Name: תת-סוגים של Jejuni קמפילובקטר SSP. doylei המבודד באמצעות ספקטרומטריית מסה מבוססת PhyloProteomics (MSPP) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: חקור שיטת MSPP לסיווג זני Campylobacter jejuni ssp. doylei ברמת התת-זן. שיטה זו מציעה חלופה מהירה וזולה לטיפול בזיהומים נוזוקומיאליים ומגיפות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לחנה קליינשמידט על התמיכה הטכנית המצוינת. מאמר זה מומן על ידי תוכנית התמיכה בגישה פתוחה של Deutsche Forschungsgemeinschaft וקרן הפרסום של Georg August Universität Göttingen.

<ol><li>Seng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ongoing+revolution+in+bacteriology%3A+routine+identification+of+bacteria+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).</li>
<li>Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF-MS-based+species+identification+and+typing+approaches+in+medical+mycology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology.</a> Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).</li>
<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review.</a> Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).</li>
<li>Zautner, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+multilocus+sequence+typing-based+Campylobacter+jejuni+subgroups+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> BMC Microbiol. 13, 247(2013).</li>
<li>Reil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Clostridium+difficile+PCR-ribotypes+001%2C+027+and+126%2F078+using+an+extended+MALDI-TOF+MS+system%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).</li>
<li>Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+discrimination+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhi+from+other+serovars+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> PLoS One. 7 (6), e40004(2012).</li>
<li>Wolters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+MS+fingerprinting+allows+for+discrimination+of+major+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages.</a> Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).</li>
<li>Josten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrum+of+Staphylococcus+aureus+identifies+mutations+that+allow+differentiation+of+the+main+clonal+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages.</a> J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).</li>
<li>Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+biomarker+discovery+for+identification+of+methicillin-resistant+and+vancomycin-intermediate+Staphylococcus+aureus+strains+by+MALDI-TOF%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF.</a> Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).</li>
<li>Novais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+the+discrimination+of+high-risk+Escherichia+coli+clones+from+phylogenetic+groups+B2+%28ST131%29+and+D+%28ST69%2C+ST405%2C+ST393%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393).</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).</li>
<li>Matsumura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Escherichia+coli+ST131+and+ST405+clonal+groups+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry.</a> J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).</li>
<li>Christner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry+Strain+Typing+during+a+Large+Outbreak+of+Shiga-Toxigenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli.</a> PLoS One. 9 (7), e101924(2014).</li>
<li>Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-based+PhyloProteomics+%28MSPP%29%3A+A+novel+microbial+typing+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
<li>The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/">http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/</a> (2013).</li>
<li>Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni%3A+a+brief+overview+on+pathogenicity-associated+factors+and+disease-mediating+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms.</a> Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).</li>
<li>Zautner, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+of+campylobacteriosis+and+relevant+post-infectious+sequelae%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).</li>
<li>Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni+-+The+Search+for+virulence-associated+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+Fur+Lebensmittelhygiene%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors.</a> Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).</li>
<li>Dingle, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+system+for+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni.</a> J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).</li>
<li>Dingle, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+Campylobacter+jejuni+clones%3A+a+basis+for+epidemiologic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation.</a> Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).</li>
<li>Cody, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+genomic+epidemiological+evaluation+of+human+Campylobacter+isolates+by+use+of+whole-genome+multilocus+sequence+typing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing.</a> J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).</li>
<li>Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA6%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+version+6.0%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0.</a> Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).</li>
<li>Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mlstdbNet+-+distributed+multi-locus+sequence+typing+%28MLST%29+databases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases.</a> BMC Bioinformatics. 5, 86(2004).</li>
<li>Verroken, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization-Time+of+Flight+Mass+Spectrometry+for+Identification+of+Nocardia+Species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clinl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species.</a> J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).</li>
<li>El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry+Identification+of+Mycobacteria+in+Routine+Clinical+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice.</a> PLoS ONE. 6 (9), e24720(2011).</li>
<li>Goujon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+bioinformatics+analysis+tools+framework+at+EMBL-EBI%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI.</a> Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).</li>
<li>Hall, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioEdit%3A+a+user-friendly+biological+sequence+alignment+editor+and+analysis+program+for+Windows+95%2F98%2FNT%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Symposium+Series%22%5BJournal%5D)">BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.</a> Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).</li>
<li>Jolley, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+multilocus+sequence+typing%3A+universal+characterization+of+bacteria+from+domain+to+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain.</a> Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).</li>
<li>Suarez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+proteins+as+biomarkers+for+bacterial+identification+by+mass+spectrometry+in+the+clinical+microbiology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory.</a> J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).</li>
<li>Teramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+classification+of+Pseudomonas+putida+strains+by+MALDI-MS+using+ribosomal+subunit+proteins+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers.</a> Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).</li>
<li>Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analysis+of+Rhodococcus+erythropolis+based+on+the+variation+of+ribosomal+proteins+as+observed+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-mass+spectrometry+without+using+genome+information%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information.</a> J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).</li>
<li>Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+on-target+lysis+%28YOTL%29%2C+a+procedure+for+making+auxiliary+mass+spectrum+data+sets+for+clinical+routine+identification+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts.</a> J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).</li>
<li>Stark, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+profiling+of+Bacillus+cereus+strains+and+quantitation+of+the+emetic+toxin+cereulide+by+means+of+stable+isotope+dilution+analysis+and+HEp-2+bioassay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay.</a> Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השלב הקריטי ביותר בהקמת בסכימת MSPP הוא קביעת גנטיות חד-משמעית של זהויות יון סמן ביולוגי. אם לא ניתן לזהות סמן ביולוגי ללא ספק, אז זה צריך להיות מחוץ מהתכנית 13. ג ערכת SSP jejuni. doylei כוללת 14 יוני סמן ביולוגיים שונים. אלה הם 5 פחות בהשוואה ג SSP jejuni. ערכת MSPP jejuni 13 .the ההבדל המשמעותי ביותר בין לזיהוי ג SSP jejun...

