דור של כבד עכבר אנושי באמצעות תאי גזע אנושי כבדיה

המטרה הכללית של הליך השתלת תאי הגזע הכירורגי זה היא ליצור מודל עכבר כימרי חדש בעל תפקוד כבד אנושי, באמצעות תאי אב של תאי גזע כבדיים אנושיים לא בשלים, המאפשרים פרוליפרציה, הבשלה ודיפרנציאציה לצורך רכישת מטבוליזם של תרופות. שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה ליצירת מיקרו-סביבה התומכת בפרוגנזה של תאי גזע כבדיים של תורם אנושי, כדי להתרבות, להבדיל ולשקם את כבד העכבר המקבל הפגוע. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בתאים שהבשילו והתרבו, ושהכבד מאוכלס מחדש כמעט לחלוטין.

لتחילת, הכינו תמיסת מלאי של רעלים של דיפתריה (DT) בריכוז של 1 mg/mL על ידי הוספת 1 mL של תמיסת sodium chloride 0.85% עם פנול ל-1 mg של DT. בצעו הזרקה תוך-peritoneal של DT על ידי החזקת עכבר albtrek scid בשכיבה גבית, והחדירו את המחט בזווית של 45 מעלות לגוף, מתחת לכיפוף הברכיים משמאל או מימין לקו האמצע. באמצעות מזרק אינסולין, ההקיזו 100 µL של DT בריכוז 0.3 µg/mL שהוכן טרי, עבור כל עכבר במשקל 20 g. 48 שעות לאחר הזרקת ה-DT, הניחו את העכבר במכשיר קיבוע וחממו את הזנב באמבט מים של 30 °C למשך כ-10 דקות כדי להרחיב את כלי הדם.

לאחר מכן, במרחק של שני סנטימטרים מקצה הזנב, השתמשו בלהב סקלפל חד כדי לבצע חריץ של מילימטר אחד בזנב, והשתמשו בצינור קפילרי לאיסוף הדם. סובבו בצנטריפוגה את הצינור המיקרוקפילרי המכיל את הדם ב-1500 ×g למשך חמש דקות, ואספו את הסרום על ידי הפרדת הנוזל העליון (supernatant) ממשקע התאים. טפטפו באמצעות פיפטה 50 µL של מהיל 1:20 של הסרום על שקופיות GOT ASTP3.

לאחר מכן, באמצעות מנתח כימיה יבשה אוטומטי רב-תכליתי בהתאם לפרוטוקול היצרן, מדדו את הבליעה של תוצר התגובה ב-650 nanometers. באמצעות מיין תאים, בודדו תאי גזע כבדיים אנושיים מתאי כבד עובריים ראשוניים אנושיים בעלי אנטיגנים תאיים CDCP1, CD90 ו-CD66 כדי לקבל תת-אוכלוסייה חיובית ל-CDCP1, חיובית ל-CD90 ושלילית ל-CD66. זרעו את התאים על צלחות תרבית מצופות collagen four והדגירו ב-37 degrees Celsius.

כאשר התאים מגיעים ל-80% עד 90% confluence, יש לשטוף את התאים פעם אחת באמצעות PBS. לאחר מכן, יש להוסיף 0.05% Trypsin EDTA ולהדגיר בטמפרטורת החדר. כאשר נראה כי התאים צפים או נעים בחופשיות תחת מיקרוסקופ, יש לעצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת שמונה מיליליטר של DMF12 המכיל 10% FBS.

באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, השעו באיטיות את התאים לפני העברתם למבחנה קונית של 15 מיליליטר. סובבו את התאים בצנטריפוגה ב-100 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. באמצעות 10 מיליליטר של DMF12 עם 10% FBS, השעו בזהירות את משקע התאים והשתמשו במכשיר לספירת תאים כדי לקבוע את מספר התאים.

חלק את התאים לאליקוטים של 1x10⁶ תאים ל-50 µL של PBS עבור כל עכבר, ואחסן על קרח עד להשתלה. לאחר הרדמת העכבר בהתאם לפרוטוקול הכתוב, בדוק את הרפלקס על ידי צביטה קלה של כרית כף הרגל האחורית. לאחר מכן, מרח משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע התייבשות.

בעזרת מכסחת חשמלית, גלחו את אזור הניתוח ומרחו 70% ethanol ו-povidone-iodine לחיטוי. בצעו חתך עור באורך של סנטימטר אחד בצד שמאל של הבטן, ממש מתחת לשולי הצלעות. לאחר מכן, בצעו חתך בדופן הבטן השמאלית ולאחריו חתך בפריטונאום.

בשלב הבא, חשפו בזהירות את הטחול. לאחר מכן, בזווית של חמש מעלות, הכניסו מזרק למיקרו-הזרקה של 100 µL עם מחט בכיול 32 באורך half inch לעומק השווה למחצית מעובי הטחול, והזריקו ישירות מקצה אחד של האיבר לשניו 1×10⁶ תאי גזע כבדיים אנושיים ב-50 µL של PBS לתוך האיבר, והוציאו את המחט. כדי למנוע דליפה של התאים לאחר ההזרקה, הפעילו לחץ עדין בעזרת אצבע למשך שתי דקות.

