפח 1.5 mL.הוסף 700 microliters של תמיסת הצבע שהוכנה טרי לכל דגימה. העבר מיד את הדגימות למקבץ מים בטמפרטורה של 37 degree Celsius והדגס אותן למשך 20 דקות בדיוק. לאחר ההדגסה, העבר 200 microliters מכל דגימה לפלטת 96-well שקופה.הדגימות צריכות להיות בצבע צהוב בתחילה, אך ישתנו לסגול אם קיים סוכר מרחב, המעיד על נוכחות של קורטקס. במקרה זה, רבות מהדגימות אינן מראות צבע סגול נראה לעין. עם זאת, דגימות ה-250, 500 ו-5,000 nanomole נראות שונות באופן ויזואלי מהביקורת השלילית של אפס nanomole.בעזרת קורא 플레이טות (plate reader), קבעו את הבליעה באורך גל של 585 ננומטרים. כאשר המדידה מבוצעת ב-OD של 585 ננומטרים, האות הנוצר מדגימות הסטנדרט מתאים בצורה המיטבית לרגרסיה לינארית. טבלה זו מציגה תוצאות טיפוסיות בשימוש בסטנדרטים של N-acetylglucosamine.נתונים אלו שימשו לאחר מכן ליצירת עקומת הסטנדרט המוצגת כאן. בדיקת נבטה בוצעה תחת תנאים המעודדים נבטה, עם באפר נבטה תומך ב-100 millimolar glycine ו-10 millimolar taurocholic acid. בתנאים שאינם מעודדים נבטה, נעשה שימוש ב-100 millimolar glycine בלבד.בהיעדרו של חומצה טאוכולית (taurocholic acid), נבגי C. difficile אינם מנבטים, ואין שינוי משמעותי בנוכחותם של שברי קורטקס (cortex fragments) בתמיסה. עם זאת, בנוכחות של חומצה טאוכולית וגליצין יחד, נבגי C. difficile מנבטים ומשחררים שברי קורטקס אל התמיסה. תהליך זה נספג כעלייה ב-OD585 לאורך זמן בדגימות שעברו תגובה.כמות שברי הקורטקס ששוחררו במהלך בדיקה זו חושבה באמצעות עקומת סטנדרט. כפי שניתן לראות כאן בבדיקה זו, רוב הקורטקס עבר הידרוליזה או שוחרר עד 15 דקות לאחר החשיפה לחומר המעורר נבט. דבר זה מרמז שמרבית הנבגים נבטו בפרק זמן זה.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן לזהות פרגמנטים של קורטקס או סוכרים מרחבים בתמיסת הנבטה במהלך הנבטה של נבגי חיידקים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להקפיד על זמני התגובה כדי שהבדיקה תתפתח כראוי.

detecting-cortex-fragments-during-bacterial-spore-germination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Francis, M. B., et al. איתור שברי קליפת המוח במהלך נביטת נבגי חיידקים. J. Vis. Exp. (2016).סרטון זה מדגים שיטה קולורימטרית לאיתור פירוק קליפת המוח במהלך נביטת נבגי חיידקים על ידי מדידת שחרור סוכרים מפחיתים לאורך זמן. באמצעות תקני N-אצטיל גלוקוזאמין ודגימות נקודת זמן, הבדיקה מכמתת את ריכוז הסוכר באמצעות תגובה כרומוגנית סגולה, המציינת את היקף ההידרוליזה של קליפת המוח.

זיהוי קולורימטרי של פירוק קליפת המוח במהלך נביטת נבגי חיידקים

מקור: Wen, J., Pasman, et al., Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ תאורה מובנה לרכישת תמונות פלואורסצנטיות תלת מימדיות החושפות את ארגון חלבוני הנביטה בתוך נבג החיידקים.

הדמיה של חלבוני נביטה בקרום הפנימי של נבגי חיידקים

אנו מתארים שיטה למעקב אחר קרע endomembrane שהושרו על ידי החיידקים תוך...

