בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד ולהרחיב תאי סטרומה גזעים מזנכימליים המופקים מרקמת שליה אנושית. שלום, אני מייק דורן. אני מוביל קבוצה באוניברסיטת קווינסלנד לטכנולוגיה במכון למחקר תרגומי בבריסביין, אוסטרליה.

שלום, שמי רבקה פלקנוס, ואני חוקרת במרכז למחקר קליני של אוניברסיטת קווינזלנד. היום אדגים את הליך בידוד ה-MSC. השילייה נזרקת בדרך כלל לאחר הלידה.

מכיוון שמשקל הרקמה הוא בין 5 ל-700 גרם, היא מהווה מקור גדול וייחודי לתאי גזע מזנכימליים אלוגנאיים. בדרך כלל, חוקרים שאינם מנוסים בבידוד MSC משיליה יתקלו בקשיים בשל חוסר היכרות עם האנטומיה של השליה, עם אופן עיבוד הרקמה, ועם סוג התאים, אימהיים או עובריים, שיאכלסו את תרבית ה-MSC הסופית שלהם. כדי לסייע לחוקרים, אנו דנים בפרטים חשובים אלו בסרטון זה.

השלב הראשון בהליך זה הוא הכרת האנטומיה של השליה. השלב השני בהליך זה הוא הפרדה ידנית של 10 גרם רקמה מהדצידואה (decidua), מהסיסי הכוריון (chorionic villi) או מהלוח הכוריוני (chorionic plate), באמצעות מספריים. שני השלבים הראשונים מסוכמים כאן שוב באופן סכמטי.

בשלב השלישי, רקמות הדסידואה (decidua), השעריות הכוריאליות או רקמות הפלטה הכוריאלית נקטעות במיסור נוסף לחתיכות קטנות בעזרת מספריים. בשלב הרביעי, תאים משוחררים מחתיכות הרקמה הקטנות באמצעות עיכול של שעה עד שעתיים ב-dispase ו-collagenase I. בשלב החמישי, התאים מופרדים מהרקמה הסיבית על ידי שטיפתם דרך מסננת תאים. לאחר מכן התאים נאספים, מושעים מחדש במצע גידול ומועברים לבקבוקי תרבית.

תאי סטרומה מזנכימליים, MSCs, ייבחרו על בסיס נטייתם להיצמדות לפלסטיק ויכולתם לשרוד ולהתרבות במצע תרבית התאים. לבסוף, בחלק התוצאות, ניתן לאפיין את ה-MSC שהורחבו ולאחסנם לשימוש בניסויים עתידיים. השליה היא איבר זמני המאפשר חילוף של חומרי הזנה ותוצרי פסולת בין העובר לאם במהלך ההיריון.

ניתן לאסוף את השליה בקלות ובאופן אספטי לאחר ניתוח קיסרי ולידה בטוחה של העובר. השליה מורכבת בעיקר מכלי דם וקרומים ממקור עוברי. עם זאת, היא מכילה גם מספר תאים אימהיים.

השליה מחוברת לרחם הן על ידי תאי דסידואה ממקור אימהי (מהרחם) והן על ידי טרופובלסטים פולשניים ממקור עוברי. בדרך כלל לא ניתן להבחין בעין בממשק המדויק שבין הרקמות האימהיות לעובריות. עם זאת, ניתן לזהות בקלות את הצד העוברי של השליה כצד שבו נמצא חבל הטבור.

עם לידת העובר, רק שכבה דקה של רקמת דסידואה נותרת מחוברת לשליה. באמצעות זיהוי האוריינטציה הפיזית של השליה, ניתן לאתר את שלושת הרקמות שנעקור היום. הרקמה הראשונה שתיעקר היא דסידואה אימהית.

הסימון הירוק מצביע על רקמת הדסידואה שנותרה על פני השטח לאחר השיליית השליה מדופן הרחם. הרקמה השנייה שתיגזר מהחלק הפנימי של השליה היא השעيرات העובריות (chorionic villi). אלו מסומנות בעיגולים כחולים בדיאגרמות.

הרקמה השלישית שתיאסף תהיה הפלטה הכוריונית העוברית (fetal chorionic plate). רקמה זו מסומנת בסימונים האדומים בדיאגרמות. ובכן, בואו נתחיל.

