ראפיד תפוקה גבוהה זיהוי מינים של חומר הבוטני באמצעות ניתוח ישיר בזמן אמת רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לזהות את מין החומר הבוטני באמצעות ספקטרומטריית מסות עם יינון סביבתי, בשילוב עם ניתוח סטטיסטי רב-משתני. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הכימיה והביולוגיה, כגון, למשל, זיהוי מין הצמח על בסיס הטביעה הכימית שלו.

ניתן כמו כן לקבל מידע על המולקולות הביואקטיביות הנמצאות ברקמת הצמח. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת הכנה מועטה מאוד של הדגימה לצורך האנליזה, וניתן לרכוש את הנתונים בתוך מספר דקות. ניתן להשתמש בשיטה זו גם לפתרון בעיות אחרות בכימיה.

לדוגמה, מעקב אחר תוצרי ביניים ותוצרים בתגובות סינתזה אורגנית, ניתוח של מטריצות מורכבות מסוגים שונים וביצוע ניתוח headspace. כדי להכין את חומר העלה הטרי של הקראטום, השתמשו במחורר חורים בקוטר שש מילימטרים כדי ליצור דיסקיות אחידות של חומר עלה קראטום מצמח *M. speciosa*. חזרו על תהליך זה חמש פעמים.

כדי להפיק את אבקת הקראטום, עבדו בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר והשעיו כמות קטנה של אבקת קראטום Bali ב-1 מיליליטר של תערובת ממס של אתנול ומים ביחס של אחת לאחת. חזרו על תהליך זה חמש פעמים. בצעו סוניקציה לדגימות תמצית אבקת הקראטום Bali באמבט אולטרסונית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, סבב את דגימות המיצוי של אבקת הקראטום (kratom Bali) במשך שתי דקות ב-750g בטמפרטורת החדר. נסוך את הממס מהאבקה שנותרה לצורך ניתוח המשך. להכנת זרעי הדטורה, חתוך זרע של *D. stramonium* לחצי במישור הרוחבי באמצעות להב תער.

חזור על תהליך זה באמצעות חמישה זרעים שונים. לאחר הגדרת הפרמטרים של ספקטרומטר המסה או ה-MS כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, לחץ על Start Run בתוכנת הבקרה של ספקטרומטר המסה כדי לנתח את עלה הקרטום. תלה באמצעות פינצטה את השאריות של חומר הצמח עלה הקרטום בין מקור היונים לבין כניסת ספקטרומטר המסה עד לקבלת ספקטרום.

חזור על הליך זה חמש פעמים עם דגימות נפרדות של חומר צמחי. כדי לכייל את הספקטרום באמצעות polyethyline glycol 600, המקוצר כ-PEG, טבול את הקצה הסגור של צינור נימי לנקודת התכה לתוך תמילת הסטנדרט של ה-peg. תלה את הנימבי המצופה בין מקור היונים לבין כניסת הספקטרומטר למסות.

בחר בכפתור Stop כדי לסיים את ההרצה האנליטית. לחץ על Start Run בתוכנת הבקרה של ספקטרומטר המסה כדי לנתח את עלה הקראטום המיובש. תלה כמות קטנה של חומר מהעלה המיובש בין מקור היונים לבין כניסת ספקטרומטר המסה באמצעות פינצטה, עד לקבלת ספקטרום.

חזור על הרכישה חמש פעמים, כאשר בכל פעם מנתחים חומר צמחי חדש. כייל את הספקטרום באמצעות PEG כפי שנעשה קודם לכן, ולאחר מכן בחר בכפתור Stop כדי לסיים את הרצה האנליטית. כדי לנתח את אבקת ה-kratom, לחץ על Start Run בתוכנת הבקרה של ספקטרומטר המסות.

טבול את הקצה הסגור של קפילריה לנקודת התכה לתוך אבקת הקרטום. תלה את הקפילריה המצופה בין מקור היונים לבין כניסת ספקטרומטר המסות עד לקבלת ספקטרום. חזור על הניתוח חמש פעמים עם קפילריה חדשה בכל פעם, ולאחר מכן בצע כיול PEG.

כדי לנתח את תמצית הקראטום, טבול את קצהו של צינור קפילרי בתוך התמצית. תלה את הצינור הקפילרי במחזיק 12 הדגימות שעל המסילה הליניארית של ספקטרומטר המסה. חזור על הפעולה חמש פעמים, כאשר בכל פעם תשתמש בתמצית שונה.

לחצו על Start Run בתוכנת הבקרה של ספקטרומטר המסה. באמצעות לוח הבקרה, בחרו בלחצן ההקדמה קדימה כדי להזיז את המסילה הליניארית דרך זרם היונים בקצב של מילימטר אחד לשנייה לצורך איסוף ספקטרה. ככל שנעשה בעבר, כיילו את הספקטרום באמצעות PEG ולחצו על Stop כדי לסיים את הרצה האנליטית.

