Name: הזרקת intracerebroventricular ו intravascular של חלקיקים נגיפיים ו פלורסנט microbeads לתוך המוח בילוד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: למדו הזרקת חלקיקים נגיפיים ומיקרובידים פלורסנטיים למוח יילודי בעכברים. שיטה זו מאפשרת מעקב ישיר אחר התפלגות נגיפים במערכת העצבים המרכזית בשלב הזיהום החריף.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים למר Masaaki Kaneta, לגב' Hiromi Suzuki ולגב' Mitsue Kawashima (המחלקה לפתולוגיה רגנרטיבית וזיהומית, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת Hamamatsu) על הסיוע הטכני המצוין שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי האגודה היפנית לקידום המדע, מענק KAKENHI מספר 23590445.

<ol><li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandoraviruses%3A+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+brain+injection+of+adeno-associated+virus+type+1+%28AAV1%29+in+neonatal+mice+results+in+complementary+patterns+of+neuronal+transduction+to+AAV2+and+total+long-term+correction+of+storage+lesions+in+the+brains+of+beta-glucuronidase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice.</a> J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualising+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).</li>
<li>McLean, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+neuron-specific+transgene+expression+in+brain+and+spinal+cord+following+synapsin+promoter-driven+AAV9+neonatal+intracerebroventricular+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection.</a> Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).</li>
<li>Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cytomegalovirus+displays+selective+infection+of+cells+within+hours+after+systemic+administration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol.+90%22%5BJournal%5D)">Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration.</a> J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).</li>
<li>Sakao-Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+fetal+macrophage%2Fmicroglial+reactions+to+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Translational+Neruology%22%5BJournal%5D)">Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection.</a> Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).</li>
<li>Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injections+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravenous injections in neonatal mice.</a> J Vis Exp. (93), e52037(2014).</li>
<li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus+initiates+infection+selectively+from+high-level+beta1+integrin-expressing+cells+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain.</a> Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).</li>
<li>Rahim, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+AAV2%2F9+to+the+fetal+and+neonatal+mouse+leads+to+differential+targeting+of+CNS+cell+types+and+extensive+transduction+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system.</a> FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).</li>
<li>Cannon, M. J., Davis, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Washing+our+hands+of+the+congenital+cytomegalovirus+disease+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic.</a> Bmc Public Health. 5, (2005).</li>
<li>Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+eye+abnormalities+associated+with+congenital+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection.</a> Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).</li>
<li>Becroft, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+cytomegalovirus+infection%3A+epidemiology%2C+pathology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Perspect+Pediatr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis.</a> Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).</li>
<li>Conboy, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intellectual+development+in+school-aged+children+with+asymptomatic+congenital+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection.</a> Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).</li>
<li>Fowler, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outcome+of+congenital+cytomegalovirus+infection+in+relation+to+maternal+antibody+status%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status.</a> N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).</li>
<li>Cannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+cytomegalovirus+%28CMV%29+epidemiology+and+awareness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness.</a> J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).</li>
<li>Grassi, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+nodular+encephalitis+and+ventriculoencephalitis+due+to+cytomegalovirus+infection+in+patients+with+AIDS%3A+two+distinct+clinical+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns.</a> Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).</li>
<li>Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporine+inhibits+mouse+cytomegalovirus+infection+via+a+cyclophilin-dependent+pathway+specifically+in+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells.</a> J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).</li>
<li>Britt, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus%3A+propagation%2C+quantification%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13(2010).</li>
<li>Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryonic+stem+cells+inhibit+murine+cytomegalovirus+infection+through+a+multi-step+process%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process.</a> PLoS One. 6 (3), e17492(2011).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+sections+of+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cutting sections of paraffin-embedded tissues.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Chi, V., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry%3A+paraffin+sections+using+the+Vectastain+ABC+kit+from+vector+labs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs.</a> J Vis Exp. (8), e308(2007).</li>
<li>Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cardiomyocyte+development+using+immunofluorescence+in+embryonic+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Ohshima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+and+intravenous+deliveries+are+not+comparable+in+terms+of+drug+efficacy+and+cell+distribution+in+neonatal+mice+with+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia.</a> Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).</li>
<li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> J Vis Exp. (91), e51863(2014).</li>
<li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+%28ICV%29+and+intravenous+%28IV%29+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במודלים של בעלי חיים, ICV, intraperitoneal, שליה ישירה, וזיהומי IV שמש ללמוד בפתוגנזה של דלקת מוח ויראלית. התמקדנו דגמי ICV ו- IV הזרקה של עכברים בילוד עבור הפשטות של הנהלים לטובת הזרקה ישירה של חלקיקים לתוך אזור היעד. למרות זיהום intraperitoneal הוא שיטה קלה, חלקיקים נגיפיים להפיץ מערכתי באמצעות 5,24 תהליך עקיף. זיהום שליה ישיר הוא שיטה טובה ללמוד זיהום מערכתי עוברי. עם זאת, שיטה זו דורשת הכשרה מיוחדת כדי להניב תוצאות יציבות ויש לו שיעור הצלחה נמוך. שיטת הזיהום היא גם ...

