בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולהרחיב תאי סטרומה גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שליה אנושית. היי, אני מייק דוראן. אני ראש קבוצה באוניברסיטת קווינסלנד לטכנולוגיה במכון למחקר תרגומי בבריסביין, אוסטרליה.

היי, שמי רבקה פלקנוס, ואני חוקרת במרכז למחקר קליני באוניברסיטת קווינסלנד. היום, אדגים את נוהל הבידוד של MSC. השליה מושלכת בדרך כלל לאחר הלידה.

מכיוון שמשקל הרקמה הוא חמישה עד 700 גרם, היא מציעה מקור גדול וייחודי של תאי גזע מזנכימליים אלוגניים. בדרך כלל, אנשים חדשים בבידוד MSC שליה יתקשו מכיוון שהם אינם מכירים את האנטומיה של השליה ואינם מכירים כיצד לעבד את הרקמה ואינם מכירים איזה סוג של תאים, אימהיים או עובריים, יאכלסו את תרבית ה-MSC הסופית שלהם. כדי לסייע לחוקרים, אנו דנים בפרטים החשובים האלה בסרטון זה.

השלב הראשון בהליך זה הוא להתמצא באנטומיה של השליה. השלב השני בהליך זה הוא ניתוח ידני של 10 גרם רקמה מהדצידואה, הווילי הכוריוני או הצלחת הכוריונית, באמצעות מספריים. שני השלבים הראשונים מסוכמים כאן שוב באופן סכמטי.

בשלב השלישי, הדצידואה, הווילי הכוריוני או רקמות הצלחת הכוריונית נטחנים עוד יותר לחתיכות עדינות בעזרת מספריים. בשלב הרביעי, התאים משוחררים מחתיכות הרקמה הקטנות באמצעות עיכול של שעה עד שעתיים בדיספאז וקולגנאז I.In שלב חמישי, התאים מופרדים מהרקמה הסיבית על ידי שטיפתם דרך מסננת תאים. לאחר מכן התאים נאספים, מושעים מחדש במדיום תרבית ומוכנסים לצלוחיות תרבית.

תאי סטרומה מזנכימליים, MSCs, ייבחרו על סמך נטייתם להיצמדות פלסטית ויכולתם לשרוד ולהתרבות במדיום תרבית התאים. לבסוף, בסעיף התוצאות, ניתן לאפיין את ה-MSC המורחב ולאחסן אותו לשימוש בניסויים עתידיים. השליה היא איבר זמני המאפשר חילופי חומרים מזינים ומוצרי פסולת בין העובר לאם במהלך ההריון.

ניתן לאסוף את השליה בקלות באופן אספטי לאחר ניתוח קיסרי ולידה בטוחה של התינוק. השליה מורכבת בעיקר מכלי דם וממברנות שמקורן בעובר. עם זאת, הוא מכיל גם כמה תאים אימהיים.

השליה מחוברת לרחם הן על ידי תאים דצידואליים אימהיים, שמקורם ברחם והן על ידי טרופובלסטים פולשים שמקורם בעובר. בדרך כלל לא ניתן להבחין בעין בממשק המדויק בין רקמת האם לרקמת העובר. עם זאת, הצד העוברי של השליה מזוהה בקלות כצד בו נמצא חבל הטבור.

כאשר התינוק נולד, נשארת רק שכבה דקה של רקמה דשרונית המחוברת לשליה. באמצעות התמצאות פיזית של השליה, ניתן לאתר את שלוש הרקמות שנקצר היום. הרקמה הראשונה שתיקצר היא דצידואה אימהית.

הסמן הירוק מצביע על הרקמה העשרונית שנשארת על פני השטח לאחר שהשליה נשפכת מדופן הרחם. הרקמה השנייה שתיקצר מהחלק הפנימי של השליה היא הווילי הכוריוני העוברי. זה מסומן על ידי העיגולים הכחולים בתרשימים.

הרקמה השלישית שתיקצר תהיה צלחת כוריונית עוברית. רקמה זו מזוהה על ידי הסמנים האדומים בתרשימים. אוקיי, בואו נתחיל.