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

חיידקים מייצרים תרכובות מופרשות שיש לו את הפוטנציאל להשפיע על הפיסיולוגיה של חיידקי השכנים שלהם. כאן אנו מתארים מסך coculture המאפשר זיהוי של אינטראקציות כאלה interspecies תיווך כימי על ידי ערבוב של חיידקים אדמה עם זני כתב תעתיק ניאון של Bacillus subtilis על תקשורת מוצקה.

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

פותחה שיטה לזיהוי אנדוספורים חיידקיים מקהילות מיקרוביאליות מורכבות לביצוע תרבית מותאמת אישית או מחקרים מולקולריים של קבוצת חיידקים זו.

בידוד פיזי של Endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי

פרוטוקול זה ממחיש את הצעדים החשובים רצופים הנדרש כדי להעריך את הרלוונטיות של ניטור חיוניות פרמטר בתהליכי תיקון ה-DNA להחיות Bacillus subtilis נבגים לאחר הטיפול עם לחץ נמוך פלזמה על-ידי מעקב מתויג פלורסצנטיות DNA תיקון חלבונים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים זמן לפתור קונפוקלית וסריקה.

חוקרים את מזיקה אפקטים של נמוך לחץ פלזמה עיקור על ההישרדות של Bacillus subtilis הנבגים באמצעות Live התא מיקרוסקופ

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור המתחיל החוקרים ליזום phenotyping עבור סוג חיידקים חשובים פרמקולוגית של Streptomyces.

הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces

פטריות הזימה לגרום למחלות רבות החקלאי הרסנית. הם מופצים כמו teliospores רדום זה לנבוט בתגובה לאותות סביבתיים. אנו מכינים שתי שיטות כדי לחקור את השינויים המולקולריים במהלך הנביטה: מדידת נשימה עלייה כדי לזהות מטבולית הפעלה והערכה שינוי האירועים המולקולריים המתרחשים על-ידי בידוד teliospores בשלבים מורפולוגיים ברורים.

חוקרים נביטה Teliospore באמצעות ניתוח Microrespiration ו- Microdissection

קולטן germinant אשכול חלבונים ב- 'germinosomes' בתוך הקרומית הפנימית של Bacillus subtilis נבגים. אנו מתארים פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה סופר כתב פלורסנט חלבונים כדי להמחיש germinosomes. הפרוטוקול מזהה החולקות הממברנה הפנימית נבג מוכתמים מעדיפים לצבוע הממברנה FM4-64.

ויזואליזציה של Germinosomes, את הקרום הפנימי בנבגים Bacillus subtilis

הזיהום של Caenorhabditis elegans על ידי הטפיל המיקרוספורידי Nematocida parisii מאפשר לתולעים לייצר צאצאים שעמידים מאוד לאותו פתוגן. זוהי דוגמה לחסינות תורשתית, תופעה אפיגנטית לא מובנת היטב. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של חסינות תורשתית במודל תולעת הניתנת למתיחה גנטית.

חקר חסינות תורשתית במודל Caenorhabditis elegans של זיהום מיקרוספורידיה

פרוטוקול זה מתמקד בשימוש בציטומטריית זרימה וספירת חרוזים כדי לכמת נבגי חיידקים המסומנים באתידיום ברומיד. השיטה יעילה גם לניתוח הצימוד הקוולנטי של חלבונים על פני השטח של נבגים שלמים.

שיפור של Bacillus subtilis ספירת נבגים וניתוח תוויות בציטומטריית זרימה

למדו לזהות שברי קורטקס וסוכרים מחזרים במהלך נביטת נבגים חיידקיים של Clostridium difficile. שיטת מעבדה זו מאפשרת כימות קל ונגיש של תהליכי הנביטה.

זיהוי Cortex שבר במהלך בקטריאלי Spore נביטה

גלה סרטונים נוספים