כדי לנתח את זרעי הדטורה, לחץ על Start Run בתוכנת הבקרה של ספקטרומטר המסות. החזק את חצי זרע הדטורה בין מקור היונים לבין פתח הכניסה של ספקטרומטר המסות באמצעות פינצטה עד לאיסוף הספקטרום. ודא שהצד החתוך פונה לעבר מקור היונים.

חזור על הליך זה חמש פעמים, כאשר בכל פעם מנתחים חצי זרע חדש. השלם את הניתוח באמצעות כיול PEG ולחץ על Stop כדי לסיים את הרצה האנליטית. לאחר ביצוע עיבוד הנתונים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, בצע את ניתוח הרכיבים הראשיים (PCA) על ידי ניווט למדור Classify בתוכנת הניתוח הספקטרלי תחת לשונית Setup, וצור מחלקות לעיבוד הנתונים על ידי בחירה ב-Add Class.

ייבאו את קבצי הטקסט של הנתונים על ידי בחירה ב-Add Files. שייכו את קבצי הנתונים למחלקה המתאימה של הצמח על ידי בחירה ב-Text Files וב-Set Class for Selected Files. בחרו מסות של מאפיינים להבחנה מה-MS מתוך קבוצת האימון והגדירו את אחוז הסף ל-1% ต่อ. לאחר מכן, הגדירו סבילות למסה ל-10 ובחרו ב-Build Vectors from Data Files.

בסעיף החישוב (Compute), בצעו ניתוח רכיבים ראשיים על ידי סימון תיבת הבחירה עבור 3D PCA Graph ובחירה ב-Calculate. בצעו תיקוף צולב מסוג leave-one-out על ידי בחירה ב-Validate. לאחר מכן, הפקו את מפת החום של הנתונים על ידי מעבר ללשונית Frequency Plot של תוכנת הניתוח הספקטרלי ובחירה ב-Heat Map.

בחר ב-Threshold saved data כדי להגדיר את סף השפעות ל-1%. ייצא את מפת החום לגיליון אלקטרוני על ידי בחירה ב-Save Heat Map to Excel. בתוכנת הגיליונות, שמור את מפת החום שיוצאה כקובץ טקסט. לאחר מכן, כדי לבצע את ניתוח הצבירה ההיררכית, ייבא את מפת החום כקובץ טקסט לתוכנת Cluster 3.0.

בלשונית Hierarchical בתוכנת Cluster 3.0, תחת Genes and Arrays, סמנו את תיבות הבחירה Cluster ו-Calculate weights. הגדירו את ערך ה-cutoff ל-0.1 ואת המעריך (exponent) ל-1. בחרו ב-single linkage clustering לביצוע הניתוח.

לבסוף, הציגו את קובץ נתוני ה-cdt שנוצר בתצוגת עץ של Java. כאן מוצגים ספקטרוםים מייצגים של מוצרי קראטום במצב יון חיובי עם יינון רך. זוהו תרכובות שבודדו בעבר מ-M.speciosa.

כולל את הסממנים הביולוגיים הפסיכואקטיביים Mitragynin ו-7-Hydroxy-mitragynine. מוצגים כאן ספקטראים מייצגים של מצב יונים חיוביים ביינונית של יינון רך של זרעי דתורה. זוהו תרכובות שבודדו בעבר מדתורה, כולל הסממנים הביולוגיים הפסיכואקטיביים Atropine ו-Scopolamine.

הצגות של מפות חום (Heat maps) של נתוני ספקטרומטריית המסה מוצגות כאן. מוצג גרף ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) של נתוני הקרטום והדטורה. גרף ה-PCA מראה בבירור כי נתוני הקרטום ונתוני הדטורה מופרדים היטב זה מזה.

ניתוח PCA העלה גם כי ניתן לזהות ולהבדיל בין הזנים השונים של קראטום ובין המינים השונים של דטורה. מוצגות תוצאות ניתוח מקבץ היררכי (HCA) של נתוני ספקטרומטריית מסה של קראטום ודטורה. תוצאות ה-HCA העלו בידול בין מחלקות, מינים וזנים, המבוסס אך ורק על נתונים שהופקו מניתוח ישיר בזמן אמת באמצעות ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה, ואישרו את תוצאות ניתוח ה-PCA.

לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה בפחות משעה, בהתאם למספר הדגימות, במידה שהיא מבוצעת כהלכה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה באופן השימוש בניתוח ישיר ובספקטרומטריית מסות בזמן אמת לצורך ניתוח דגימות מורכבות, ובאופן השימוש בעיבוד ניתוח סטטיסטי של הנתונים כדי לקבל מידע על מינים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להחזיק את הדגימה בזרם היונים למשך פרק זמן מתאים כדי לרכוש ספקטרום מסות מלא של הדגימה.

טכניקה זו אפשרה לחוקרים בתחומים רבים, כולל אומיקה של צמחים, פורנזיקה, כימיה אורגנית ואנליטית, לבחון ניתוח של חומרים נדיפים הנפלטים מצמחים, לזהות חלופות חוקיות לסמים אסורים ולנטר תוצרי תגובה בזמן אמת.