דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

המטרה הכוללת היא הליך זה הוא ליצור ולהבחין בין מקרופאגים דמויי מכתשית לתאים דנדריטיים בתרביות תאי מח עצם של עכברים במבחנה בתוספת GM-CSF. שיטת מבחנה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לתפקודם של תאים דנדריטיים או מקרופאגים. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שהיא יכולה לייצר מספר תאים מספיק והיא יכולה להבחין בין תאים דנדריטיים למקרופאגים דמויי מכתשית.

ההשלכות של טכניקה זו עשויות להתרחב לטיפול בפרוטאינוזיס ריאתי מכיוון שהיא מקלה על רכישת מקרופאגים דמויי מכתשית, שניתן להשתמש בהם לטיפול במחלה זו. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יצטרכו תרגול בבידוד העצמות הנקיות ושטיפת מח העצם. הדגמה חזותית של שיטה זו שימושית מכיוון שלא כל הטכניקות המשמשות להבנה בקלות על ידי הוראה כתובה בלבד.

15 דקות לפני תחילת החיתוך, הפעל ארון בטיחות ביולוגי כדי לטהר את אוויר הארון, ולייצב את זרימת האוויר, ונקה את משטח הארון עם 70% אתנול. כשהארון מוכן, הניחו עכבר על גבי מגבת נייר אחת עד שתיים במצב נוטה ורססו את החיה באתנול 70%. לאחר מכן, ביד הלא דומיננטית, הרם את העור סביב אזור בית החזה והשתמש במספריים כדי לבצע חתך.

אוחזים בשני קצוות החתך, מושכים בזהירות עד ששני קצוות החתך נפגשים בבטן. לאחר מכן הנח את העכבר במצב שכיבה והשתמש ביד אחת כדי למשוך את החצי התחתון של העור כלפי מטה עד שהרגליים חשופות. החזק את כף הרגל, חתוך את גידי אכילס מעל מפרק הקרסול ואת הרצועות המחברות את השרירים לכף הרגל בקצה התחתון של השוקה כדי לשחרר את כף הרגל מעצמות הרגליים.

תוך שמירה על הרגל מורמת, הסר את השרירים והרצועות סביב מפרק הברך בקצה התחתון של עצם הירך כדי להחמיר את שרירי הירך מהרגל התחתונה. בעזרת מלקחיים, משוך בעדינות את השרירים המשוחררים הרחק מהמשטחים הסיביים והירך. לאחר מכן לחץ על המספריים במצב פתוח במפרק הירך, סובב את הרגל ומשוך בעדינות את עצם הירך כדי להפריד את עצם הרגל ממפרק הירך תוך חיתוך הרגל מהגוף.

כעת החזק את הרגל בקצה הירך עם מלקחיים סטריליים, השתמש במלקחיים אחרים כדי להסיר את כף הרגל מקצה הקרסול. לאחר מכן החזק את הקצה הדיסטלי של עצם הירך בעזרת מלקחיים אחד ואת הקצה הפרוקסימלי של השוקה והפיבולה עם אחר, כופף בזהירות את השוקה והפיבולה בכיוון ההפוך של מפרק הברך כדי להפריד את הרגל התחתונה מעצם הירך והפיקה. השתמש במלקחיים כדי להסיר את הרצועות, השרירים והפיבולה הנותרים מעצמות הרגל התחתונה והנח את השוקה הנקייה על מכסה צלחת פטרי הפוך, המכיל מיליליטר אחד עד שניים של HBSS/FCS.

החזק את הקצה התחתון של עצם הירך עם סט אחד של מלקחיים ואת הפיקה עם אחר, כופף את הברך והרקמות שמסביב בכיוון ההפוך כדי להסיר את המפרק. לאחר מכן הסר את כל רקמות החיבור שנותרו מעצם הירך והנח את העצם על מכסה צלחת הפטרי ההפוך. לאחר שכל העצמות נקצרו, השתמשו במלקחיים כדי לנקות את כל הרקמה שנותרה מחוברת לעצמות ולטבול את העצמות ב-10 מיליליטר של HBSS/FCS בבסיס צלחת הפטרי.

