Name: Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: חקור אינטראקציות תאי T-אפיתל תחת מאמץ גזירה באמצעות מערכת זרימה עם מיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו מאפשרת כימות הידבקות תאי T והבנת מנגנוני הפעלת אינטגרינים כמו LFA1 באימונולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הקרן למחקר ראומטולוגי וקרן הירשיל תמכו בעבודה זו.

1. ציפוי תאי CHO-ICAM הערה: המטרה של שלב זה היא צלחת תאי CHO-ICAM בתאי התזרים לצמיחת לילה עם המטרה של יצירה בשכבה ומחוברת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים CHO-ICAM ב 10 ס&quot;מ תרבות מנות מטופלים רקמות-תרבות ב 10 מ&quot;ל התקשורת RPMI בתוספת סרום שור העובר 10% (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (מדיה תרבות שלמה CHO-ICAM) על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף תאים, להוסיף 1 מ&quot;ל 0.5% טריפסין-EDTA דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה עם רעד עדין. לנטרל את טריפסין עם 4 מ&quot;ל של התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים CHO-ICAM באמצעות hemacytometer ולחשב 0.75 x 10 5 תאים לכל תא. הערה: בניסוי זה: 2.25 x 10 5 תאים יהיו צורך זרע 3 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 0.75 x 10 5 CHO-ICAM תאים לכל תא במשך 5 דקות ב 500 XG, בטמפרטורת החדר ו resuspend התא גלולה ב 30 μl לכל תא של CHO-ICAM תקשורת תרבות שלמה. הערה: בניסוי זה 90 μl יהיה צורך זרע 3 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט מוסיף את התאים לתוך מאגר אחד של החדר לזרום. אפשר התאים להסתפק 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של התקשורת בתרבות מלאה לכל רוחב שני מאגרים של כל תא. תוספות חלופיות בין שתיים כדי למנוע תנועה של התאים כמערכה equilibrates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאי הלילה בתוך 37 ° C חממה עם 5% CO 2. </li></ol> 2. הכנת תאי T הערה: assay ניתן לעשות זאת עם תאי T האנושי ראשוניים או שורת תאי T. פרוטוקול על בידוד תא T מדם תואר בעבר. 10 אם תאי T אנושיים ראשוני באמצעות שימוש בתאי מבודדים טרי עבור התוצאות הטובות ביותר. אם באמצעות קו תא T, לעקוב אחר פרוטוקול התרבות שצוין על ידי המקור של התאים. כדי לזהות את התאים על microsco ניאוןpe תאי T מסומנים עם אסתר succinimidyl carboxy והעמסה (CFSE). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי T באמצעות hemacytometer ולחשב 2 x 10 6 תאים לכל תא. הערה: בניסוי זה, 6 x 10 6 תאים יהיו צורך 3 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 2 x 10 6 T תאים לכל תא במשך 5 דקות ב 500 XG, בטמפרטורת החדר resuspend התאים 1 מ&quot;ל של בופר פוספט (PBS) המכיל גלוקוז 1% או 2% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף CFSE ב 1: 1,000 דילול (מלאה שבוצע 5 מ&quot;מ). מכסים מפני אור דגירה במשך 8 דקות ב RT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב XG 500 במשך 5 דקות, RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תא גלולה עם 240 μl לכל מצב (ראה סעיף 4 &quot;הערה&quot;) של סרום חסר RPMI התקשורת. בניסוי זה, resuspend התא גלולה ב 720 μl של מישור RPMI. מחלק את התאים לתוך צינורות 1.5 מיליליטר ריקים שכותרתה עבור כל תא, 240 μl לכל צינור. שמור את התאים בתוך גוש חום 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li></ol> 3. הגדרת הדואר קלט / פלט hosing ו מזרק משאבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ לחמם את חדר הדמיה מיקרוסקופ חי ל -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את hosing קלט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בקבוק זכוכית 500 מ&quot;ל עם מים ולעשות 2 חורים לתוך המכסה. לייבל חורים &quot;&quot; ו- &quot;Out&quot;. זה ישמש באמבט מי חימום עבור תקשורת הקלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הקלט hosing דרך החורה שבמכסה לאמבטית המים. ודא שהצד של hosing המתחבר המזרק מגיע דרך &quot;ב&quot; חור והצד שיחבר למאגר קלט מגיע דרך החור &quot;החוצה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את קלט hosing עם 60 מ&quot;ל של מים כדי להסיר כל האוויר מהמערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש קלט hosing עם התקשורת RPMI חסר בסרום חימם עד 37 מעלות צלזיוס. ממלאי מזרק 60 מ&quot;ל ולדחוף באמצעות התקשורת עד hosing הוא דרוך לחלוטין וחסר כל בועות אוויר. הערה: בהתאם length של צינורות השתמש הנפח נדרש ממשלה ישתנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את נפח של התקשורת הדרושים הניסוי על ידי הכפלת קצב הזרימה (כאן 0.3 mL / min) במספר דקות (5 דק &#39;) במספר תאי בניסוי (כאן 3); בניסוי זה, השתמש 4.5 מיליליטר תקשורת. הערה: אנו ממליצים ליצור 5 מ&quot;ל נפח נוסף (כאן בסך 9.5 מ&quot;ל) שנותרו המזרק לאחר תחול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את התקנת הקלט כולו לתוך מתחם הדמית חיה של מיקרוסקופ כדי לשמור על 37 מעלות צלזיוס. הפעל את hosing ומזרק מתוך המתחם ולטעון את המזרק לתוך משאבת מזרק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את hosing פלט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חור במכסה של בקבוק 250 מ&quot;ל להשתמש כפסולת פלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את צינורות פלט דרך החור לתוך הבקבוק. רופף לאבטח את המכסה, לא לסגור את כל הדרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את ההתקנה פלט לתוך מתחם הדמית החיה של המילcroscope. