הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae

המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור עוברי דג זברה פרביוטיים, שיכולים לשמש לחקר תפקודים פנימיים של תאים לעומת פונקציות חיצוניות של תאים עבור גנים מועמדים מעניינים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח של אוטונומיה של תאים. לדוגמה, במערכת ההמטופואטית, פגמים חיוניים בנדידת HSC הם מהותיים ל-HSCs או למיקרו-סביבת הנישה.

היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא יכולת משופרת לייצר בהצלחה עוברי דג זברה פרביוטיים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, מכיוון שהעוברים המתפתחים הם שבירים ביותר, וניזוקים בקלות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי התפירה הכירורגיים יכולים להיות קשים ללימוד מכיוון שהם דורשים רמה גבוהה של דיוק ודיוק.

כאן אנו מספקים הוראות שלב אחר שלב ליצירת עוברי דג זברה פרביוטיים על ידי איחוי כירורגי של בלסטולות מתפתחות. שיטה זו מדגימה כיצד להגביר את היעילות של איחויים פרביוטיים ולשפר את ההישרדות של עוברים מחוברים. לאחר הכנת ריאגנטים וכלים על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו שתיים עד שלוש פיפטות פסטר מותאמות על ידי חימום קצר של קצה הפיפטה מעל מבער בונסן .

לאחר מכן, בעזרת מלקחיים גדולים, כשהוא עדיין חם, כופפו את קצה הפיפטה כ- 45 מעלות. כדי להבטיח שאין קצוות חדים שעלולים לפגוע בעוברים, שמור את קצה הפיפטה מעל מבער בונסן למשך שנייה עד שתיים. באמצעות DNA פלזמה, mRNA או מורפולינו, הזרקת מיקרו של עוברים תוך שעה אחת מרגע האיסוף, ומאפשרת להם להתפתח לשלב 256 התאים.

כאשר העוברים מתקרבים לשלב 256 התאים, העבירו כל רקע גנטי לכלים מצופים אגרוז נפרדים, כוסות זכוכית ללא שריטות או צלחות פטרי. לאחר פירוק העוברים על פי פרוטוקול הטקסט, יש להפשיר מתיל צלולוז שהוכן בעבר, ולהשתמש בצנטריפוגה שולחנית במהירות מקסימלית כדי לגלול גבישים לא מומסים, מה שיפגע בעוברים או יקרע את החלמונים. בינתיים, בעזרת טוש, סמנו 12 עד 15 נקודות שנקבעו מראש בצד התחתון של צלחת פטרי מצופה אגרוז של 100 מיליליטר.

לאחר מכן, לאחר צנטריפוגה, באמצעות החלק העליון השקוף של המתיל צלולוז, העבירו טיפה של 1 עד 1.5 סנטימטר לנקודות המסומנות בצלחת הפטרי. לאחר מכן, הכינו מנה אחת של 40 מיליליטר של רינגר עשיר בסידן, או תמיסת HCR לכל מנה מצופה אגרוז שהוכנה זה עתה. לכל מנה יש להוסיף אנטיביוטיקה כמפורט כאן.

כאשר מוכנים לבצע איחוי בלסטולה, השתמשו במינונים של HCR עם אנטיביוטיקה כדי למלא בזהירות כל צלחת המכילה את טיפות המתיל צלולוז, תוך הקפדה לא לשבש את הטיפות. חבר פיפטת פסטר מזכוכית שונה שהוכנה קודם לכן למשאבת פיפטה של 10 מיליליטר. לאחר מכן, תחת סטריאוסקופ, אספו עובר אחד מפורק מכל רקע.

לפני הוצאת שני העוברים, השתמש בפיפטה של פסטר כדי ליצור שקע קטן באמצע טיפת המתיל צלולוז. לאחר מכן, הפקידו את שני העוברים בשקע. כעת, באמצעות מחט מתגרה עם קצה טעינת ג'ל בקצה, השתמש בתנועות גורפות עדינות מבלי לגעת ישירות בעוברים כדי למקם מחדש בזהירות את העוברים בתוך המתיל צלולוז, כך שקוטבי החיות שלהם נוגעים ישירות זה בזה.

כיוון נכון של העוברים המתפתחים מכתיב כיצד העוברים יתמזגו ויתפתחו. עבור היתוך ראש בראש, ודא שכל היתוך מיושר בקטבים של בעלי החיים שלהם. הניחו לעוברים לשבת במשך חמש דקות עד שהמתילצלולוז יתיישב סביבם.

במהלך תקופה זו, טען את הזוג הבא לטיפה נוספת. כדי לבצע את הניתוח, באמצעות כלי מחט הזכוכית, פצעו בזהירות כל עובר בנקודת המגע שלו. לאחר מכן, בתנועת תפירה עדינה, משוך את התאים מהעובר הראשון לעובר השני ובחזרה.

בסוף התנועה, החזק את המחט במקומה למשך שתיים-שלוש שניות לפני שתמשוך אותה לאט מאוד. דיוק עם מחט הזכוכית הוא קריטי כדי להבטיח שהעוברים נתפרים כראוי. יש להקפיד שלא לפגוע בשקי החלמון תוך שמירה על חיבור מספיק לאיחוי מוצלח.