כאשר לומדים אנצפליטיס ויראלי, חלוקת הראשונית של חלקיקים נגיפיים מאוד חשוב להבין בהיווצרות המחלה ולזהות מטרות ויראלי במוח. רוב הווירוסים טווח בגודל מ 20 כדי 300 ננומטר, למרות Pandoravirus הוא יותר מ -700 ננומטר בגודל 1. התפלגות החלקיקים הנגיפיים בשלב החריף של זיהום עלולה תלוי בגודל של החלקיקים, החלוקה קולטנית תאים, או הזיקה של קולטני התאים לאיתור וירוסים. במודלים של בעלי חיים, intracerebroventricular (ICV), intraperitoneal, שליה ישיר, ו תוך ורידי (IV) זיהומים שימשו ללמוד בפתוגנזה של דלקת המוח ויראלית. חיסון עם וירוס ICV משמש לעתים קרובות כדי להקים מערכת העצבים המרכזית (CNS) זיהומים בעכברים. מחקרים שעשה שימוש בטכניקה זו לדווח זיהום נפוץ, במיוחד של תאי אזורי periventricular וב האזורים במוח בקשר ישיר עם הנוזל השדרתי (CSF), similar להשפעות של ventriculoencephalitis ויראלי. גודלו הקטן של וירוס adeno הקשורים (AAV) חלקיקים (20 - 25 ננומטר בקוטר) הופך לפשוט תפוצתם בכל חלקי המוח זיהומים ICV 2-4. Intraperitoneal 5, שלית 6 ישירה, וזריקות IV 7 לייצג ממשל מערכתי hematogenic. חדירת חלקיקים נגיפיים דרך מחסום הדם-מוח (BBB) ​​מאפשר להם להגיע parenchyma של המוח בילוד, המייצג גושים microglial מפוזר 8,9. ציטומגלווירוס (CMV) הוא וירוס נפוץ שייך למשפחת וירוס ההרפס. בארצות הברית, 50% - 80% מהאנשים היו זיהום CMV לפי גיל 40. זיהומי CMV הם לעתים רחוקות מזיקים אבל יכולים לגרום למחלות בחולים ועוברים מדוכאי חיסון. מכלל הלידות, 0.2% - 2% נולדים עם CMV 10, וכתוצאה מכך תופעות חמורות כגון מיקרוצפליה, הסתיידות periventricular, hypoplasia המוח הקטן, micrדלקת העין, ואת עצב הראייה ניוון 11,12. יתר על כן, פיגור שכלי, איבוד שמיעה עצבי, פגמים חזותיים, התקף, אפילפסיה להתרחש כ -10% של אי-אנושות תינוקות CMV נגוע 13,14. תפקוד לקוי של מערכת העצבים המרכזית היא סימפטום אופייני הנפוצים ביותר של האנומליה המולדת CMV. עוד ילדים הם נכים לכל החיים בכל שנה על ידי CMV מולד מאשר תסמונת דאון, תסמונת אלכוהול עוברית, או ספינה ביפידה 15. אין חיסון נגד CMV זמין על ההווה, קוראת צורך של חיסון בטוח ויעיל. לימוד האינטראקציה של חלקיקי CMV עם קולטנים שלהם בשלב המוקדם של זיהום חשוב להבין את ההשפעה של החיסון. Ventriculoencephalitis גושים microglial מפוזר הם שני מאפיינים פתולוגיים הראשי של CMV דלקת המוח 16. זה כבר לא ברור כיצד חלקיקי CMV (150 - 300 ננומטר) להפיץ דרך המוח בשלב החריף של זיהוםnd איך חלוקת קולטנים הסלולר זיקתם וירוסים תורמים להתפשטות ויראלית. קוואסאקי et al. הערך ICV ו- IV זיהומים מנקודת המבט של ההפצה של חלקיקים הקולטנים שלהם (integrin β1) בשלב המוקדם של זיהום. מצאנו כי הפצת חלקיקי CMV ואת הביטוי של integrin β1 מתואמת היטב בשלב המוקדם של זיהום בשני ICV ו- IV זיהומי 8. זיהום ICV הוא מודל של ventriculoencephalitis וזיהום IV הוא מודל של גושי microglial מפוזרים. לימוד הדינמיקה של חלקיקים נגיפיים או פלורסנט ייתן מידע שימושי על השפעת גודל החלקיקים, אינטראקציות ויראלי עם קולטני התאים, ואת מנגנון החדירה BBB במוח. הפרוטוקול הבא יכול לשמש כדי לחקור כל זיהום ויראלי וקטור ויראלי של מערכת העצבים המרכזי.