במהלך העשור האחרון, יינון desorption לייזר בסיוע מטריקס הזמן של הטיסה ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF MS) התקדמה להיות שיטה סטנדרטית מוערך מאוד על הסוג חיידקים וזיהוי מינים במיקרוביולוגיה קלינית 1, 2. זיהוי מינים מבוסס על ההקלטה של ​​טביעות אצבעות חלבון קטנות של תאים שלמים או lysates תא. הטווח ההמוני האופייני ספקטרומטר מסה בשימוש במיקרוביולוגיה השגרה הקלינית הוא 2-20 kDa. בנוסף, ספקטרה וכתוצאה מכך ניתן להשתמש להפלות זנים בבית-מינים מתחת ומתחת-תת-מין ברמה 3. המחקרים החלוציים מוקדם זיהו יונים סמן ביולוגי ספציפי עבור תת קבוצה מסוימת של זנים קמפילובקטר jejuni 4, Clostridium difficile 5, SSP enterica סלמונלה. serovar enterica typhi 6, Staphylococcus aureus 7 - 9, ו- Escherichia coli 10 - 12. השילוב של מספר המונים משתנים סמן ביולוגי המתאימים isoforms אללים מציע את האפשרות עבור תת-סוגים עמוקים. בעבר, הצלחנו ליישם שיטה להמיר וריאציות אלה פרופילים המוניים לתוך יחסי phyloproteomic משמעות לשחזור קראו ספקטרומטריית מסת phyloproteomics המבוססת (MSPP) על ג SSP jejuni. לבודד jejuni אוסף 13. MSPP יכול לשמש השווה ספקטרומטריה לטכניקות לתת-סוגים מבוססים רצף DNA כמו הקלדת רצף multilocus (MLST). מיני קמפילובקטר הם הגורם המוביל של גסטרואנטריטיס חיידקי ברחבי עולם 14, 15. כתוצאה sequela Campylobacteriosis שלאחר זיהומיות, כלומר, תסמונת גיאן-בארה, דלקת מפרקים תגובתית ומחלות מעי דלקתיות עלולות להתעורר 16. המקורות העיקריים של זיהום הםבשר בעלי חיים נגוע מן העוף, הודו, חזיר, בקר, כבשים וברווזים, מים וחלב משטח 15, 17. לכן, מחקרי מעקב קבועים אפידמיולוגיים בהקשר של בטיחות מזון נחוצים. MLST הוא &quot;תקן הזהב&quot; ב הקלדה מולקולרית עבור מיני קמפילובקטר 18. מכיוון הרצף סנגר שיטה המבוסס MLST הוא עבודה אינטנסיבית, זמן רבים יחסית יקר, הקלדת MLST מוגבלת מחזורים לבודדים קטנים יחסית. לכן, יש צורך בשיטות לתת-סוגים זולים יותר ומהירות יותר. צורך זה יכול להיות נפגשו על ידי שיטות ספקטרומטריה כמו MSPP. בעבודה זו אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הקלדת MSPP באמצעות אוסף של SSP jejuni קמפילובקטר. Doylei מבודד והשוואה של הפוטנציאל שלה עם MLST.

