זיהוי Cortex שבר במהלך בקטריאלי Spore נביטה

המטרה הכוללת של פרוטוקול שלב אחר שלב זה היא לכמת את השפע של שברי קליפת המוח או הפחתת סוכרים במהלך נביטת נבגי חיידקים. שיטה זו תפרט את השלבים הנדרשים לאיתור נוכחות של שברי קליפת המוח או הפחתת סוכרים במהלך נביטת הנבגים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שלרוב המעבדות יש את הריאגנטים והציוד הדרושים להשלמת הפרוטוקול בהצלחה.

התחל הליך זה על ידי הנחת צינור של נבגי קלוסטרידיום דיפיצילה בגוש חימום ודגירה שלו 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הניחו את הצינור על קרח. תמיסת הנביטה היא ספציפית למין נבגי החיידקים הנחקרים.

לבדיקת נביטת נבגי C.difficile, אנו משתמשים בתמיסה של 10 מילי-מולרי Tris ב-pH 7.5 עם 150 מילי-מולרי של נתרן כלורי, 100 מילי-מולרי גליצין וחומצה טאורוכולית 10 מילי-מולרית במים נטולי יונים. הכן מיליליטר אחד של תמיסת נביטה לדגימה בתוספת מיליליטר נוסף. לפני תחילת הבדיקה, העבירו מיליליטר אחד מתמיסת הנביטה לצינור מיקרו-צנטריפוגה והניחו אותו בצד.

זה ישמש כריק לזיהוי שברי קליפת המוח. לאחר מכן, לתמיסת הנביטה, הוסף נבגים ל-OD600 של כ-3.0 ולזמן קצר מערבולת. כמות זו של נבגים עובדת היטב למיתון שחרור שברי קליפת המוח במהלך נביטת נבגי C.difficile.

מיד לאחר הוספת הנבגים, הוציאו דגימה של 1.2 מיליליטר לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש והכניסו אותה לצנטריפוגה. ואז צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת ב 14, 000 פעמים G. לאחר הסיבוב, העבירו מיליליטר אחד של הסופרנטנט לצינור הברגה טרי של שני מיליליטר והקפיאו אותו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.

חזור על התהליך של לקיחת אליקוטים, סיבוב והקפאה במרווחי זמן קבועים עד לאיסוף הדגימה עבור כל נקודת זמן. בגלל הזמן הנדרש לצנטריפוגה ודגימה, נקודות זמן של פחות משתי דקות אינן אפשריות במהלך הליך זה, ולכן דגימות אלו נלקחות אחת לשתי דקות למשך 14 דקות. בזמן הכנת דגימות קליפת המוח, אם יש צורך לעקוב אחר חומצה דיפיקולינית, הסר דגימה נפרדת של 100 מיקרוליטר והוציא בצינור מיקרו-צנטריפוגה על קרח.

הכן גם דגימות ליצירת עקומה סטנדרטית עם הכמויות הבאות של N-אצטיל גלוקוזאמין. אפס, 12.5, 25, 50, 100, 250, 500 ו-5,000 ננומול בתמיסת נביטה. לאחר איסוף דגימה עבור כל נקודת זמן, הוציאו את הדגימות מהמקפיא ועשו ליופיליזציה יחד עם דגימות הריק והעקומה הסטנדרטית.

לאחר מכן אחסן את כל הדגימות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. ביום הבדיקה, השעו מחדש את הדגימות הליופיליות, כולל דגימות הבקרות והעקומה הסטנדרטית, ב-120 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית עם פנול ובטא-מרקפטואתנול. לאחר מכן, העבירו את כל הדגימות התלויות לצינורות מכסה בורג טריים של שני מיליליטר.

לאחר מכן דגרו אותם באמבט מים מחזורי בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר הדגירה מניחים את הדגימות על קרח עד שהן מתקררות. לאחר מכן הוסף 120 מיקרוליטר של שלושה נתרן הידרוקסיד מולארי כדי לנטרל אותם.