<table><tbody><tr><td>טריס; טריס (הידרוקסימתיל)- אמינומתאן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T-6791</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H-1758</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 וקטור&nbsp;</td><td>Clontech</td> <td># 6085-1</td><td></td></tr><tr><td>D-סורביטול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S-1876</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM פוליסטירן פלואורסצנטי נילוס אדום 0.04 - 0.06</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-00556-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM פוליסטירן פלואורסצנטי אדום נילוס 0.1 - 0.3</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-0256-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM פוליסטירן ניאון אדום נילוס 1.7 - 2.2</td><td>Spherotech, inc.&nbsp;</td><td>FP-2056-2</td><td></td></tr><tr><td>10% סרום עכבר</td><td>DAKO&nbsp;</td><td>X0910</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 עכבר</td><td>SLC, בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עכבר ICR</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרקי מיקרוליטר שונה (סדרת 7000)</td><td>חברת</td><td></td><td></td>המילטון</tr><tr><td>מחט 35 מד</td><td>Saito Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A Wee Sight Transilluminator</td><td>Phillips Healthcare</td><td>1017920</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet(R) P-40</td><td>Nacalai</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ציטראט (pH 6) x 10</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C9999-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>פפסין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>dojindo</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>TCI</td><td>F0045</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן דקסטרן סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>42867-5G</td><td></td></tr><tr><td>דנהרדט תמיסה (50x)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>שמרים tRNA (10 מ"ג/מ"ל)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>SSC 20x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus glass</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>12-55-18</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeep II</td><td>Nippon Shoji Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Griffonia simplicifolia isolectin B4 Vector laboratories, Inc. מצומד ל-FITC</td><td></td><td>L1104</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD31 (PECAM-1) PE</td><td>ebioscience</td><td>12-0311</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&nbsp; זהב</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>BIOREVO</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000E</td><td></td></tr></tbody></table>

הזרקת intracerebroventricular ו intravascular של חלקיקים נגיפיים ו פלורסנט microbeads לתוך המוח בילוד