<table><tbody><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich , טאופקירכן, גרמניה</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Autoflex III TOF/TOF 200 system</td><td>Bruker Daltonics, ברמן, גרמניה</td><td>GT02554 G201</td><td>ספקטרומטר</td></tr><tr><td>מסה תקן בדיקת חיידקים BTS</td><td>Bruker Daltonics, ברמן, גרמניה</td><td>604537</td><td></td></tr><tr><td>BioTools 3.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, ברמן, גרמניה</td><td>263564</td><td>חבילת תוכנה</td></tr><tr><td>Bruker IVD Bakterial Test Standard</td><td>Bruker Daltonics, ברמן, גרמניה</td><td>8290190</td><td>5 צינורות</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>בלגיה תיאם איסוף מיקרואורגניזמים/המעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM/LMG גנט, בלגיה</td><td>LMG8843</td><td>ATCC 49349; IMVS 1141; NCTC 11951; זן 093</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>בלגיה תיאם אוסף מיקרואורגניזמים/המעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM/LMG גנט, בלגיה</td><td>LMG9143</td><td>Goossens Z90</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>בלגיה תיאם איסוף מיקרואורגניזמים / המעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM/LMG גנט, בלגיה</td><td>LMG7790</td><td>ATCC 49350; CCUG 18265; קספר 71; LMG 8219; NCTC 11847</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>בלגיה תיאם אוסף של מיקרואורגניזמים/המעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM/LMG גנט, בלגיה</td><td>LMG9243</td><td>Goossens N130</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>בלגיה תיאם איסוף מיקרואורגניזמים/המעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM/LMG גנט, בלגיה</td><td>LMG8871</td><td>NCTC A603/87</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>בלגיה תיאם אוסף מיקרואורגניזמים/המעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM/LMG גנט, בלגיה</td><td>LMG9255</td><td>Goossens B538</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&nbsp;</td><td>בלגיה תיאם אוסף מיקרואורגניזמים / המעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM / LMG גנט, בלגיה</td><td>LMG8870</td><td>NCTC A613/87</td></tr><tr><td>בסיס אגר קולומביה&nbsp;</td><td>Merck, דרמשטדט, גרמניה</td><td>1.10455 .0500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>מצפן עבור FlexSeries 1.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, ברמן, גרמניה</td><td>251419</td><td>חבילת תוכנה</td></tr><tr><td>דפיברין דם כבשים&nbsp;</td><td>Oxoid Deutschland GmbH , וזל, גרמניה</td><td>SR0051</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Sigma-Aldrich , טאופקירכן, גרמניה</td><td>02854 Fluka</td><td></td></tr><tr><td>formic</td><td>acid Sigma-Aldrich , טאופקירכן, גרמניה</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>HCCA matrix</td><td>Bruker Daltonics, ברמן, גרמניה</td><td>604531</td><td></td></tr><tr><td>טישו נייר Kimwipes</td><td>Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, גרמניה</td><td></td><td></td>Z188956</tr><tr><td>MALDI Biotyper 2.0</td><td>Bruker Daltonics, ברמן, גרמניה</td><td></td><td>חבילת תוכנה</td></tr><tr><td>259935 תורן בקבוקוני Cryobank</td><td>Mast Diagnostica, ריינפלד, גרמניה</td><td>CRYO/B</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 יעד פלדה מלוטשת</td><td>Bruker Daltonics, ברמן, גרמניה</td><td>224989</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen , הילדן, גרמניה</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין אנושי רקומביננטי</td><td>Sigma-Aldrich , טאופקירכן, גרמניה</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית</td><td>Sigma-Aldrich , טאופקירכן, גרמניה</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>מים, ביולוגיה מולקולרית בדרגה</td><td>Sigma-Aldrich , טאופקירכן, גרמניה</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