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את קצב הזרימה (mL / min) דרושים כדי ליצור את לחץ הגזירה הרצוי (dyn / cm 2). שאר מתח משתנה בתאים וסקולרית שונים, ולכן לקחת בחשבון את המודל בכללותו כולל סוגי תאים להיחקר וטיפולים כאשר מחליטים על רמת מאמץ הגזירה. הערה: בניסויים אלה נערכים 0.4 dyn / 2 סנטימטרים לחקות באופן הדוק הגדרת וריד קטנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את ממדי תא בחשבון בעת ​​חישוב מאמץ הגזירה. השתמש בנוסחה הבאה (שסיפק היצרן 11) לתאי הזרימה משמש כאן (ראו טבלה של חומרים): T = η * 176.1 * ø איפה T = גזירה מתח, η = צמיגות דינמיות, מ = והספיקה. ההערה: הצמיגות הדינמית של RPMI תקשורת ב 37 ° C היא 0.007. </li></ol></li></ol> טוען 4. של צ&#39;יימברס זרימת הגירוי של התאים הערה: על מנת ליזום הדבקה,יש לגרות תאי T. בניסוי הבא התאים יהיה גם להישאר unstimulated או מגורה עם אצטט myristate phorbol 12 או SDF-1α (PMA; בקרה חיובית) 13. עבור הצגה נאותה הכמוקין לתא T, תאים CHO-ICAM הם preincubated עם-1α SDF (ואחריו שוטף סדרתי), המאפשר הצגה על פני התא. PMA היא אסתר phorbol כי היא מבנית דומה גליצרול שליח diacyl השני (DAG); כאן הוא משמש כביקורת חיובית. תאי T מטופלות ישירות עם PMA לפני הטעינה לתוך תא הזרימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף תא הזרימה על המיקרוסקופ ולהגדיר את מישור המוקד על monolayer CHO-ICAM באמצעות המטרה 20X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התאים T CFSE מוכתם לכל התנאים האחרים בבלוק חום 37 מעלות צלזיוס. להכין את התאים CHO-ICAM או T כדלקמן ערב assay עבור ובלבד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תנאי unstimulated (תא 1), לשמור ch צינור / זרימה אחדענבר לא מטופל, לשרת בקרה שלילית כמו לגירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור גירוי PMA (תא 2), לעורר צינור אחד של תאי T עם PMA (10 ng / ml) לשרת בקרה חיובית כמו; לטפל מייד לפני הטעינה לתוך תא זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור גירוי SDF-1α, (תא 3), לעורר את תא הזרימה השלישי עם-1α SDF (100 ng / ml) על ידי הסרת 70 μl בכל פעם 3 פעמים מהמאגר העליון (מאגר פלט) ולאחר מכן להוסיף 70 μl של SDF -1α (100 ng / ml) לתוך (מאגר קלט) מהמאגר התחתון. דגירה במשך 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר וזורק 70 μl בכל פעם 3 פעמים ממאגר הפלט של תא אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 70 μl של שטופל מראש (לפי עניין) השעית תא T אל תוך מאגר הקלט 3 פעמים. מתן 5 דקות כדי לאפשר לתאים לנוע המכניסה של החדר ( &quot;ב&quot;), וכדי להגיע לשקע הפרוקסימלית ( &quot;מתוך&quot;) של החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופה זו, תמונה 5שדות עבור תאי T מוכתמות CFSE. בחר שדות פזורים במרכז החדר (איור 1). השתמש תנאי עירור / פליטה הבאה: אורך גל ליזר עירור: 488 ננומטר; פליטה לסנן אוסף: 500 - 540 ננומטר. תמונות אלה תשמשנה ספירת התאים מראש הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינורות הקלט ופלט זמנית למאגרי תא זרימה. הערה: חיבור הצינורות במקביל הוא קריטי כדי לא להכניס בועות אוויר לתוך התא ושמירת שיווי משקל הכולל בתוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הזרימה ב 0.3 מ&quot;ל / דקה (0.4 dyn / 2 ס&quot;מ) בעוד לדמיין את תאי ה- T-מוכתמים CFSE. כזרימה מתחילה, במיוחד עם התא הראשון, על פי רוב קיים פער בין ייזום זרימה וההתבוננות מתגלגל תא T, ולכן מתחיל דקות עיתוי 5 עם תחילת התנועה של תאי T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיים זרימה לאחר 5 דק &#39;, ותמונת 5 שדות בערוץ CFSE. בחר שדות התפזרו באופן אקראי throughout במרכז תא הזרימה (איור 1). תמונות אלה תשמשנה ספירת התאי שלאחר הזרימה. </li></ol> 5. קביעת אחוז התאים חסידים הערה: קביעת מספר תאי התמונות שנרכשו נעשית באופן אובייקטיבי עם תוכנות אוטומטיות. עבור מחקרים שלנו השתמשנו בתוכנה Volocity (גרסה 6.2.1), אבל תוכנות אחרות כגון ImageJ (1.48V Version) חלים גם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את מספר תאים לכל זרימת מראש שדה לכל מצב. הממוצע של 5 שדות הוא &quot;ספירת תאי הממוצע מראש הזרימה.&quot; 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את מספר תאים לכל זרימת פוסט שדה לכל מצב. הממוצע של 5 השדות הוא &quot;ספירת תאים הממוצעת שלאחר הזרימה.&quot; 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אחוזי התאים חסידים באמצעות הנוסחא הבאה: אחוז התאים החסידים = (ספירת תאים ממוצעת שלאחר זרימה) / (ספירת תאי ממוצע מראש זרימה) x 100%. </li></ol>