החזירו את הטחול לגוף העכבר והשתמשו בתפר רץ רגיל לסגירת השרירים והעור כדי לסגור את החלל. העבירו מיד את העכבר, כשהוא שוכב על צדו, לכלוב שחומם מראש ל-37 degree Celsius. הימנעו ממגע בין מצע הכלוב לאתר הניתוח ועקבו אחר בעל החיים בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

ארבע עד שש שבועות לאחר הש transplantation, לאחר קטילת העכבר בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמש במספריים כירורגיים כדי לפתוח את חלל הבטן על ידי חיתוך סימולטני של העור והפציה. השתמש במספריים כמרחיב (spreader), ובצע דיסקציה של רקמת החיבור שמעל הפריטונאום לאורך ה-linea alba כדי לפתוח את חלל הפריטונאום. בעזרת פינצטה, הרם את עצם הגב (sternum).

לאחר מכן, נקב את הסרעפת וחתו דרך כל צד של עצם החזה כלפי מעלה עד לחגורת הצוואר. נתקו את הווריד הנבוב (vena cava) בצדו התורס של הכבד ומשכו את הוושט דרך הכבד בכיוון קדמי. הסירו את הסרעפת ולאחר מכן, תוך שימוש בה כידית, התחילו למשוך את הכבד אל מחוץ לחלל הבטן.

הוריד הנבוב (inferior vena cava) יחזיק את הכבד במקומו. לכן, חתכו את הוריד הנבוב תוך הקפדה שלא לשחרר בטרם עת את בלוטת האדרנל הימנית. הפרידו את אונוי הכבד זה מזה בנקודות החיבור והטמיעו אותם ב-OCT בהתאם לפרוטוקול היצרן.

הקפיאו את ה-OCT המכיל את רקמת הכבד בתוך רשתות המתכת בקריוסטט. באמצעות הקריוסטט, חתכו דגימות בעובי של 5 µm בטמפרטורה של 18°C- והניחו אותן על זכוכיות מיקרוסקופ בטמפרטורת החדר. אחסנו את המלאי בטמפרטורה של 80°C-.

לבסוף, הכינו את השקופיות לצביעת H&E בהתאם לנהלים שדווחו בעבר, ובצעו ELISA בהתאם לפרוטוקול הכתוב. כפי שניתן לראות בחתכים אלו שנצבעו ב-H&E, עכברים שטופלו ב-DT הראו ארכיטקטורה כבדית לא מאורגנת וסימני גודש, יחד עם עלייה בפעילות AST בסרום. שישה שבועות לאחר השתלה, תאים שנגזרו מתאי גזע כבדיים אנושיים שיחזרו את מבנה הכבד על ידי החלפת ההפטוציטים של העכבר.

בבחינה מאקרוסקופית, ארבעה ימים לאחר השתלה, זוהו מקבצים כבדיים אנושיים קטנים שהיו מפוזרים באופן אחיד ברחבי הכבד. ביום ה-45, המקבצים התרבו למקבצים גדולים. כפי שניתן לראות כאן, נוכחותם של הפטוציטים אנושיים בכבדי עכברים אוששה לראשונה שש שבועות לאחר השתלה באמצעות צביעה עם נוגדנים לגרעינים אנושיים ולcytokeratin 8/18.

הפטוציטים אנושיים חיוביים ל-ALB ושליליים ל-CK19 דמו להפטוציטים תפקודיים, בעוד שתאים שהראו צביעה כפולה חיובית ל-ALB ו-CK19 אנושיים הפגינו יכולת בי-פוטנציאלית לגביהה להפטוציטים ותאי מוליך מרה (cholangiocytes). נצפו מספר צבירים עגולים המקיפים את אונויות הכבד עם גרעינים אנושיים ברורים וביטוי של CK8/18, מה שמעיד על היכולת של תאי גזע כבדיים אנושיים ליצור מושבות בכבדים האנושאיים (humanized livers). לבסוף, רמת האוכלוסין החוזרת (repopulation) הגיעה עד ל-90% חודש אחד לאחר השתלה, והפרשת Albumin אנושי זוהתה בכבדי העכברים שעברו repopulation.

ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצע השתלה כירורגית של תאים תוך 10 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי יש להגביל את הפגיעה בכבד לכבד התומך בלבד. במקרה של דליפת תאים, יש למנוע את השתלת התאים.

בשילוב עם הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון טרנספקציית גנים לתכנות מחדש ישיר in vitro בתאים אנושיים, כדי לבחון התכנסות של תאים אנושיים עם המודל הנוכחי שלנו. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום ההפטולוגיה לבחון מטבוליזם של תרופות בבני אדם, אינטראקציה בין תרופות, רעילות כבדית ונגיפי הפטיטיס במודל כבד אנושי (humanized liver model). לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של אופן בידוד והרחבת תאי גזע כבדיים, השראת פגיעה בכבד, והשתלת תא דרך הטחול ליצירת מודל עכבר כימרי בעל תפקוד כבד אנושי.

אל תשכחו שניתן לשלוט ברעלן הדיפתריה וכי הוא חשוב, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון מניעת נמק של הלב והכבד, בעת ביצוע הליך זה.