הניחו לעוברים לשבת במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, תפר זוגות עוברים נוספים. לאחר הדגירה, העריכו אם העוברים נשארו מחוברים, וחזרו על שלב הפציעה במידת הצורך.

דגרו את העוברים באותה צלחת ומדיום בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס למשך הלילה. עד למחרת בבוקר, העוברים יצאו מהמתיל צלולוז המומס ברובו. הסר את כל העוברים שלא התמזגו בהצלחה.

לאחר מכן, שפכו את המדיום והשתמשו ב-25 מיליליטר של E3 כדי להחליף אותו. כדי לרכוש תמונות של העוברים הממוזגים, הכינו 0.8% נקודת התכה נמוכה. בעודו חם, יש להכניס 1 מיליליטר מהאגרוז לצינורות מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר המוגדרים בבלוק חימום של 37 מעלות צלזיוס.

להרדים את העוברים הפרביוטיים על ידי הוספת מיליליטר אחד של ארבעה מיליגרם למיליליטר pH 7.0 טריקאין ל-25 מיליליטר של מדיום E3 המכיל את העוברים. סובבו בעדינות את המנה כך שהעוברים יתאגדו באמצע. לאחר מכן, בעזרת פיפטת העברה מפלסטיק רחבה, שאב את העוברים בכמה שפחות נוזלים.

לאחר מכן, סובב את הפיפטה זקוף והקפיץ בעדינות את העוברים כך שהם ישקעו בתחתית הפיפטה. לאחר מכן, העבירו את העוברים לאליקוט של 1 מיליליטר של נקודת התכה נמוכה על ידי נגיעה קלה בקצה הפיפטה על פני האגרוז. השלך את כל הנוזלים העודפים מהפיפטה, והשתמש בפיפטה כדי לערבב בעדינות את העוברים באגרוז.

לאחר מכן, בעזרת הפיפטה, העבירו את האגרוז והעוברים לבאר של צלחת זכוכית עם שש בארות. תחת סטריאומיקרוסקופ, השתמש בקצה טעינת ג'ל המודבק לקצה מחט מתגרה כדי למקם את העוברים קרוב לזכוכית הכיסוי ובכיוון הרצוי להדמיה. לאחר שהאגרוז התייצב, ומדיום עם טריקאין נוסף לבארות, השתמש בלייזר אפיפלואורסצנטי הפוך, סריקת לייזר קונפוקלית, או מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב כדי להשיג תמונות.

עבור שדה ראייה של עובר שלם, השתמש במטרה פי 4. השתמש במטרה של פי 20 כדי לדמות רקמה ספציפית. עבד את התמונות על פי פרוטוקול הטקסט.

כפי שמוצג כאן, לאחר כיווון שתי בלסטולות כשמוטות החיות שלהן פונים זה לזה, העוברים נפצעו בזהירות בנקודת המגע שלהם. דרגה גבוהה יותר של פציעה הגדילה את הסבירות שהעוברים ישמרו על קשר שהביא לאיחוי מוצלח ללא פגמים מורפולוגיים נוספים או עיכוב בהתפתחות. כפי שמודגם באיור זה, על ידי כיוון שתי הבלסטולה עם מוטות בעלי החיים שלהן מיושרים ישירות, נוצרו היתוך אמין של שק לחלמון ראש בראש או חלמון עם מחזור משותף.

ברוב המקרים, לעוברים היו שני לבבות ששאבו מחזור דם משותף. כדי לאשר שהעוברים אכן חלקו את מחזור הדם שלהם, עוברים טרנסגניים מאוחים עם אריתרוציטים חיוביים ל-GFP התמזגו לעוברים בעלי תאי אנדותל כלי דם חיוביים ל-mCherry. כפי שניתן לראות בסרטון זה, עד 48 שעות לאחר ההפריה, אריתרוציטים חיוביים ל-GFP נצפו מסתובבים דרך העובר השותף של Flik 1 HRAS mCherry .

לבסוף, כדי לחקור בקרה זמנית על ביטוי גנים, הוזרק לאחד משני העוברים מבנה DNA hsp70 EGFP. לאחר הלם חום קצר של 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, נוצר אות GFP ברור באחד העוברים, ובמקרים מסוימים, תאים חיוביים ל-GFP נראו מסתובבים בעובר השותף שלא הוזרק. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיזהר בעת תפירת שתי הבלסולות יחד, ולחזור על איחוי אם הניתוח לא הצליח בניסיון הראשון. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות נוספות כמו הדמיית תאים חיים כדי לענות על שאלות נוספות, כמו האם HSCs מסוג בר יכולים לתפקד כרגיל בנישה מוטנטית או להיפך, האם HSCs מוטנטיים יכולים לתפקד בנישה מסוג בר. טכניקה זו מספקת שיטה רבת עוצמה לחוקרים בתחום ההמטולוגיה לחקור את ויסות התפתחות הדם בדג הזברה.

אל תשכח שטריקינס יכול להיות מסוכן ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת לבוש בטיחותי מתאים בעת ביצוע הליך זה. לאחר צפייה בסרטון זה וביצוע הטכניקות המומלצות שלנו, אנו מקווים שתוכל לייצר עוברי דג זברה ביוטיים טובים יותר בהצלחה רבה יותר.