הניחו את השילייה בתוך קבנית הבטיחות הביולוגית. פתחו את קרומי העובר והכילו את חלקי השילייה: הצד העוברי עם נקודת ההחדרה של חבל הטבור, ה-chorioamniotic laeve, או שק השמיה.

בפני השפך העוברי של השילייה קיימים כלי דם גדולים ובולטים בלוח הכוריון, ועליהם קרום ייחמון, אשר שוב, ניתן להפרידו בקלות באופן מכני. הצד האימהי נמצא מול הצד העוברי, עם קוטילדונים או אונויות בולטים. ודאו שהפני השטח האימהי פונה כלפי מעלה.

גזרו חתיכות בעובי של 0.5 cm מהצד האימהי של השליה או מהדצידואה (decidua). במהלך הדיסקציה, הניחו את חתיכות הרקמה בתוך צלחית פטרי המכילה תמיסת מלח מאוזנת של הנק (Hank's Balanced Salt Solution), או HBSS, כדי לשמור על הרקמות רטובות. נערנערו את הרקמות בצלחיות עם HBSS כדי להסיר חלק מהדם.

העבירו כמות מספקת של רקמה כדי למלא את השפופרת עד לסימון של 10 milliliter בשפופרת של 50 milliliter, כ-10 grams. שימו לב, ניתן לבודד יותר רקמה בשלב זה אם נדרשים תאים נוספים בסוף הפרוצדורה. ודאו שהפני העובר פונים כלפי מעלה.

הסר באופן מכני את קרום האמניוטי מהפני המטרי של השליה, תוך השארת הלוח הכוריאלי שלם. חתוך את הלוח הכוריאלי לרצועות בעומק של כחצי סנטימטר לתוך רקמת השעירים שמתחתיו. לאחר מכן, בצע דיסקציה של רקמת השעירים הכוריאלית בעומק של כסנטימטר אחד לתוך השליה, מהמקום שבו הוסר הלוח הכוריאלי.

הניחו את הרקמות ב-HBSS ומדדו כ-10 מיליליטר של הרקמה כפי שנעשה קודם לכן. העבירו את חתיכות הרקמה, עם העברה מינימלית של נוזלים, לפטריה של 10 סנטימטרים וקצצו למקטעים דקים של כמיליליטר מעוקב אחד, באמצעות מספריים. העבירו את הרקמה הקצוצה חזרה למבחנה של 50 מיליליטר.

חזור על הפעולה עבור כל שאר דגימות הרקמה. הוסף את מצע העיכול שהוכן טרי ביחס של לפחות אחד לאחד לרקמה. הפוך את המבחנה מספר פעמים כדי לערבב.

דגרו את הרקמות במבחנה עם תוך עיכול למשך שעה עד שעתיים, בטמפרטורה של 37 מעלות באינקובטור רועש. כאשר תמיסת עיכול הרקמה שינתה את מראהו למעיקר, וכלי דם לבנים היו גלויים בתמיסה, הוסיפו 15 milliliters של HBSS כדי לדלל את האנזימים בתוך העיכול. בצעו סבב קצר של צנטריפוגה לדגימות רק עד שהצנטריפוגה תגיע ל-340 g למשך חמש שניות, ולאחר מכן הפסיקו.

פעולה זו תגרום לשאריות הגדולות להיאסף בתחתית המבחנה. החזירו את הדגימות למCבטחת הביולוגית. הניחו מסנן תאים בתוך מבחנה חדשה של 50 milliliter.

העבירו בפיפטה את העל-נוזל המכיל את התאים החד-גרעיניים אל המסננת, ואספו את התסנין לשפופרת חדשה. השאירו את שאריות רקמת השליה בשפופרת הראשונה. הוסיפו 15 milliliters של HBSS לשאריות השליה, נערה בעוצמה כדי להשיג תאים נוספים, ובצעו סבב קצר של צנטריפוגה לדגימה.

שוב, העבירו בעזרת פיפט את הנוזל העליון למבחנה עם מסנן התאים הנמצאת בתוך מבחנת האיסוף. בהתאם לסמיכות הדגימה, ייתכן ששפיכת הנוזל העליון ישירות אל מסנן התאים תהיה מתאימה יותר. שטפו את מסנן התאים ב-5 milliliters של HBSS.