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

במחקר על בפתוגנזה של דלקת מוח ויראלית, שיטת ההדבקה היא קריטית. הראשון מבין שני מסלולי זיהומיות העיקריים למוח הוא הדרך hematogenous, הכוללת זיהום של תאי האנדותל pericytes של המוח. השני הוא intracerebroventricular המסלול (ICV). לאחר מכן, בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS), וירוסים עלולים להתפשט בחלל תת-העכבישים, קרומי המוח, ואת המקלעת דמתה עין באמצעות נוזל השדרה. במודלים ניסיוניים, בשלבים המוקדמים של ההפצה ויראלית CNS אינם מתאפיינים גם, ולא ברור אם תאים מסוימים רק בתחילה נגועים. הנה, יש לנו ניתחו את חלוקת ציטומגלווירוס (CMV) חלקיקים בשלב החריף של זיהום, כינה viremia העיקרי, בעקבות ICV או intravascular (IV) הזרקה לתוך המוח עכבר בילוד. במודל הזרקת ICV, 5 μl של murine CMV (MCMV) או microbeads פלורסנט הוזרקו החדר לרוחב בבית midpoiNT בין העין לאוזן באמצעות מזרק 10 μl עם מחט 27 G. במודל הזרקה IV, מזרק 1 מ&quot;ל עם מחט 35 G היה בשימוש. Transilluminator שמש כדי להמחיש את הווריד (פנים) הזמני השטחי של העכבר בילוד. אנו חדורים 50 μl של MCMV או microbeads פלורסנט לווריד הזמני השטחי. המוח נקצרו בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה. הגנום MCMV התגלו באמצעות שיטת הכלאה באתרו. microbeads פלורסנט או חלבון פלואורסצנטי ירוק להביע חלקיקי MCMV רקומביננטי נצפה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. טכניקות אלה ניתן ליישם פתוגנים רבים אחרים לחקור בפתוגנזה של דלקת קרום המוח.

במחקרים על בפתוגנזה של דלקת מוח ויראלית, שיטת ההדבקה חשובה. מסלול hematogenous מייצג זיהום חריף של תאי האנדותל pericytes של המוח, בעוד מסלול ICV מייצג זיהום חריף מתפשט דרך CSF בחלל תת-העכבישים, מגיע עד קרומי המוח ואת המקלעת דמתה. כדי לנתח את ההתפלגות הראשונה של חלקיקי דלקת המוח חריף, כלאה באתרו גילוי הגנום MCMV והתבוננות ישירה של חלקיקי M32-EGFP-MCMV או microbeads פלורסנט שמשו. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" s...

כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה של הזרקה תוך חדרית ותוך וסקולרית של חלקיקים נגיפיים או מיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים למוח העכבר היילוד. ניתן לזהות את דפוס הלוקליזציה של הנגיף והננו-חלקיקים על ידי הערכה מיקרוסקופית או על ידי הכלאה באתר.

