דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק ולהבחין בין מקפגים דמויי-נאולבולריים (alveolar-like macrophages) לבין תאי דנדריטיים בתרביות של תאי מחול השגרה של עכברים in vitro, המועשרות ב-GM-CSF. שיטה זו in vitro יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לתפקודם של תאים דנדריטיים או מקפגים. היתרון המרכזי של הטכניקה הוא היכולת להפיק מספר תאים מספיק ולהבחין בין תאים דנדריטיים למקפגים דמויי-נאולבולריים.

ההשלכות של טכניקה זו עשויות להתרחב לטיפול בפרוטאוזיס ריאתי (pulmonary proteinosis), שכן היא מאפשרת השגה של מקרופאגים דמויי-אלבאולריים, שניתן להשתמש בהם לטיפול במחלה זו. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים שיטה זו יזדקקו לתרגול בבידוד העצמות המנוקות ובשטיפת מחית העצם. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא מועילה, כיוון שלא כל הטכניקות מובנות בקלות באמצעות הוראות כתובות בלבד.

15 דקות לפני תחילת הניתוח, הפעילו תא בטיחות ביולוגי כדי לנקות את האוויר בתא, לייצב את זרימת האוויר ולנקות את משטח התא ב-70% ethanol. כאשר התא מוכן, הניחו עכבר על גבי מגבת נייר אחת או שתיים בתנוחת שכיבה על הבטן ורססו את בעל החיים ב-70% ethanol. לאחר מכן, בעזרת היד הלא-דומיננטית, הרימו את העור מסביב לאזור בית החזה והשתמשו במספריים כדי לבצע חתך.

אחזו בשני קצות החתך ומשכו בזהירות עד ששני קצות החתך נפגשים בקיבה. לאחר מכן, הניחו את העכבר במצב שכיבה על הגב והשתמשו ביד אחת כדי למשוך את החצי התחתון של העור כלפי מטה עד שרגליו נחשפות. אחזו בכף הרגל וחתכו את גידי אכילס מעל מפרק הקרסול ואת הרצועות המחברות את השרירים לכף הרגל בקצה התחתון של הטיביה (tibia), כדי לשחרר את כף הרגל מעצמות הרגל.

תוך כדי שהרגל מורמת, הסר את השרירים והרצועות סביב מפרק הברך בקצה התחתון של ה-femur כדי לנתק את שרירי הירך מהשוק. בעזרת פינצטה, משוך בעדינות את השרירים שהשחררו מהמשטחים של ה-fibular וה-femoral. לאחר מכן, תוך לחיצה על המספריים במצב פתוח במפרק הירך, סובב את הרגל ומשוך בעדינות את ה-femur כדי להפריד את עצם הרגל ממפרק הירך תוך כדי חיתוך ושחרור הרגל מהגוף.

כעת, כאשר מחזיקים את הרגל בקצה הירך באמצעות פינצטה סטרילית, השתמשו בפינצטה נוספת כדי להסיר את כף הרגל מקצה הקרסול. לאחר מכן, החזיקו את הקצה הדיסטלי של ה-femur בפינצטה אחת ואת הקצה הפרוקסימלי של ה-tibia וה-fibula בפינצטה אחרת, וכופפו בזהירות את ה-tibia וה-fibula בכיוון המנוגד למפרק הברך כדי להפריד את השוק מה-femur ומה-patella. השתמשו בפינצטה כדי להסיר את הרצועות, השרירים וה-fibula שנותרו מעצמות השוק, והניחו את ה-tibia המנוקית על מכסה של Petri dish הפוך, המכיל 1 עד 2 milliliters של HBSS/FCS.

החזיקו את הקצה התחתון של ה-femur בעזרת סט אחד של פינצטה ואת ה-patella בעזרת סט נוסף, כפפו את הברך ואת הרקמות שסביבה בכיוון ההפוך כדי להסיר את המפרק. לאחר מכן, הסירו את שאריות הרקמות החיבוריות מה-femur והניחו את העצם על מכסה הפטריה הפוך. כאשר כל העצמות נאספו, השתמשו בפינצטה כדי לנקות שאריות רקמה שעדיין דבקות בעצמות, והטבילו את העצמות ב-10 milliliters של HBSS/FCS בתוך בסיס הפטריה.

תוך השארת הצלחת מוגנת חלקית באמצעות מכסה סטרילי, גזרו כל אחת מהעצמות המנוקות לחצי באמצעות מספריים. לאחר מכן, השתמשו במזרק של 1 ml, המצויד במחט בכיול 26.5-gauge, כדי לשטוף 1 ml של HBSS/FCS מהצלחת אל תוך קצתו של כל נתח עצם, עד שכל מח העצם האדום ישתחרר. העבירו כל גושים נראים של מח עצם דרך המזרק מספר פעמים כדי ליצור תרחיף של תאים בודדים, ולאחר מכן ערבבו ביסודיות באמצעות פיפטה של 10 ml.