<ol><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+the+run%3A+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li>
<li>Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li>
<li>Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li>
<li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-triggered+leukocyte+arrest%3A+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li>
<li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+and+its+effector+RIAM+are+required+for+lymphocyte+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking.</a> Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).</li>
<li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+in+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing in T lymphocyte activation.</a> Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).</li>
<li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+adhesion+of+CD4%2B+T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li>
<li>Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+adhesion+assay+for+the+study+of+integrin+activation+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li>
<li>Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+11%22">Application Note 11</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf">http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf</a> (2014).</li>
<li>van Gijsel-Bonnello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantethine+Alters+Lipid+Composition+and+Cholesterol+Content+of+Membrane+Rafts%2C+With+Down-Regulation+of+CXCL12-Induced+T+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration.</a> J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).</li>
<li>Tozeren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+adhesion+of+phorbol+12-myristate-13-acetate-stimulated+T+lymphocytes+to+planar+membranes+containing+intercellular+adhesion+molecule-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1.</a> Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).</li>
<li>Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+mechanisms+regulating+chemokine+activity+and+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability.</a> Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).</li>
<li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+binding+assay+for+studying+chemokine+interactions+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells.</a> J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li>
<li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1%3A+getting+a+grip+on+leukocyte+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion.</a> J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כדי כראוי לנתח הידבקות תא T, את החומר מהגוף להיכלל במחקר יש לקחת בחשבון בעת בחירת שיטה במבחנה. אמנם יש מספר מבחנים ללמוד אותות שמובילים הפעלת LFA-1 ו- ICAM-1 מחייב כל השיטות אינן ניתנות להחלפה. Assay הידבקות סטטית 10 הוא המתאים ביותר כדי לחקור אינטראקציות T תא-APC; לחלופין, שיטת מאמץ הגזירה המפורטת כאן היא אידיאלית מודל אינטראקציות תא T-אפיתל תא. בשנת vivo, כמו כמוקינים מוצגים לאורך האנדותל, מתגלגלים תאי T חייב להגיב על ידי עמיד בתוקף ולהתנגד מאמץ הגזי...