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון את התפלגות החלקיקים הוויראליים במהלך השלב האקוטי של הזיהום במערכת העצבים המרכזית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירו-וירולוגיה, כגון האופן שבו חלקיקים ויראליים מתפלגים במערכת העצבים המרכזית הבלתי בשלה במהלך שלב הזיהום האקוטי.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לצפות ישירות בפיזור הראשוני של החלקיקים הוויראליים באמצעות מיקרוסקופ, תוך שימוש בשתי שיטות פשוטות, כגון הזרקה תוך-חדרית (intercerebroventricular) והזרקה תוך-כלית (intravascular). התחל בסטריליזציה של מזרק בנפח 10 µL ומחט במידה 27 gauge באמצעות 70% alcohol.לאחר מכן, טען חמישה µL של תמיסת הזרקה של cytomegalovirus עכברי או חלקיקים מיקרוסקופיים פלואורסצנטיים לתוך המחט על ידי משיכה זהירה של בוכנת המזרק. לאחר הרדמה וקיבוע של עכבר י新生 PO.5 על ידי הנחתו על קרח למשך שלוש עד ארבע דקות, השתמש בשיטת תגובת צביטה באצבע כדי לקבוע את עומק ההרדמה. סמן את אתר ההזרקה בעכבר המורדם באמצעות טוש מעבדה לא רעיל במיקום הנמצא כ-0.7 עד 1.0 mm לטרלית לתפר הסגיטלי ו-0.7 עד 1.0 mm מה-bregma של היילוד.תרשים זה מציג את האתר בפירוט רב יותר. לצורך ייחוס, סמנו 2 mm מקצה המחט באמצעות טוש שאינו רעיל. לאחר מכן, הכניסו את המחט לעומק של 2 mm בניצב לפני השטח של הגולגולת באתר ההזרקה המסומן.לאחר מכן, הזריקו באיטיות 5 µL של murine cytomegalovirus לתוך החדר הצדי (lateral ventricle) מבלי לפתוח את הקרקפת. בקבוצה אחרת של עכברים, הזריקו 5 µL של תמיסה המכילה חרוזי מיקרו פלואורסצנטיים באותה שיטה. לאחר ההזרקה, השאירו את המחט במקומה למשך 10 עד 20 שניות כדי למנוע נזילה חזרה.לאחר מכן הוצא את המחט באיטיות. אפשר לבעלי החיים שהוזרקו להתאושש במשך 5 עד 10 דקות בתוך מיכל חם עד להשבת התנועה והתגובתיות הכללית. להזרקה תוורידית, קבע את היילוד המורדם למכשיר התאורה התת-עורית (transilluminator) באמצעות סרט הדבקה כירורגי, ולאחר מכן אתר את הווריד הרטמי השטחי (superficial temporal vein).בשלב הבא, בעודכם מרכיבים משקפי הגדלה פי 1.5, השתמשו במזרק של 1 ml עם מחט בכיול 35 כדי להחדיר לאט 50 microliters של murine cytomegalovirus לתוך הווריד הטמפורלי השטחי (superficial temporal vein). חזרו שוב על הפרוצדורה עם חרוזי מיקרו פלואורסצנטיים בגודל המתאים בקבוצת הביקורת. לאחר הוצאת המחט, השתמשו בגזה ספוגה ב-70% alcohol כדי להפעיל לחץ על נקודת ההזרקה עד להפסקת הדימום.השאירו את היילוד למשך כחמש דקות במיכל חם כדי שיתאושש לפני החזרתו לכלוב. שעתיים לאחר הזרקה תוך-חדרית (introcerbroventricular) בשלב הזיהום החריף, חלקיקי M32 EGFP MCMV רקומביננטיים ירוקים נצפים בעיקר באזור השולי, כפי שמוסמן על ידי החצים וכפי שנראה באזור המוגדל. בנקודת זמן זו, חלקיקי M32 EGFP MCMV נראים גם במקלעת הדמעית (choroid plexus) ובאזור התת-חדרי (subventricular zone).גנום ה-MCMV מזוהה לראשונה באזור הסוב-ונטריקולרי שלוש שעות לאחר הזרקה תוך-חדרית מוחית. באמצעות היברידיזציה פלואורסצנטית ו-C2, גנום ה-MCV נראה כנקודות ירוקות ומסומן בחצים באזור מוגדל זה. שלוש שעות לאחר הזרקה תוך-ורידית, חלקיקי ה-MCMV הנראים כנקודות ירוקות ומסומנים בחצים נמצאים בתוך ומחוץ לאזור הווסקולרי של הפארנכימה, כפי שמוצג בתמונה זו בהגדלה מוגברת.בשלב זה חלקיקי ה-MCMV עדיין נראים בפלקסוס הכורואידאי (choroid plexus) ובאזור התת-וונטריקולרי. באמצעות היברידיזציה פלואורסצנטית ו-C2, הגנום של ה-MCMV מזוהה באזור הווסקולרי ובקרומי המוח 12 שעות לאחר הזרקה תוורידית (IV), כפי שמוצג על ידי החצים.ברגע שהטכניקה תשלט, ניתן לבצע אותה תוך חמש דקות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבנה טובה של אופן תצפיות על התפלגות חלקיקי נגיף במהלך השלב החריף של זיהום במערכת העצבים המרכזית. אל תשכחו שעבודה עם נגיף עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון הרכבת מסכות וכפפות בעת ביצוע הליך זה.

intracerebroventricular-intravascular-injection-viral-particles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מציגים את הזריקה תוך גולגולתי של וקטורים AAV תיוג הניאון של גליה נוירונים בקליפת המוח הראייתית.

הזרקה תוך גולגולתי של Adeno הקשורים וקטורים ויראליים

מאמר זה מדגים שתי שיטות שונות של הזרקת מאוד: 1) לתוך המוח (intracerebroventricular) ו 2) מערכתית (תוך ורידי) כדי להציג את סוכני טיפולית לתוך מערכת העצבים המרכזית של עכברים הילוד.

