Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

המטרה הכללית של בדיקה זו היא לקבוע את ההשפעות של טיפולים רלוונטיים על היצמדות תאית תחת תנאי מאמץ גזירה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השליחון של תאי מערכת החיסון, כגון, אילו גורמים מתווכים את הפעלת האינטגרין. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לחקור זוגות של מולקולות היצמדות בודדות של אינטגרין במערכת זרימה שניתן לשחזר בקלות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הפעלת LFA1, ניתן להחיל אותה גם על חקר של אינטגרינים אחרים. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה עלולים להתקשות בביצועה, מכיוון שההכנה הטכנית חייבת להיות מדויקת. כדי לקצור את תאי CHO-ICAM, יש לטפל בתרבית ב-0.5%trypsin EDTA למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר תוך써ניעור עדין.

כאשר התאים מתחילים להינתק, יש לנטרל את ה-trypsin באמצעות ארבעה מיליליטר של מצע טרי, ולספור את מספר התאים שהופרדו. יש לדלל את התאים לריכוז של 0.75 × 10⁵ תאים לתא, ולהסמיך אותם בצנטריפוגה. לאחר מכן, יש לתלה את המשקע ב-30 µl לכל תא זרימה, במצע גידול CHO-ICAM מלא, ולהזרים לאט מנות של 30 µl של תאים לכל מאגר של תא הזרימה.

הנח את התאים למשקיעה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף 200 µL של מצע תרבית מלא לשני המאגרים בכל תא, והחזר את הפלטה לאינקובטור לתרבית לילה. לאחר קציר תאי ה-T, ספור ודלל את תרחיף התאים לריכוז של 2 × 10⁶ תאים לכל תא.

לאחר מכן, סובב את התאים בצנטריפוגה ושחזר את המשקע ב-1 מ"ל של PBS, בתוספת 1% glucose עבור כל 2×10⁶ תאי T. לאחר מכן, סמן את תאי ה-T בדילול של 1 ל-1000 של CFSE, בחושך, למשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר. בסיום הדגירה, סובב את התאים בצנטריפוגה ושחזר את המשקע ב-240 µL של מצע RPMI נטול סרום לכל תא (chamber).

לאחר מכן, חלק את התאים לשפחור של 1.5 מיליליטר לכל תא, ואחסן את השפחורים בבלוק חימום בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עד לטעינה. לפני הצילום, חמם את תא הצילום החי של המיקרוסקופ ל-37 degrees Celsius, ומלא בקבוק זכוכית של 500 מיליליטר במים. הכנס שני חורים במכסה שסומנו כ-in ו-out, והעבר את צינור החיבור של המזרק דרך חור ה-in, ואת צינור החיבור של מאגר הכניסה דרך חור ה-out.

השתמש במזרק של 60 מיליליטר כדי לשטוף את צינור הכניסה עם 60 מיליליטר של מים, ולאחר מכן עם 60 מיליליטר של מצע ללא סרום בטמפרטורה של 37 degrees Celsius כדי להוציא אוויר מהמערכת. כאשר הצינור מוכן, העבר את כל מערכת הכניסה לתא הדימיג'ינג החי (live imaging chamber) של המיקרוסקופ כדי לשמור על המערכת בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. הוצא את הצינור והמזרק אל מחוץ לתא, והכנס את המזרק למשאבת המזרקים.

בשלב הבא, הכינו חור במכסה של בקבוק בנפח 250 מיליליטר שישמש כמיכל לפסולת, והעבירו את צינור המוצא דרך החור אל תוך הבקבוק. לאחר מכן, סגרו את מכסה בקבוק המוצא באופן רפוי והניחו את כל מערך המוצא בתוך תא הדימיג בזמן אמת. כעת, הניחו את שקופית תא הזרימה על משטח המיקרוסקופ, והשתמשו בעדשה של 20X כדי לקבוע את מישור המיקוד על שכבת המונו ב-CHO ICAM.

לאחר מכן, החל בקבוצת הביקורת ללא גירוי, השלך שלושה נפחים של 70 µL ממאגר המוצא של התא הראשון, והוסף שלושה נפחים של 70 µL של תאי T המסומנים ב-CFSE למאגר הכניסה. בזמן שתאי ה-T נעים מהכניסה אל המוצא, דגום תמונות של חמישה שדות אקראיים של תאי T חיוביים ל-CFSE בכל תא כדי לקבל את ספירת התאים הראשונית לפני הזרימה. לאחר מכן, חבר בו-זמנית את צינורות הכניסה והמוצא למאגרים של תא הזרימה, תוך הקפדה שלא להחדיר בועות אוויר, והתחל את זרימת מאמץ הגזירה בקצב של 0.3 mL לדקה, תוך המשך מעקב חזותי אחר תאי ה-T הצבועים ב-CFSE.

ברגע שנצפה תנועה של תאי ה-T, הפעילו טיימר לחמש דקות, והפסיקו את הזרימה בתום תקופה זו. לאחר מכן, צלמו חמישה שדות של תאים חיוביים ל-CFSE בכל תא, תוך בחירה אקראית של השדות כדי לקבל את ספירת התאים לאחר הזרימה. עבור סטימולציה ב-PMA, סטימולו מבחנה אחת של תאי T באמצעות PMA כדי שתשמש כביקורת חיובית מיד לפני טעינת תאי ה-T לתא הזרימה השני לצורך הדמיה, כפי שהודגם כעת.

עבור גרייה של SDF-1 alpha, הסר תחילה שלוש מנות של 70 microliter של מצע מהמאגר של הפלט של התא השלישי, ולאחר מכן הוסף 70 microliter של SDF-1 alpha למאגר הקלט. לאחר חמש דקות, השלך שלוש מנות של 70 microliter מהמאגר של הפלט, והוסף את שאר מבחולת תאי ה-T לצורך דימות, כפי שהודגם כעת. בתמונות מייצגות אלו, ניתן להבחין במספר דומה של תאי T לפני זרימה תחת תנאי גרייה שונים.

לאחר חמש דקות של מאמץ גזירה רציף, מספר תאי ה-T הדבקים עולה בתנאי גירוי של PMA ו-SDF-1 alpha, בעוד שמספר מצומצם של תאי T לא מגורים נותרים דבקים. למעשה, הפעלה של תאי T על ידי SDF-1 alpha, למשל, משרה עלייה של כמעט פי שניים בהדבקות תאי T, בהשוואה לתאי הבקרה הלא מגורים. יתרה מכך, כאשר מחשבים את אחוז ההדבקות של תאי T ראשוניים של בני אדם חיוביים ל-CD3 בנוכחות או בהיעדר SDF-1 alpha, נמצא כי 15% מהתאי ה-T הלא מגורים נדבקים תחת מאמץ גזירה, בהשוואה ל-50% מתאי ה-T תחת תנאי הפעלה של SDF-1 alpha.

לאחר שליטת המשתמש בטכניקה זו, ניתן להרחיב אותה באופן סביר לשישה תאי ניסוי בבדיקה אחת. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לעבוד אך ורק עם שכבה אחת רצופת (confluential) של תאי ICAM. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון ניתוח צורת התא, על התמונות שצולמו כדי להשיב על שאלות נוספות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת היצמדות תאים בתנאי מאמץ גזירה. תודה שצפית בסרטון זה, ובהצלחה בניסויים שלך.