T הידבקות הלימפוציטים מתווכת מספר תהליכים שונים במערכת חיסונית בריאה, 3 ממלאים תפקידים מהותיים בסחר תא T והצגת אנטיגן. בין אם במהלך מעקב חיסוני או תגובה חיסונית פעילה שני תפקידים רחבים אלו הידבקות הם קריטיים. 4 אירועי האיתות הפיסיולוגיים של אינטראקציות תא האנדותל T נבדלים אנטיגן לתא T הצגת תא אינטראקציות (APC), ולכן דורשים שיטות שונות של מחקר כדי להבין בצורה הטובה ביותר מפלי איתות מעורבים. הידבקות המשרד של תא T לקיר כלי דם במהלך extravasation לימפוציטים דורשת הפעלת integrin מהירה ודינמית. האינטראקציה ההדוקה בין מולקולות integrin הידבקות מצב פעילות לאורך האנדותל מובילה הידבקות עמידה לזרימת דם, מה שמאפשר לתאי T לזחול על פני השטח בחיפוש אחרים שטח מתירנית למעבר תא. 5 הזחילה של המדינה דו תא T -directionally אלוןדפנות כלי דם ga הן סומכות על הידבקות מקוטבת, עם כחזית דבק נבדל של תאי T. 6 והחשוב מכל, הדבקה איתן גלגול דורשים התנגדות לכוח הגזירה שנוצר על ידי מחזורי את זרימת דם. בעת תכנון ניסויים כדי ללמוד הידבקות לימפוציטים, יש לשים לב לגירוי מסוים של עניין. בעוד integrin הפעלה הוא מרכיב נפוץ וביקורתי של כל הצורות של הידבקות תא T, במפלי ההפעלה צפויים להיות ייחודי במורד זרם של קולטנים פרט-קולטנים שיתוף. כמו כן, integrin וזוגות מולקולת ההידבקות לתפקד microenvironments מיוחד על תת-אוכלוסיות ספציפיות. בדרך זו, זוגות אלה עשויים להיות מוסדרים בצורה שונה לגמרי. המודל המוצג כאן הוא אידיאלי לחקר איתות מפלי מוביל integrin הפעלה מתרחשת בתנאי מאמץ גזירה. 7 אינטראקציות אלה לא ניתן להבין כראוי בתוך מודבק סטטיבמערכת עקב השפעת הכוחות הללו הוכחו יש ישירות על התנהגות התא T. 8 למרות שהן מוצגות כאן עם תאי T ו CHO תאים (שחלה של אוגר סיני) שהונדסו (תאים CHO-ICAM) האדם ICAM-1 במערכת יכול בקלות להיות שונה כדי ללמוד אוכלוסיות לויקוציטים שונים או מולקולות דבקות. assay זה מספק שיטה לכמת דביקות תא T והפעלה integrin באמצעות מאמץ הגזירה, מתן מודל לשלב הידבקות המשרד של extravasation לויקוציטים. באמצעות שימוש בתאי CHO-ICAM הזיקה של LFA-1 עבור ליגנד שלה בתאים חיים ניתן לבדוק בזמן אמת בתגובה לגירויים שונים של עניין. טכניקה זו דורשת להשיג בקלות, זמינים מסחרי תאי מייקרו-זרימה בשילוב עם משאבת מזרק, מאוד לפשט את הציוד הדרוש מודל זרימת דם ואת לחץ גזירה לעומת דגמים אחרים. 9 עוד יתרון חשוב של assay זה הוא כי איתות ספציפיתמפלי מדינת ההפעלה וכתוצאה מכך של integrins הבודד ניתן ללמוד בצורה נקיה באמצעות השימוש בתאי CHO מהונדסים לבטא מולקולות דבקות אדם של עניין. בנוסף, שילוב של נתונים כמותיים עם הדמית תא חי הוא יתרון משמעותי של שיטה זו. בסך הכל, בעוד מספר מבחנים של הידבקות תא סטטי T תוארו כי יפה מודל T אינטראקציות תא-APC, מודלים אלה אינם מספיקים לכידת התהליך הדינמי של הידבקות תא-אפיתל T. מסיבה זו, בעת בחירת assay הידבקות הגירוי הנדון יש לקחת בחשבון.