השליכו את המבחנה המכילה את שאריות רקמת השליה. סבבו את דגימת הנוזל העליון (supernatant) בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-340 g כדי להשקיע את התאים. תאי הדם האדומים נראים כשכבה בתחתית המשקע, והתאים החד-גרעיניים, כולל ה-MSCs, מהווים את השכבה הבהירה יותר שמעל תאי הדם האדומים.

החזירו את הדגימות לקבינה לבטיחות ביולוגית. שפכו בזהירות את העילוי והשליכו אותו. נקשו עם האצבע מספר פעמים על השפופרת כדי לשחרר את משקע התאים, ותוהילו מחדש את משקע התאים ב-35 milliliters של מצע MSC.

העבירו את תרחיף התאים לבקבוק T175 אחד לכל 10 mils של רקמה, והדריגו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות עם 5%CO2. לאחר הבידוד, החליפו את מצע התרבית לאחר 48 שעות. האכילו את התרביות פעם בשבוע עד להגעה למצב של התמזגות (confluency).

התרביות אמורות להגיע למצב של התמזגות (confluence) תוך כ-14 ימים. לבסוף, הרחב והקפא את התאים, נתח את מאפייני ה-MSC והשתמש בהם בניסויים. לאחר 48 שעות של תרבית, תאי ה-MSC יהיו דבוקים לפלסטיקה של תרבית הרקמה, בעוד שתאי המטופואטיים ואוכלוסיות תאים אחרות לא יהיו דבוקים.

בשלב זה, מחליפים את המצע ב-35 milliliters של מצע גידול טרי. מראה של על-נוזל התרבית עשוי להשתנות באופן משמעותי בין תורמי שליה שונים. דוגמה אחת ושתיים מדגימות וריאציה זו.

שתי בידודים אלו בוצעו בו-זמנית, אך משתי שליות שונות. לאחר שטיפה, התרביות נקיות מתאי דם אדומים ושאריות רקמה כפי שמוצג בדוגמה שלוש, ותוצאות ההתרחבות העוקבות הן בדרך כלל עקביות. לאחר החלפת המצע לאחר 48 שעות, רק תאים בודדים נצמדים לבקבוק.

שבעה ימים לאחר הבידוד, מושבות של MSC פיברובלסטיות נראות לעין, אם כי נוכחים גם תאים שאינם MSC, כתאים עגולים או תאים בעלי היצמדות רופפת. 13 ימים לאחר הבידוד, מושבות ה-MSC הפיברובלסטיות גדולות, ולעתים קרובות השכבה החד-שכבתית (monolayer) של ה-MSC תהיה בעלת התכנסות (confluence) מספיקה ומוכנה למעבר (passage). החל מהמעבר הראשון ואילך, השכבה החד-שכבתית של ה-MSC מפתחת מורפולוגיה אופיינית דמוית מערבולת בעת התכנסות.

תאי MSC של השילייה מציגים פרופיל סמני MSC קלאסי בניתוח flow cytometry. התאים חיוביים ל-CD73, CD105 ו-CD90, ושליליים לסמנים ההמטופויטיים CD45, CD34 ו-HLA-DR. תאי MSC של השילייה עוברים בדרך כלל דיפרנציאציה אוסטאוגנית חזקה אך דיפרנציאציה אדיפוגנית חלשה.

פרסומים רבים מניחים שתאים המבודדים מהכוריון העוברי מניבים MSC עובריים לאחר תרבית. עם זאת, כפי שדיווחנו בעבר, כל התרביות שהופקו מהכוריון העוברי באמצעות פרוטוקול זה הופכות במהירות למעשירות ב-MSC אימהיים, כפי שניתן לצפות בתרביות MSC דסידואליות אימהיות. הנתונים המוצגים כאן מכמתים את הרכב התאים העובריים והאימהיים של תרביות MSC של השליה שבודדו מרקמות דסידואליות, מזקילי הכוריון ומלוחית הכוריון.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודלים ומגדלים MSC המופקים מרקמת שליה. אנו מקווים שתמצאו שיטות אלו מועילות במחקרים שלכם וביישומים קליניים שעשויים להשתמש ב-MSCs המופקים משליה.