תת-סוגים של<em&gt; jejuni קמפילובקטר</em&gt; ssp.<em&gt; doylei</em&gt; המבודד באמצעות ספקטרומטריית מסה מבוססת phyloproteomics (mspp)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS מציעה את האפשרות להבחין כמה חיידקים לא רק ברמת המין ותתי אבל אף מתחתיו ברמת המתח. isoforms אללים של יונים סמן ביולוגי לזיהוי לגרום משמרות המונית ספציפי לבודד. phyloproteomics Mass מבוסס ספקטרומטריית (MSPP) הוא שיטה חדשנית המשלבת ההמונים סמנו הביולוגיים לזיהוי ספקטרומטריה בתכנית המאפשרת ניכוי יחסי phyloproteomic ממשמרות מסה ספציפיות לבודדות לעומת הגנום רצף זן התייחסות. רצף חומצות אמינו מוסק משמש ואז לחשב dendrograms המבוסס MSPP. כאן אנו מתארים את זרימת העבודה של MSPP ידי הקלדת SSP jejuni קמפילובקטר. Doylei אוסף מבודד של שבעה זנים. כל שבעה הזנים היו ממקור אנושי והקלדת רצף multilocus (MLST) הפגינו המגוון הגנטי שלהם. MSPP-הקלדה הביאה שבעה סוגי MSPP רצף שונים, משקף PHY שלהם מספיקיחסי logenetic. ג jejuni SSP. doylei ערכת MSPP כוללת 14 יונים סמן ביולוגיים שונים, חלבונים ריבוזומלי בעיקר בטווח ההמוני של 2 עד 11 kDa. MSPP יכול באופן עקרוני, להיות מותאם לפלטפורמות ספקטרומטריה אחרות עם טווח המוני מורחב. לכן, טכניקה זו יש פוטנציאל להיות כלי שימושי עבור הקלדה מיקרוביאלי רמת המתח.

בעבר, הקמנו בהצלחה תוכנית MSPP עבור ג SSP jejuni. jejuni 13. כאן, אנו שמטרתו להאריך את השיטה לאח תת-מין C. SSP jejuni. doylei. בשנת הגדרה ספציפית זו, שבע ג SSP jejuni. doylei מבודד נרכשו מאוסף הבלגי של מיקרואורגניזמים / מעבדה למיקרוביולוגיה UGent BCCM / LMG גנט, בלגיה. כל שבעה המבודד המשמש בניתוחים שלנו היה ממקור אנושי. זן-רצף הגנום ATCC 49349 (LMG 8843), במ...

Phyloproteomics Mass מבוסס ספקטרומטריית (MSPP) שמש להקליד אוסף של SSP jejuni קמפילובקטר. Doylei מבודד ברמת הזן בהשוואת הקלדת רצף multilocus (MLST).

תת-סוגים של<em&gt; Jejuni קמפילובקטר</em&gt; SSP.<em&gt; doylei</em&gt; המבודד באמצעות ספקטרומטריית מסה מבוססת PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

