השרשה ורישום האלחוטי electroretinogram ופוטנציאל חזותי מעורר אצל חולדות Conscious
29 ביוני 2016
אנחנו מראים נהלי השתלת הקלטה כירורגית למדוד אותות חזותיים אלקטרו מן העין (electroretinogram) והמוח (ויזואלי עורר פוטנציאל) בחולדות מודעות, וזה יותר מקביל למצב האנושי שבו הקלטות מתנהלות ללא מקעקעת הרדמה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד אותות ERG ו-VEP מודעים לאחר השתלה כירורגית של בדיקות טלמטריה אלחוטיות. טכניקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון כיצד נוירונים מתנהגים ללא מגבלה של הרדמה כללית הן בתנאים בריאים והן במצב חולה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הקלטה בו זמנית של האלקטרופיזיולוגיה של הרשתית ושל קליפת המוח הראייתית בבעל חיים מודע.
כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את האלקטרודות תחת מיקרוסקופ. לשם כך שחרר אלקטרודה כפולה מפלדת אל חלד עם שני צבת עדינה. חתוך את אחד מגדילי הנירוסטה בערך סנטימטר אחד מהקצה, והשאיר גדיל אחד ארוך וישר לעיצוב אלקטרודת הטבעת.
לאחר מכן, קפלו את גדיל הנירוסטה היחיד בחזרה לתוך עצמו וסובבו ליצירת טבעת חלקה בקצה האלקטרודה. לאחר מכן, עצב אלקטרודה פעילה של ERG על ידי סיבוב בסיס הלולאה ליצירת מעגל בקוטר של נקודה שתיים עד נקודה חמישה מילימטרים. עבור שתי האלקטרודות הלא פעילות של ERG והאלקטרודות הלא פעילות של VEP הופכות את קוטר הלולאה לנקודה של שמונה מילימטרים.
בדוגמה זו, הכינו ERG פעיל אחד ושלוש אלקטרודות לא פעילות. לאחר מכן, חבר את האלקטרודה הפעילה VEP העגולה סביב בורג נירוסטה כך שהאלקטרודה מונחת על ראש הבורג. לאחר מכן, חבר את שלוש האלקטרודות הלא פעילות סביב בורג נירוסטה שני.
האלקטרודה הקרקעית תיכנס ישירות לחלל הצפק ואין צורך ליצור לולאה בקצה. לאחר גילוח וחיטוי אזור הניתוח של בעל חיים מורדם, בצע חתך של 10 מילימטר בראש לאורך קו האמצע בין האוזניים בעזרת אזמל כירורגי. לאחר מכן, בצע חתך של חמישה מילימטר על הבטן דרך שכבת העור, לאורך קו האמצע מתחת לעצם החזה.
לאחר מכן, מנהרה של צינורית בקוטר חמישה מילימטר תת עורית, מחתך הבטן לחתך הראש. הזינו את חוטי האלקטרודה של השיזוף דרך הצינורית מהבטן לראש. השאר את אלקטרודת הייחוס עם בסיס המשדר.
לאחר מכן, מכסים את כל קצות האלקטרודות בגזה אספטית. לאחר מכן, אבטח את ראש החולדה לפלטפורמה סטריאוטקסית. הארך את חתך המצח ל -30 מילימטרים בעזרת מספריים כירורגיים.
לאחר מכן, חשוף אזור כירורגי על ידי נסיגת העור בשני תפרים. מגרדים את הפריאוסטאום שמעל הגולגולת כדי לחשוף את התפרים ברגמה, למבדה וקו האמצע. לאחר מכן, קדחו שני חורים דרך הגולגולת בקואורדינטות הסטריאוטקסיות הפעילות של VEP ו-ERG, VEP לא פעילות.
חבר את האלקטרודות הפעילות והלא פעילות עם ברגי נירוסטה לגולגולת לעומק של כמילימטר אחד. כדי להשתיל את האלקטרודות הפעילות של ERG, השתמש בתפר כדי למשוך זמנית את העפעף העליון. לאחר מכן, הכנס צינורית בגודל 16 עד 21 תת עורית מאחורי העין דרך הלחמית העליונה למצח.
לאחר מכן, הסר את המחט המנחה. לאחר מכן, הזינו את האלקטרודה הפעילה דרך קטטר פלסטיק מהמצח לכיוון העין. לאחר מכן, הסר את קטטר הפלסטיק.
השתמש בתפר זמני, המושחל דרך לולאת האלקטרודה כדי למנוע מהאלקטרודה לסגת חזרה למנהרה. לאחר מכן, בצע חתך של חמישה מילימטר על הלחמית העליונה מילימטר אחד מאחורי הלימבוס. השתמש בדיסקציה קהה כדי לחשוף את הסקלרה הבסיסית.
לאחר מכן, השתל תפר מיד מאחורי הלימבוס בעובי חצי סקלרלי והיזהר לא לנקב את גלגל העין. לאחר מכן, הסר את התפר הזמני מהאלקטרודה הפעילה של ERG. עוגן את האלקטרודה הפעילה של ERG לתפר בעובי חצי סקלרלי על ידי קשירת שלושה קשרים רצופים וודא שקצה האלקטרודה ממוקם קרוב ללימבוס ליחס אות לרעש טוב.