שומרים על המנה מוגנת חלקית עם מכסה סטרילי, חותכים כל אחת מהעצמות הנקיות לשניים בעזרת מספריים. לאחר מכן השתמש במזרק של מיליליטר אחד, המצויד במחט בגודל 26.5 כדי לשטוף מיליליטר אחד של HBSS/FCS מהצלחת לקצה כל חתיכת עצם עד שכל המח האדום ישוחרר. העבירו את כל גושי מח העצם הגלויים דרך המזרק מספר פעמים ליצירת תרחיף תא בודד, ולאחר מכן ערבוב יסודי עם פיפטה של 10 מיליליטר.

העבירו את התאים לצינור איסוף ושטפו את צלחת הפטרי פעם אחת עם חמישה מיליליטר של HBSS/FCS כדי לאסוף את כל התאים הנותרים. לאחר מכן אסוף את הכביסה בצינור האיסוף והניח את התאים על קרח. כדי להקים תרבית תאי מח עצם, יש לצנטריפוגה את התאים שנאספו ולשאוף את הסופרנטנט עם פיפטת פסטר סטרילית מזכוכית המחוברת ליניקת ואקום.

שחרר את הכדור העשיר בתאי הדם האדומים בעזרת הקשה. לאחר מכן הוסף 10 מיליליטר של מאגר ליזה RBC והשהה מחדש את התאים במערבולת. לאחר דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר, עצרו את הליזיס עם 10 מיליליטר של HBSS/FCS וסובבו את התאים, תוך השעיית הגלולה במדיום תאי מח העצם.

ספרו את מספר התאים ברי הקיימא על ידי אי הכללת Trypan Blue והעבירו את התאים הדרושים לצינור חדש עם מדיום תאי מח עצם. לאחר מכן אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה בדילול של ארבעה מיליון תאים למיליליטר במדיום תא מח העצם עם 20 ננוגרם למיליליטר של GM-CSF. לאחר מכן, הוסיפו 9.5 מיליליטר של מדיום תאי מח עצם בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של GM-CSF לצלחת פטרי חיידקית סטרילית אחת לכל תרבית והוסיפו 500 מיקרוליטר תאים למרכז כל צלחת.

דגרו על התאים ב-37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי CO2. ביום השלישי, הוסיפו 10 מיליליטר של מדיום מח עצם טרי בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של GM-CSF לכל תרבית, תוך הקפדה על מזעור כל הפרעה לתאים. ביום השישי, העבירו בזהירות 10 מיליליטר של תרבית תאים לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר.

צנטריפוגה של התאים ותשעה מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מדיום תאי מח עצם טרי, המכיל 20 ננוגרם למיליליטר של GM-CSF. לאחר מכן מערבל בעדינות את תרחיף התאים והחזיר את התאים לצלחת התרבות. ביום הראשון, תאי מח העצם קטנים ודלילים, אך ביום השלישי, התאים גדלו במספרם ובגודלם, וחלקם החלו להיצמד.

ביום השישי יש יותר תאים ונצפים גם שברים דבקים וגם לא דבקים. ניתן לקצור את התרבית מהיום השביעי עד ה-10 ולגדר לפי גודל ותאים חיים עם אחוז גבוה יותר של תאים חיוביים ל-CD11c המתקבלים מתרביות יום 10. ביום השביעי, השבר הלא נצמד שנאסף מועשר מאוד עבור תאים עם מורפולוגיה דנדריטית.

ניתן לחלק את האוכלוסיות החיוביות ל-CD11c ושליליות ל-GR1, שנקטפו ביום השביעי והעשירי, לשלוש אוכלוסיות עיקריות. מקרופאגים, תאים דנדריטיים לא בשלים ותאים דנדריטיים בוגרים על ידי ביטוי MHCII וקשירת FL-HA. מעניין לציין ש-MerTK, למרות שנחשב לסמן מקרופאגים, מציג ביטוי חזק הן על אוכלוסיות מקרופאגים והן על אוכלוסיות תאים דנדריטיים לא בשלים, שנקטפו בימים 7 ו-10, עם רמת ביטוי נמוכה שנצפתה בתאים דנדריטיים בוגרים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בטכניקות סטריליות לאורך כל קצירת מח העצם ותרבית התאים. לאחר הליך זה, ניתן גם למיין את התאים לבחינת אוכלוסיות תאים בנפרד, או לעורר אותם עם חומרים דלקתיים ולאחר מכן לנתח את ייצור הציטוקינים שלהם על ידי צביעה תוך תאית וזרימה ציטומטרית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי מח עצם ולתרבית אותם ב-GM-CSF כדי ליצור גם תאים דנדריטיים וגם מקרופאגים דמויי מכתשית.