המטרה הכללית של הליך ספקטרומטריית המסה זה, הנקרא MSPP או PhyloProteomics מבוסס ספקטרומטריית מסה, היא לבצע סיווג של חיידקים ברמת הזן. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחומי המיקרוביולוגיה, האפידמיולוגיה וההיגיינה. לדוגמה, ניתן להשתמש בה לניתוח מצבי התפרצות על ידי ויזואליזציה של קרבה פילו-פרוטאומיקה.בהשוואה לשיטות טיפוס אחרות, MSPP היא זולה לדוגמה בודדת ומהירה מאוד. זיהומים נרכשים בבתי חולים הם סוגיה בעלת חשיבות גוברת, ואנו מקווים שניתן יהיה להרחיב את תכנית ה-MSPP שלנו לטיפוס אפידמיולוגי של חיידקים אחרים, או אפילו פטריות. תכנית ה-MSPP שלנו מספקת תובנות לגבי קרבת השבטים, ולכן לצורך חיזוי של פנוטיפים רלוונטיים, כגון עמידות לתרופות או אפילו וירולנציה, יש היגיון ביישומה במקרים שבהם פנוטיפים אלו נמצאים במתאם עם גנוטיפים ספציפיים.כדי להתחיל בהליך זה, הכינו שתי מבחנות של תמיסת מטריצה על ידי המסה של 2.5 milligrams של HCCA ב-250 microliters של תערובת ממסים אורגניים, הכוללת 50% isonitrile. הוסיפו אינסולין אנושי רקומביננטי ככיול פנימי לאחת מהן, ולאחר מכן 47.5% double distilled water ו-2.5% trifluoroacetic acid. לאחר מכן, מרחו כמות קטנה (בגודל ראש סיכה) של מושבה מזן הייחוס, ישירות על לוחית מטרה של maldi.לקביעת המסה המדויקת של פיס calibration, יש להניח מיקרוליטר אחד של סטנדרט בדיקה בנקודה נפרדת. יש לכסות כל נקודה של חיידקים ושל סטנדרט ב-1 מיקרוליטר של תמיסת matrix עם תוספת של HCCA ולהשאירם להתגבש בטמפרטורת החדר. עבור כל זן המיועד לניתוח, יש לחזור על הכנת המריחה.כסו כל נקודה ב-1 µL של תמיסת מטריקס HCCA מועשרת והניחו לה להתגבש בטמפרטורת החדר. לחלופין, ניתן להפיק חלבונים מתאים שקשה להשכיב. לשם כך, אספו כ-5 מושבות מתרבית על צלחת אגר באמצעות לולאת הזרקה.השעה אותן ב-300 µL של מים מזוקקים פעמיים בתוך מבחנה לתגובה בנפח 1.5 mL, וערבב היטב באמצעות פיפוט חוזר עד שהמושבות החיידקיות מושעות לחלוטין. לאחר מכן, הוסף 900 µL של אתנול מוחלט וערבב. סבב את הדגימה בצנטריפוגה ב-13,000 g למשך דקה אחת.לאחר ייבוש המשקע, השביתו אותו מחדש באמצעות פיפטינג (שאיבה והזרקה) ב-50 µL של 70% חומצה פורמית. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של אצטוניטריל וערבבו. הסירו את השאריות באמצעות סבוב בצנטריפוגה ב-13,000 g למשך 2 דקות.בסיום, העבר 1 µL מהסופרנאטנט למיקום דגימה על לוח מטרת MALDI. לאחר ייבוש הדגימה, כסה כל נקודה ב-1 µL של תמיסת מטריצת HCCA והשאר להתגבש בטמפרטורת החדר. בשלב זה, בצע אנליזת MALDI-TOF על ידי איסוף של 600 ספקטרומים בצעדים של 100 שוטים (shots) עבור כל נקודה.ראשית, לחצו על לשונית ה-auto execute בתוכנת ההגדרה של ספקטרומטר המסה. פתחו את השיטה על ידי לחיצה שמאלית על כפתור ה-method ובחירת השיטה מהתפריט הנפתח. לאחר מכן, לחצו לחיצה שמאלית על כפתור ה-edit כדי לפתוח את עורך שיטת ה-auto execute.בלשונית ה-accumulation, הגדירו את ערך ה-satisfactory shot ל-100 ואת ערך ה-sum up ל-600. עבור כל ספקטרום, בחרו את שיא הכיול (calibrant peak) מהרשימה, לחצו על 'automatic assign' ולאחר מכן על 'OK'. לאחר קבלת ספקטרומי מס מכל נקודה, קבעו באופן ניסיוני את המסה המדויקת של שיא הכיול, על ידי פתיחת ספקטרום באמצעות דפדפן הספקטרומים (spectrum browser) ואיתור השיא במסה הצפויה בהשוואה לספקטרום ללא חומר כיול. ודאו ששיא הכיול אינו מוסתר על ידי סמן ביולוגי (biomarker) אחר של האורגניזם הנחקר.