<table><tbody><tr><td>דגימות תאי T (קו תאים או ראשוני)</td> <td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>תאי T אנושיים היקפיים</td></tr><tr><td>תאי CHO-ICAM-1 ATCC</td><td></td><td>CRL-2093</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide VI 0.4 ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>500 מ"ל בקבוק זכוכית</td><td>פישר</td><td>FB800500</td><td></td></tr><tr><td>250 מ"ל בקבוק זכוכית</td><td>פישר</td><td>FB800250</td><td></td></tr><tr><td>סיליקון צינורות 0.8 מ"מ</td><td>ibidi</td><td>10841</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי עם תא חממה</td><td>Ziess</td><td>700</td><td>כל משאבת מזרק מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה רחב</td></tr><tr><td></td><td>מערכות משאבות עידן</td><td>חדש NE-300</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 60 מ"ל</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>eBioscience</td><td>65-0850</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&alpha;</td><td>מו"פ D</td><td>350-NS-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>12-702F/12</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>לונזה</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>אפנדורף&nbsp;</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td></td></tr><tr><td>Volocity software</td><td>Perkin Elmer</td><td>גרסה 6.2.1</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ImageJ</td><td>NIH</td><td>גרסה 1.48V</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית שטופלו בתרבית רקמות</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%) פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>FBS מומת בחום</td><td>דנוויל</td><td>FB5001-H</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>פישר</td><td>BP295950</td><td></td></tr></tbody></table>

assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר t לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

בסך הכל, הידבקות תא T היא מרכיב קריטי של פונקציה, תורם תהליכים השונים של גיוס הסלולר לאתרים של דלקת ואינטראקציה עם תאי מציגי אנטיגן (APC) להיווצרות של סינפסות חיסונית. שני אלה בהקשרים של הידבקות התא T נבדלים כי T אינטראקציות תא-APC יכול להיחשב סטטי, ואילו אינטראקציות כלי תא-דם T מאותגרים על ידי מאמץ הגזירה שנוצר כתוצאה מזרימת עצמה. אינטראקציות T תא-APC מסווגים סטטי ששני השותפים הסלולר ביחס סטטי זה לזה. בדרך כלל, האינטראקציה הזו מתרחשת בתוך בלוטות הלימפה. כתא T אינטראקציה עם דפנות כלי דם, תאי המעצר חייב להתנגד מאמץ גזירה שנוצר. 1,2 הבדלים אלו מדגישים את הצורך להבין טוב יותר את הידבקות הידבקות סטטית בתנאי זרימה כשני תהליכים רגולטוריים ברורים. הסדרת הידבקות תא T ניתן לתאר באופן תמציתי ביותר כמו conחכות מדינת הזיקה של integrin מולקולות לידי ביטוי על פני התא, ובכך המסדיר את יחסי הגומלין של integrins עם ליגנדים מולקולת הידבקות ביטוי על פני השטח של תא האינטראקציה. ההבנה הנוכחית שלנו של הרגולציה של מדינות זיקת integrin מגיעה לעתים קרובות פשטני במערכות מודל במבחנה. את assay של הידבקות באמצעות תנאי הזרימה המתואר כאן מאפשר הדמיה וכימות מדויק של אינטראקציות תא אפיתל T בזמן אמת בעקבות גירוי. הידבקות תחת assay זרימה יכולה להיות מיושמת על מחקרים של הידבקות איתות בתוך תאי T לאחר טיפול עם חומרים מעכבים או גירוי. בנוסף, assay הזה ניתן להרחיב מעבר T תא איתות לכל אוכלוסייה לויקוציטים הדבק וכל זוג מולקולת integrin-הידבקות.