במידת הצורך משוך לאחור את כבל האלקטרודה העודף כך שהאלקטרודה הפעילה לא תפגע בקרנית. לאחר מכן, סגור את דש הלחמית באמצעות תפר אחד עד שניים קטועים כדי לכסות לחלוטין את אלקטרודת ה-ERG. לאחר מכן, הסר את התפר הנסוג של העפעף.
חזור על ההליך עבור העין הנגדית. כעת, מרחו ג'ל ציאנואקרילט על הגולגולת כדי לאבטח את כל ברגי הנירוסטה וחוטי האלקטרודות. ודא שהאלקטרודות הפעילות של ERG אינן נמשכות בחוזקה לפני שהן מאובטחות כדי לאפשר תנועות עיניים.
לאחר מכן, סגור את החתך באמצעות תפרים קטועים. לאחר מכן, סובב את המכרסם כדי לחשוף את אזור הבטן. הארך את החתך העורי בבטן ל -40 מילימטרים לאורך הלינאה אלבה בעזרת מספריים כירורגיים.
לאחר מכן, בצע חתך של 35 מילימטר דרך דופן השריר הפנימי, כדי לחשוף את חלל הבטן הפנימי. בעזרת שני תפרים, חבר את גוף המשדר לדופן הבטן הפנימית של החיה מימין והימנע ממגע עם הכבד. קפלו את האלקטרודה הקרקעית על ידי אבטחתה בלולאה עם שני תפרים והניחו אותה, צפה בחופשיות, בחלל הבטן יחד עם מובילי האלקטרודות האחרים.
לאחר מכן, סגור את הצפק באמצעות תפר רציף. לאחר מכן סגור את חתך העור באמצעות תפרים קטועים. להקלטת אותות מותאמים לחושך, בעלי חיים מותאמים לחושך למשך 12 שעות וכל ההליכים מבוצעים בחדר חשוך בעזרת אור אדום עמום.
למטרות המחשה, ההקלטות יבוצעו בתנאי תאורה רגילים של החדר כאן. לפני ההקלטה, יש למרוח הרדמה מקומית וטיפות הרחבה על קרנית החולדה. לאחר מכן, הנחו את החיה המודעת לתוך מרסן ברור ומותאם אישית.
הניחו את החולדה מול קערת גנצפלד כשעיניה מיושרות עם פתח הקערה. הפעל את המשדר השוכן על ידי העברת מגנט בטווח של חמישה סנטימטרים ממנו. ודא שהמשדר דולק על ידי בדיקת נורית המצב LED בבסיס המקלט.
סגור את כלוב פאראדיי שהבית הוא כרית המקלט כדי לשפר את יחס האות לרעש. לאחר מכן, אסוף אותות על פני טווח של אנרגיות זוהרות. איור זה מראה את צורות גלי ה-ERG בחולדות בהכרה ביום השביעי לאחר הניתוח.
תגובות ERG תועדו לטווח אנרגיית הגירוי עם התגובה להבזק העמום המוצג בתחתית וההבזק הבהיר ביותר בחלק העליון. ביום ה-28 לאחר הניתוח, צורות הגלים הללו נותרו דומות לאלו של היום השביעי. במשך ארבעה שבועות לא הייתה השפעה משמעותית על משרעת קולטני הצילום והרגישות.
משרעת ורגישות של תאים דו-קוטביים של מוט. משרעת תאים דו-קוטביים חרוטיים. וזמן מרומז.
באופן דומה, צורות גלי VEP נראות דומות שבעה ו-28 ימים לאחר הניתוח. עם פרמטרי משרעת ותזמון המראים שאין השפעה משמעותית על הזמן. תוצאות אלה הצביעו על יציבות איתנה של אותות ERG ו-VEP
.לאחר השליטה, המרכיב הכירורגי של הטכניקה יושלם תוך שעה וחצי עד שעתיים. רכיב ההקלטה המודע, אם מבוצע כראוי, יכול להסתיים תוך 45 דקות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע גם שיטות אחרות כמו מניפולציה תרופתית או מחלה.
זה יענה על שאלות נוספות בגילוי תרופות כמו גם בניסויי אורך כרוניים. בנוסף, ניתן לבצע הליך זה גם בבעלי חיים אחרים במידת הצורך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתיל בניתוח ולאחר מכן למדוד אותות טלמטריה מודעים של ERG ו-VEP.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים הליכי השתלה כירורגית והקלטה למדידת אותות אלקטרופיזיולוגיים חזותיים מהעין ומהמוח בחולדות בהכרה. גישה זו מקבילה יותר למצבים אנושיים, שכן היא נמנעת מהשפעותיהם המבלבלות של חומרי הרדמה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- התנהגות בעלי חיים
רקע
- אלקטרו-רטינוגרם (ERG) מודד תגובות רטינליות.
- פוטנציאל עורר חזותי (VEP) מעריך תגובות קורטיקליות.