לאחר מכן, הוסף 80 מיקרוליטר של תמיסת נתרן ביקרבונט רוויה ו -80 מיקרוליטר של תמיסת אנהידריד אצטית 5% לכל דגימה ומערבל אותה. לאחר מכן דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, העבירו את הדגימות בחזרה לאמבט המים של 95 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות בדיוק.

שים לב ששלב זה רגיש לזמן וזמנים ארוכים יותר יכולים להשפיע על התפתחות האות במורד הזרם. מוציאים את הדגימות מאמבט המים ומצננים אותן על קרח. הוסף 400 מיקרוליטר של 6.54% אשלגן טטרבוראט טטרהידרט לכל צינור ומערבולת.

דגרו את הדגימות באמבט מים מחזורי בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך שבע דקות בדיוק. שלב זה גם רגיש לזמן. הסר את הדגימות והניח אותן על קרח למשך חמש דקות.

בזמן שהדגימות על קרח, הכינו את מגיב הצבע. ממיסים 0.320 גרם DMAB ב-1.9 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית שימו לב שמגיב זה רגיש לזמן, לטמפרטורה ולאור ואין להכין אותו מראש.

לאחר שה-DMAB מתמוסס לחלוטין, הוסף 100 מיקרוליטר של 10 חומצה הידרוכלורית רגילה ומערבל את הדגימה. לאחר מכן מוסיפים שוב חמישה מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית ומערבולת. עבור התגובה הקולורימטרית, העבירו 100 מיקרוליטר מכל קליפת המוח המקוררת או דגימת בקרה לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר.

הוסף 700 מיקרוליטר מתמיסת הצבע הטרייה שהוכנה לכל דגימה. העבירו מיד את הדגימות לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ודגרו על הדגימות למשך 20 דקות בדיוק. לאחר הדגירה, העבירו 200 מיקרוליטר מכל דגימה לצלחת שקופה של 96 בארות.

הדגימות צריכות להיות בצבע צהוב מלכתחילה, אך יעברו לסגול אם קיימת הפחתת סוכר, המעידה על נוכחות קליפת המוח. כאן, רבות מהדגימות אינן מראות צבע סגול גלוי. עם זאת, דגימות 250, 500 ו-5,000 ננומול נראות שונות מבחינה ויזואלית מהננומול אפס הבקרה השלילית.

בעזרת קורא צלחות, קבע את הספיגה ב-585 ננומטר. כאשר נמדד ב-OD של 585 ננומטר, האות שנוצר מהדגימות הסטנדרטיות מתאים ביותר לרגרסיה ליניארית. טבלה זו מציגה תוצאות אופייניות לפי תקני N-אצטיל-גלוקוזאמין.

נתונים אלה שימשו לאחר מכן ליצירת העקומה הסטנדרטית המוצגת כאן. בדיקת נביטה בוצעה בתנאים מקדמי נביטה עם מאגר נביטה בתוספת 100 מילי-מולרית גליצין וחומצה טאורוכולית 10 מילי-מולרית בתנאים שאינם נובטים, 100 מילי-מולרי גליצין בלבד.

בהיעדר חומצה טאורוכולית, נבגי C.Difficile אינם נובטים, ויש שינוי מועט בנוכחות שברי קליפת המוח בתמיסה. עם זאת, בנוכחות חומצה טאורוכולית וגליצין, נבגי C.difficile נובטים ומשחררים שברי קליפת המוח לתמיסה. זה נספג כעלייה ב-OD585 לאורך זמן של הדגימות המגיבות.

כמות שברי קליפת המוח ששוחררה במהלך בדיקה זו חושבה באמצעות עקומה סטנדרטית. כפי שניתן לראות כאן בבדיקה זו, רוב קליפת המוח עברה הידרוליזה או שוחררה על ידי 15 דקות לאחר החשיפה לנביטה. זה מצביע על כך שרוב הנבגים נבטו במסגרת זמן זו.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות שברי קליפת המוח או הפחתת סוכרים בתמיסת נביטה במהלך נביטת נבגי חיידקים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשים לב היטב לזמני התגובה כדי שהבדיקה תתפתח כהלכה.