מנתוני רצף הגנום של זן הייחוס, חשבו את המשקל המולקולרי המוניאיזוטופי התאורטי של כל אחד מהחלבונים המקודדים, על ידי תרגום רצף ה-DNA לרצף חומצות האמינו המתאים. העלו את הקובץ או העתיקו והדביקו את רצף החלבון הזה לתיבת הקלט של פאנל משאב הביואינפורמטיקה המתאים, וחשבו את נקודת האיזואלקטרית התאורטית ואת המשקל המולקולרי. העתיקו את התוצאות לגיליון אלקטרוני עם עמודה אחת המכילה את מזהה הגן ועמודה נוספת המכילה את המשקל המולקולרי.מיינו את השורות לפי המשקל המולקולרי המחושב, כדי להקל על חיפוש המסות. הכניסו עמודה נוספת לגיליון הנתונים עבור המשקל המולקולרי של הצורה ה-demathianinated, על ידי הפחתת 135 dautons מהמשקל המולקולרי המונו-איזוטופי. שייכו כל מסה של ביומרקר מרכזי שנמדדה למסות המחושבות מזן הייחוס, על ידי חיפוש המסה הנמדדת בטבלת הגנום.בגיליון אלקטרוני אחר, רשמו את המסה והמזהה עבור כל יון סמן ביולוגי. כעת, בצעו כיול לספקטרומי המסה שהתקבלו מהבידודים שנאספו, כפי שבוצע עבור זן הייחוס. עבור בידוד אחד לכל שורה, זהו סמנים ביולוגים וריאנטיים בספקטרומי המסה, ורשמו בעמודות המתאימות את המסה שנמדדה עבור כל סמן ביולוגי ואת האיזופורמה החזויה.ספקטרום המסות ב-MALDI-TOF של C-Jejuni Subspecies doylei ATCC 49349 מכיל 14 יוני סממן (biomarker ions) בעלי מטען יחיד שניתן לזהותם על ידי השוואת המסות המולקולריות המחושבות לספקטרום הייחוס. בתוך האוסף, זוהו איזו-צורות שונות עבור L32 ללא methionine, L33, והחלבון ההיפותטי המקודד על ידי gil152939117, S20 M, ו-S15 M. המסות הנותרות שהוקצו ליוני הסממן היו עקביות באיזולטים שנבדקו. החלפת חומצת האמינו המתאימה להסטת המסה זוהתה באמצעות הגברה ב-PCR וריצוף סנגר (Sanger sequencing) של הגן הספציפי תוך שימוש בפריימרים המפורטים כאן.רצפי החומצות האמינו של כל יוני הסמנים הביולוגיים הכלולים בסכימת ה-MSPP, כמו גם האיזופורמות האלליות שזוהו, מצוינים כאן. הדנדרוגרמה מסוג UPGMA המבוססת על MLST, שנבנתה מבידודים של תת-המין C jejuni subspecies doylei שנבחנו, מראה שכל בידוד שייך לסוג רצף MLST שונה. ולזן LMG7790 יש את המרחק הפילוגנטי הארוך ביותר.כפי שנראה בניתוח ה-MLST, לאיזולט LMG7790 יש את המרחק הפילופרוטאומי הארוך ביותר בניתוח ה-MSPP של איזולטי C jejuni subspecies doylei שנבדקו. ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצעה בתוך יום אחד אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור את הרעילות של חלק מהחומרים המשמשים במהלך הניסוי.לדוגמה, אצטוניטריל עלול לגרום לגירוי בעור. בנוסף ל-MSPP, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף DNA כדי לנתח פרמטרים נוספים, כגון נוכחות של גנים העומדים לעמידות. פיתוח טכניקה זו סולל את הדרך עבור חוקרים בתחום המיקרוביולוגיה לחקור פוטוגניה.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הפעולה של MSPP וכיצד ניתן ליישמו לשאלות ספציפיות. זכרו כי עבודה עם פתוגנים מסוכנים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון ציוד מעבדה ברמת S2.