תוצאות נציג מוצגים מתוך assay הידבקות זרימה באמצעות Jurkat ואנושי העיקרי תאים CD3 + T, כפי שצוין, מגורה עם-1α SDF. הפקדים השליליים בכל הניסויים המוצגים הם תאי unstimulated. הידבקות אחוזי הבזליים סף של תאי unstimulated היא בין 5 - 10%; הידבקות בסיס בעיקר מעל לטווח זה מצביע על ניסוי בעייתי ומציעה אוכלוסיית תחילת תאי T מולאה מראש מופעל nonspecifically בהכנה. מקפלי גידול במספר תאים חסידים זרימת פוסט בכל מצב בהשוואה לתאי unstimulated ניתן לחש...

assay הידבקות זרימה זו מספק מודל השפעה פשוט, גבוה של אינטראקציות תא אפיתל T. משאבת מזרק משמש להפקת מאמץ הגזירה, וכן במיקרוסקופ confocal לוכדת תמונות כימות. מטרת המחקרים אלה היא לכמת הידבקות תא T ביעילות באמצעות תנאי זרימה.

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

המטרה הכללית של בדיקה זו היא לקבוע את ההשפעות של טיפולים רלוונטיים על היצמדות תאית תחת תנאי מאמץ גזירה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השליחון של תאי מערכת החיסון, כגון, אילו גורמים מתווכים את הפעלת האינטגרין. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לחקור זוגות של מולקולות היצמדות בודדות של אינטגרין במערכת זרימה שניתן לשחזר בקלות.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הפעלת LFA1, ניתן להחיל אותה גם על חקר של אינטגרינים אחרים. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה עלולים להתקשות בביצועה, מכיוון שההכנה הטכנית חייבת להיות מדויקת. כדי לקצור את תאי CHO-ICAM, יש לטפל בתרבית ב-0.5%trypsin EDTA למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר תוך써ניעור עדין.כאשר התאים מתחילים להינתק, יש לנטרל את ה-trypsin באמצעות ארבעה מיליליטר של מצע טרי, ולספור את מספר התאים שהופרדו. יש לדלל את התאים לריכוז של 0.75 × 10⁵ תאים לתא, ולהסמיך אותם בצנטריפוגה. לאחר מכן, יש לתלה את המשקע ב-30 µl לכל תא זרימה, במצע גידול CHO-ICAM מלא, ולהזרים לאט מנות של 30 µl של תאים לכל מאגר של תא הזרימה.הנח את התאים למשקיעה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף 200 µL של מצע תרבית מלא לשני המאגרים בכל תא, והחזר את הפלטה לאינקובטור לתרבית לילה. לאחר קציר תאי ה-T, ספור ודלל את תרחיף התאים לריכוז של 2 × 10⁶ תאים לכל תא.לאחר מכן, סובב את התאים בצנטריפוגה ושחזר את המשקע ב-1 מ"ל של PBS, בתוספת 1% glucose עבור כל 2×10⁶ תאי T. לאחר מכן, סמן את תאי ה-T בדילול של 1 ל-1000 של CFSE, בחושך, למשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר. בסיום הדגירה, סובב את התאים בצנטריפוגה ושחזר את המשקע ב-240 µL של מצע RPMI נטול סרום לכל תא (chamber).לאחר מכן, חלק את התאים לשפחור של 1.5 מיליליטר לכל תא, ואחסן את השפחורים בבלוק חימום בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עד לטעינה. לפני הצילום, חמם את תא הצילום החי של המיקרוסקופ ל-37 degrees Celsius, ומלא בקבוק זכוכית של 500 מיליליטר במים. הכנס שני חורים במכסה שסומנו כ-in ו-out, והעבר את צינור החיבור של המזרק דרך חור ה-in, ואת צינור החיבור של מאגר הכניסה דרך חור ה-out.השתמש במזרק של 60 מיליליטר כדי לשטוף את צינור הכניסה עם 60 מיליליטר של מים, ולאחר מכן עם 60 מיליליטר של מצע ללא סרום בטמפרטורה של 37 degrees Celsius כדי להוציא אוויר מהמערכת. כאשר הצינור מוכן, העבר את כל מערכת הכניסה לתא הדימיג'ינג החי (live imaging chamber) של המיקרוסקופ כדי לשמור על המערכת בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. הוצא את הצינור והמזרק אל מחוץ לתא, והכנס את המזרק למשאבת המזרקים.