- הקלטה מודעת מספקת תובנות לגבי התנהגות עצבית.
- הרדמה כללית עלולה לשנות תגובות פיזיולוגיות.
מטרת המחקר
- למדידת אותות ERG ו-VEP במצב של ערנות.
- להבנת ההתנהגות הנוירונלית במצבים בריאים ובמצבי מחלה.
- לפיתוח טכניקה להקלטה סימולטנית מהרשתית וממהקליפת המוח החזותית.
שיטות שהשתמשו בהן
- השתלה כירורגית של גששים לטלמטריה אלחוטית.
- הכנת אלקטרודות תחת מיקרוסקופ.
- הקלטה של אותות אלקטרופיזיולוגיים מבעלי חיים בהכרה.
- ניתוח נתונים להערכת תגובות עצביות.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של ERG ו-VEP בחולדות בהרהור.
- הוכחת ההיתכנות של הקלטות סימולטניות.
- מתן תובנות לגבי פעילות נוירונלית ללא הרדמה.
- הדגשת היתרונות של טכניקה זו למחקר במדעי המוח.
מסקנות
- הטכניקה מאפשרת הערכות מדויקות יותר של עיבוד חזותי.
- היא פותחת נתיבים חדשים לחקר התנהגות עצבית בתנאים שונים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלו כדי לבחון שאלות נוספות במדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידת התפקוד הרטינלי ותפקוד נתיבי הראייה ללא שימוש בחומרי הרדמה משפרת את יכולת הניבוי התרגומית (translational predictability) לפיתוח טיפולים נוירו-תרפויטיים. פלטפורמה זו להקלטה במצב ערות מאפשרת הערכה אורךית של מעורבות המטרה (target engagement) ומודולציה של נתיבים במודלים של מחלות. היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי אספקת ביומרקרים רלוונטיים פיזיולוגית של עיבוד חזותי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות בנושא שלמות הרשתית ומסלולי הראייה בבעלי חיים בהכרה.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות על ידי בידוד השפעות התרופות על הסיגנלינג העצבי ללא הפרעה של חומרי הרדמה.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח באמצעות מדידות יציבות וחזרתיות של אמפליטודה ותזמון ב-ERG ו-VEP לאורך ארבעה שבועות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף להערכה של תרכובות בשלבים הבאים, עם פלטים אלקטרופיזיולוגיים כמותיים.
- שחזוריות: סטנדרטיזציה של רכישת אותים על פני טווחים של אנרגיה אורית למדידות עקביות של אמפליטודה ופרמטרים של רגישות/תזמון.
- הפעלת סריקה: מאפשר סריקה מהימנה של תרכובות על ידי אספקת קווי בסיס יציבים של ERG ו-VEP בחולדות בהכרה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה תפקוד לקוי של הרשתית ומסלולי הראייה במחקרי פרה-קליניים עם יכולת תרגום קלינית.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני באמצעות הקלטות ERG ו-VEP יציבות ללא הרדמה.
- קידום מותאם סיכונים: מספק בסיס להחלטות go/no-go על ידי כימות שינויים בתהליכי עיבוד חזותי המתווכים על ידי המטרה במהלך מחקרי אורך.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בביולוגיה של גילוי לצורך בדיקת השערות, סריקה לבדיקת מוכנות של המערך (assay), אנליטיקה לקבלת תוצאות כמותיות, ומחקר תרגומי להמשכיות פרה-קלינית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בחקירת מטרות טיפוליות המשפיעות על תפקוד הרשתית ומסלולי הראייה במצבים של ערות.
- סריקה: מספק מערכות מוכנות לבדיקה עם תוצאי ERG ו-VEP ניתנים לשחזור עבור קמפיינים של סריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר פרמטרים כמותיים של אמפליטודה, רגישות ותזמון המאפשרים השוואה בין תנאים שונים וקביעת גודל האפקט.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודות פרה-קליניות באמצעות סממנים ביולוגיים (biomarkers) יציבים וארוכי טווח של שלמות מסלולי הראייה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לצורך ניטור אלקטרופיזיולוגי כרוני לאורך שלבי מחקר מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות הפחתת סיכונים מכניסטית של סממנים ביולוגיים של המסלול הראייתי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של רישומים אלקטרופיזיולוגיים בבעלי חיים בהכרה.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות go/no-go, יעילות הון והפחתת סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים בתוכניות של מדעי העצבים של הראייה.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על שינויים אובייקטיביים ב-ERG וב-VEP המעידים על מעורבות המטרה או על מודולציה של המסלול.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהשתלת אלקטרודות במיקרו-כירורגיה ובמערכות טלמטריה אלחוטיות.
- נדרש מיכשור סטריאוטקסי, כלי ניתוח ותשתית להקלטה אלקטרופיזיולוגית.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים לפרוטוקולים של הכנת אלקטרודות, השתלה ורכישת אותות.
- כולל שיקולי התאמה לגודל ומיקום האלקטרודות עבור זנים או גילאים שונים של מכרסמים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון זמן התאוששות מהניתוח וניטור יציבות האות לאורך תקופות השתלה כרוניות.