subtyping-campylobacter-jejuni-ssp-doylei-isolates-using-mass

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

תרכובות לכידת הם מולקולות קטנות trifunctional כדי להפחית את המורכבות של proteome על ידי תפקודית אינטראקציה הפיך מולקולות חלבון קטן ואחריו crosslinking-צילום טיהור. כאן אנו משתמשים מתחם לכידת...

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח...

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

למרות שהתרבות הצואה של קמוליבקטר אינה מדויקת, היא עדיין נחשבת לסטנדרט הזהב לזיהוי. שיטות לקביעת מגבלת האיתור וההישרדות באמצעי התחבורה של ג. jejuni בצואה אנושית מתוארים ומושווים עם שיטת החיסונית חדשה עם דיוק טוב יותר.

שיטות התרבות כדי לקבוע את הגבלת הגילוי וההישרדות במדיית התחבורה של קמפילובקטר Jejuni האדם בצואה

ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי נרחב המווסת מסלולים ביולוגיים מרובים. ספקטרומטריית מסות היא הטכנולוגיה הטובה ביותר ליצירת פרופיל עולמי של R-מתיל-פרוטאום, כאשר היא משולבת לגישות ביוכימיות להעשרת פפטידים מותאמים. תהליך העבודה המיועד לזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה גלובלית של R בתאים אנושיים מתואר כאן.

גישה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לניתוח R-מתילציה של חלבונים גלובליים ובביטחון גבוה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מהיר של חלבונים המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים ברצף גנומי באמצעות ספקטרומטריית מסה יחד MALDI-TOF-TOF וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה עם תוכנה שפותחה בתוך הבית. שבר יונים חלבון Metastable בגלל אפקט חומצה אספרטית וספציפיות זו מנוצל לזיהוי חלבון.

זיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים ב- Escherichia coli באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה

ההיתכנות של אסטרטגיות ריצוף גנום שלם (WGS) באמצעות מכשירי benchtop פישטה את חקירת הגנום של כל מיקרוב בעל רלוונטיות לבריאות הציבור בסביבה מעבדתית. מתוארת התאמה מתודולוגית של זרימת העבודה עבור WGS חיידקי ומוצג גם צינור ביואינפורמטיקה לניתוח.

אפיון זן Escherichia coli פתוגני שמקורו באוראוכרומיס spp. חוות המשתמשות בריצוף גנום שלם

קמפילובקטר הוא הגורם המוביל לדלקת גסטרואנטריטיס חיידקית המועברת במזון ברחבי העולם. למרות שמפעלים נוקטים צעדים להפחתת השכיחות בכל המתקנים שלהם, מוצרים מזוהמים מגיעים באופן עקבי לצרכנים. הטכניקה שפותחה בשתים עשרה השנים האחרונות נותנת מענה למגבלות של השיטות הקיימות לבידוד וגילוי קמפילובקטר spp. מבשר נא.

איתור ובידוד של קמפילובקטר spp. מבשר נא

פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהירה וחסכונית של הרכב החיידקים במוצרי חלב על ידי שילוב קולטורומיקה עם MALDI-TOF MS. הוא מספק תוצאות טקסונומיה דומות לריצוף 16S rRNA עם זמן אספקה קצר יותר משיטות תרבית מסורתיות.

הערכת בטיחות מיקרוביאלית של מחלבות באמצעות פרופיל פרוטאומי חיידקי באמצעות גישת MALDI

חקור שיטת MSPP לסיווג זני Campylobacter jejuni ssp. doylei ברמת התת-זן. שיטה זו מציעה חלופה מהירה וזולה לטיפול בזיהומים נוזוקומיאליים ומגיפות.

תת-סוגים של

גלה סרטונים נוספים