בשלב הבא, הכינו חור במכסה של בקבוק בנפח 250 מיליליטר שישמש כמיכל לפסולת, והעבירו את צינור המוצא דרך החור אל תוך הבקבוק. לאחר מכן, סגרו את מכסה בקבוק המוצא באופן רפוי והניחו את כל מערך המוצא בתוך תא הדימיג בזמן אמת. כעת, הניחו את שקופית תא הזרימה על משטח המיקרוסקופ, והשתמשו בעדשה של 20X כדי לקבוע את מישור המיקוד על שכבת המונו ב-CHO ICAM.לאחר מכן, החל בקבוצת הביקורת ללא גירוי, השלך שלושה נפחים של 70 µL ממאגר המוצא של התא הראשון, והוסף שלושה נפחים של 70 µL של תאי T המסומנים ב-CFSE למאגר הכניסה. בזמן שתאי ה-T נעים מהכניסה אל המוצא, דגום תמונות של חמישה שדות אקראיים של תאי T חיוביים ל-CFSE בכל תא כדי לקבל את ספירת התאים הראשונית לפני הזרימה. לאחר מכן, חבר בו-זמנית את צינורות הכניסה והמוצא למאגרים של תא הזרימה, תוך הקפדה שלא להחדיר בועות אוויר, והתחל את זרימת מאמץ הגזירה בקצב של 0.3 mL לדקה, תוך המשך מעקב חזותי אחר תאי ה-T הצבועים ב-CFSE.ברגע שנצפה תנועה של תאי ה-T, הפעילו טיימר לחמש דקות, והפסיקו את הזרימה בתום תקופה זו. לאחר מכן, צלמו חמישה שדות של תאים חיוביים ל-CFSE בכל תא, תוך בחירה אקראית של השדות כדי לקבל את ספירת התאים לאחר הזרימה. עבור סטימולציה ב-PMA, סטימולו מבחנה אחת של תאי T באמצעות PMA כדי שתשמש כביקורת חיובית מיד לפני טעינת תאי ה-T לתא הזרימה השני לצורך הדמיה, כפי שהודגם כעת.עבור גרייה של SDF-1 alpha, הסר תחילה שלוש מנות של 70 microliter של מצע מהמאגר של הפלט של התא השלישי, ולאחר מכן הוסף 70 microliter של SDF-1 alpha למאגר הקלט. לאחר חמש דקות, השלך שלוש מנות של 70 microliter מהמאגר של הפלט, והוסף את שאר מבחולת תאי ה-T לצורך דימות, כפי שהודגם כעת. בתמונות מייצגות אלו, ניתן להבחין במספר דומה של תאי T לפני זרימה תחת תנאי גרייה שונים.לאחר חמש דקות של מאמץ גזירה רציף, מספר תאי ה-T הדבקים עולה בתנאי גירוי של PMA ו-SDF-1 alpha, בעוד שמספר מצומצם של תאי T לא מגורים נותרים דבקים. למעשה, הפעלה של תאי T על ידי SDF-1 alpha, למשל, משרה עלייה של כמעט פי שניים בהדבקות תאי T, בהשוואה לתאי הבקרה הלא מגורים. יתרה מכך, כאשר מחשבים את אחוז ההדבקות של תאי T ראשוניים של בני אדם חיוביים ל-CD3 בנוכחות או בהיעדר SDF-1 alpha, נמצא כי 15% מהתאי ה-T הלא מגורים נדבקים תחת מאמץ גזירה, בהשוואה ל-50% מתאי ה-T תחת תנאי הפעלה של SDF-1 alpha.לאחר שליטת המשתמש בטכניקה זו, ניתן להרחיב אותה באופן סביר לשישה תאי ניסוי בבדיקה אחת. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לעבוד אך ורק עם שכבה אחת רצופת (confluential) של תאי ICAM. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון ניתוח צורת התא, על התמונות שצולמו כדי להשיב על שאלות נוספות.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת היצמדות תאים בתנאי מאמץ גזירה. תודה שצפית בסרטון זה, ובהצלחה בניסויים שלך.

assay-adhesion-under-shear-stress-for-study-t-lymphocyte-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

תדירות הדבקה assay למדידת קולטן ליגנד קינטיקה אינטראקציה כאשר הן מולקולות מעוגנים על פני השטח של התאים אינטראקציה מתוארת. Assay זה מכני מבוסס מודגמת באמצעות micropipette-בלחץ דם אנושי תא אדום כמו חיישן הידבקות integrin αLβ2 ו מולקולה-1 הדבקה אינטר כמו אינטראקציה קולטנים ligands.