העבירו את התאים למבחנת איסוף ושטפו את צלחת הפטרי פעם אחת עם 5 mL של HBSS/FCS כדי לאסוף תאים שנותרו. לאחר מכן, רכזו את השטיפה במבחנת האיסוף והניחו את התאים על קרח. כדי להקים תרבית תאי מח עצם, סבבו את התאים שנאספו בצנטריפוגה ושאבו את העלייה באמצעות פיפט פסטור מזכוכית סטרילית המחוברת למשאבת ואקום.

שחררו את המשקע העשיר בתאי דם אדומים באמצעות נקישה. לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של תמיסת ליזיס של RBC והשביו את התאים באמצעות וורטקס. לאחר דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר, עצרו את הליזיס באמצעות 10 milliliters של HBSS/FCS וסבבו את התאים במ centrifuge, תוך השביה של המשקע במצע לגידול תאי מח עצם.

ספרו את מספר התאים החיוניים באמצעות שיטת הדחת Trypan Blue והעבירו את מספר התאים הדרוש למבחנה חדשה עם מצע גידול לתאי מח עצם. לאחר מכן, אספו את התאים על ידי צנטריפוגציה וסספנדו מחדש את המשקע בדילול של ארבעה מיליון תאים למיליליטר במצע גידול לתאי מח עצם עם 20 nanograms per milliliter של GM-CSF. לאחר מכן, הוסיפו 9.5 milliliters של מצע גידול לתאי מח עצם המועשר ב-20 nanograms per milliliter של GM-CSF לכל צלחת פטרי סטרילית לבקטריות לתרבית, והוסיפו 500 microliters של תאים למרכז כל צלחת.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2. ביום השלישי, הוסיפו לכל תרבית 10 mL של מצע מחיה טרי למח העצם המועשר ב-20 ng/mL של GM-CSF, תוך הקפדה על מזעור הפרעות לתאים. ביום השישי, העבירו בזהירות 10 mL של על-נוזל התרבית (supernatant) לשפופרת קונית סטרילית של 50 mL.

סבבו את התאים בצנטריפוגה ושספו מחדש את המשקע ב-10 milliliters של מצע תרבית טרי לתאי מח עצם, המכיל 20 nanograms per milliliter של GM-CSF. לאחר מכן, ערבבו בעדינות את תרחיף התאים באמצעות וורטקס והחזירו את התאים לצלוחית התרבית. ביום הראשון, תאי מח העצם קטנים ודלילים, אך עד היום השלישי, מספר התאים וגודלם גדלו, וחלקם החלו להיצמד.

עד היום השישי, מספר התאים גדל ונצפות הן פראקציות נצמדות והן פראקציות שאינן נצמדות. ניתן לקצור את התרבית בין היום השביעי לעשירי, ולבצע סינון (gating) לפי גודל ותאים חיים; אחוז גבוה יותר של תאים חיוביים ל-CD11c מתקבל מתרביות ביום העשירי. ביום השביעי, הפראקציה שאינה נצמדת שנאספה מועשרת מאוד בתאים בעלי מורפולוגיה דנדריטית.

ניתן לחלק את האוכלוסיות החיוביות ל-CD11c והשליליות ל-GR1, שנאספו ביום השביעי וביום ה-10, לשלוש אוכלוסיות עיקריות: מקרופאגים, תאי דנדריטיים לא בשלים ותאי דנדריטיים בשלים, על בסיס ביטוי MHCII וקישור ל-FL-HA. באופן מעניין, MerTK, למרות שנחשב לסמן של מקרופאגים, מראה ביטוי חזק הן באוכלוסיות המקרופאגים והן באוכלוסיות התאים הדנדריטיים הלא בשלים שנאספו בימים השביעי וה-10, בעוד שבתאים דנדריטיים בשלים נצפתה רמת ביטוי נמוכה.

במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש בטכניקות סטריליות לאורך כל תהליך איסוף מח העצם והתרבית התאית. לאחר פרוצדורה זו, ניתן גם לבצע מיון של התאים כדי לבחון אוכלוסיות תאים בנפרד, או להמריץ אותם באמצעות גורמים דלקתיים ולאחר מכן לנתח את ייצור הציטוקינים שלהם באמצעות צביעה תוך-תאית וציטומטריית זרימה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן בידוד תאי מח עצם והגדלתם ב-GM-CSF כדי להפיק הן תאים דנדריטיים והן מקרופאגים דמויי-אלבאולאריים.