מסירה של סוכני טיפולית באמצעות Intracerebroventricular (ICV) ו תוך ורידי (IV) הזרקה של עכברים

שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

סרטון זה מדגים את תהליך ההזרקה התוך-מוחית לחקר התפלגות ציטומגלווירוס מורין (MCMV) במוח עכבר יילודים. MCMV, שתוכנן לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) לנראות, מוזרק לחדר הצידי במוחו של גור עכברים. הנגיף המוזרק מסתובב דרך הנוזל השדרתי, מדביק תאים באזור periventricular, כולל אזור השוליים, מקלעת כורואיד ואזור subventricular.

הזרקה תוך-מוחית לניתוח התפלגות ציטומגלווירוס מורין במוח עכבר יילודים

ציטומגלווירוס זיהום (HCMV) אנושי של ילודים מייצג גורם חשוב של פיגור שכלי, אולם האירועים המולקולריים המובילים להיווצרות מחלה הנגרמת וירוס עדיין הם הבינו היטב. כדי לחקור את הדינמיקה של דלקת המוח, התאמנו כל הבעלים...

שימוש<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה למעקב אחר ההתקדמות של זיהום ציטומגלווירוס עכבר ניסיוני בילודים

כאן אנו מדגימים טכניקה להתמרה עצבית נרחבת על ידי הזרקה תוך-חדרית של נגיף הקשור לאדנו למוח העכבר היילוד.  שיטה זו מספקת דרך מהירה וקלה להשיג ביטוי לכל החיים של טרנסגנים המועברים באופן ויראלי.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

מודלים של בעלי חיים למחלות ילדים יכולים לחוות התפרצות מוקדמת והתקדמות מחלה אגרסיבית. מבחינה קלינית משלוח טיפול רלוונטי למודלים של עכברים צעירים יכול להיות קשה מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מתאר שיטת הזרקה תוך ורידית לא פולשנית לעכברים שזה עתה נולדו בתוך שני הימים לאחר הלידה הראשונה של חיים.

זריקות תוך ורידים בעכברים בילוד

כאן נתאר שיטת יצירת מודל של Zika הנוצרות על-ידי וירוס microcephaly עכבר. פרוטוקול זה כולל שיטות חיסון גרם עובריים neonatal, מבוגר-שלב של הנגיף Zika.

יצירת מודלים העכבר עבור וירוס Zika-induced הפרעות נוירולוגיות באמצעות הזרקת גרם אסטרטגיות: עובריים Neonatal, למבוגרים

פרוטוקול זה נועד להדגים מסלול מתן ורידי הניתן לשחזור שניתן להשתמש בו בחולדות ובעכברים לאורך תקופת היילוד. הליך זה חשוב למחקרי מכרסמים פרה-קליניים המעוניינים לשקף מתן תרופתי ביחידות לטיפול בילודים בעיקר באמצעות מתן תוך ורידי.

מודל מכרסם יילוד של הזרקת ורידים רטרואורביטלית

הפרוטוקול הנוכחי מתווה הוראות שלב אחר שלב לביצוע זריקות תוך-תיקליות בעכברים יילודים לצורך עריכת גנים והעברת תרופות.

הזרקה תוך-תטית של עכבר שזה עתה נולד לצורך עריכת גנום ואספקת תרופות

מתוארת טכניקה חדשה להעברה נרחבת של נגיף הקשור לאדנו, המשתמשת בעירוי וירוס תת-עכבישי. שיטה זו לא רק מבטיחה התמרה נרחבת של נוירונים ניאו-קורטיקליים של עכברים בשכבות שטחיות, אלא גם מביאה לביטוי סלקטיבי של הטרנסגן בנוירונים פירמידליים בשכבה חמש, גם כאשר משתמשים במקדם לא סלקטיבי.

התמרה נרחבת של נוירונים ניאוקורטיקליים של עכברים על ידי הזרקה תת-עכבישית של AAV2

למדו הזרקת חלקיקים נגיפיים ומיקרובידים פלורסנטיים למוח יילודי בעכברים. שיטה זו מאפשרת מעקב ישיר אחר התפלגות נגיפים במערכת העצבים המרכזית בשלב הזיהום החריף.

הזרקת intracerebroventricular ו intravascular של חלקיקים נגיפיים ו פלורסנט microbeads לתוך המוח בילוד

גלה סרטונים נוספים