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

גיוס יקוציט אל הכבד מתרחש בתוך הערוצים מיוחדים של sinusoids הכבד שקירותיו מכוסים על ידי תאי אנדותל סינוסי כבד ייחודיים. מיקרוסקופ לעומת השלב של גיוס יקוציט פני האנדותל סינוסי בכבד אדם בתנאים של לחץ גזירה פיסיולוגי יכול להקל על הבהרת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תהליך זה.

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

assay הידבקות סטטית הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש מודל האינטראקציות בין לימפוציטים מסוג T וסוגי תאים אחרים. אינטראקציות מופקות על ידי הזרקת תאי T שכותרתו לתוך הבארות מצופים במולקולות הדבקות, ואילו קורא צלחת משמש לכמת את מספר התאים חסיד הבאים שוטף סדרתי.

סטטי הידבקות Assay לחקר Integrin ההפעלה בT לימפוציטים

אנו מתארים פרוטוקול לניטור ניידות רדיאלית של תאים חיסוניים שאינם נצמדים במבחנה באמצעות מנגנון סעפת/החלקה של שקיעת תאים. נדידת תאים עוקבת אחר חד-שכבות של תאי גידול או על חלבוני מטריצה חוץ-תאיים. בדיקה במיקרוסקופ אור ופלואורסצנטי מאפשרת התבוננות בניידות התא ובתפקוד הציטוטוקסי.

מחוגי ניידות ותפקוד ציטוטוקסיות של retroviral מעתיקה וקטור transduced, שאינם חסיד Alloresponsive T לימפוציטים

כאן אנו מתארים מבחן כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (HPLC-MS/MS) בעל ביצועים גבוהים לכימות הטקרולימוס המדכא את מערכת החיסון בכתמי דם מיובשים באמצעות שלב ידני פשוט של משקעי חלבון וחילוץ עמודות מקוון.

כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS

אנו מדווחים על שיטה במבחנה המאפשרת לכמת את המספר האמיתי של תאי דבק בתוך חד-שכבת תא אנדותל.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

הידבקויות פני התא הם מרכזי mechanotransduction, כפי שהם לשדר מתח מכני ליזום את מסלולי איתות מעורבים הומאוסטזיס ופיתוח רקמות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח את התהליכים הביוכימיים אשר מופעלים בתגובה מתח, באמצעות microbeads מגנטי מצופה ליגנד ויישום כוח לקולטנים הידבקות.

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

לויקוציטים בלהיטות אינטראקציה עם טסיות הדם והתאים כלי הדם לאחר פציעה קיר הספינה או בעת דלקת. כאן, אנו מתארים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה כדי לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם.

מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד

אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים לקיר כלי הוא תנאי הכרחי בטן יונת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור assay פונקציונלי במבחנה לניתוח ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין, נוגדנים או גורמים אחרים על הדבקה תא דינמי של תאים אנושיים באמצעות addressin מצופים נימים.

אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

שיטה זו שימושית לכמת את הדינמיקה המוקדמת של הדבקה תאית והפצת תאים התלויים באנקורג ' בתוך הפיברוטין. יתר על כן, שינוי זה ניתן להשתמש כדי לחקור את ההשפעות של שינוי הומאוסטזיס מחדש על התפשטות התא ו/או הדבקה תא הקשורות מסלולים תאיים איתות.

בחינת הדינמיקה של הדבקה תאית והפצת תאים אפיתל על Fibronectin במהלך לחץ חמצוני

חקור אינטראקציות תאי T-אפיתל תחת מאמץ גזירה באמצעות מערכת זרימה עם מיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו מאפשרת כימות הידבקות תאי T והבנת מנגנוני הפעלת אינטגרינים כמו LFA1 באימונולוגיה.

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

גלה סרטונים נוספים