הנח את השליה בארון הבטיחות הביולוגי. פתחו את קרומי העובר והתמצאו בחלקי השליה. הצד העוברי עם החדרת חבל הטבור, שכבת מי השפיר או שק מי השפיר.

על פני השטח העובריים של השליה יש כלי דם גדולים ברורים בצלחת הכוריונית, עם קרום מי שפיר מעליו, אשר, שוב, מופרד בקלות מכנית. הצד האימהי מנוגד לצד העוברי, עם הקוטילדון או האונות הברורות. ודא שהמשטח האימהי פונה כלפי מעלה.

חותכים חתיכות בעובי 0.5 ס"מ מהצד האימהי של השליה או הדצידואה. במהלך הנתיחות, הניחו חתיכות טישו בצלחת פטרי המכילה את תמיסת המלח המאוזנת של האנק, או HBSS, כדי לשמור על הרקמות רטובות. מערבבים את הרקמות בכלים עם HBSS כדי להסיר מעט דם.

העבירו מספיק רקמה כדי למלא את הצינור עד לסימן 10 מיליליטר של צינור של 50 מיליליטר, כ -10 גרם. שימו לב, ניתן לבודד רקמות נוספות בשלב זה אם נדרשים תאים נוספים בסוף ההליך. ודא שמשטח העובר פונה כלפי מעלה.

הסר מכנית את קרום מי השפיר משטח העובר של השליה, והשאיר את הצלחת הכוריונית שלמה. חותכים את הצלחת הכוריונית לרצועות בעומק של כחצי סנטימטר לתוך רקמת הווילוס שמתחת. לאחר מכן, נתחו רקמת וילי כוריונית כסנטימטר אחד עמוק לתוך השליה ממנה הוסרה הצלחת הכוריונית.

הכניסו את הרקמות ל-HBSS ומדדו כ-10 מיליליטר מהרקמה כפי שנעשה בעבר. מעבירים חתיכות רקמה, עם העברת נוזלים מינימלית, לצלחת פטרי של 10 סנטימטר וקוצצים לחתיכות דקות כמיליליטר מעוקב, בעזרת מספריים. מעבירים את הרקמה הטחונה בחזרה לצינור של 50 מיל.

חזור על הפעולה עבור כל דגימות הרקמה הנותרות. הוסף את אמצעי העיכול הטריים שהוכנו ביחס של אחד לאחד לפחות עם הרקמה. הפוך את הצינור מספר פעמים לערבוב.

דגרו את הרקמות בצינור עם מצע עיכול למשך שעה עד שעתיים, בטמפרטורה של 37 מעלות באינקובטור רועד. כאשר תמיסת עיכול הרקמות השתנתה למראה מעונן, וכלי דם לבנים היו ברורים בתמיסה, הוסף 15 מיליליטר של HBSS כדי לדלל את האנזימים באמצעי העיכול. צנטריפוגה דופקת בקצרה את הדגימות רק עד שהצנטריפוגה מגיעה ל -340 גרם למשך חמש שניות, ואז עצור.

זה יאלץ את הפסולת הגדולה להצטבר בתחתית הצינור. החזר דגימות לארון הבטיחות הביולוגי. הנח מסננת תאים לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר.

פיפטה הסופרנטנט המכיל את התאים החד-גרעיניים לתוך המסננת, ותופס את הפליטה בצינור החדש. השאירו את פסולת רקמת השליה מאחור בצינור הראשון. הוסף 15 מיליליטר של HBSS לפסולת השליה, נער במרץ כדי לשחזר תאים נוספים ודפק צנטריפוגה את הדגימה.

שוב, הכניסו את הסופרנטנט לתוך הצינור עם מסננת התאים בצינור האיסוף. שפיכת הסופרנטנט לתוך מסננת התאים עשויה להיות מתאימה יותר, בהתאם לעקביות הדגימה. שוטפים את מסננת התאים עם 5 מיליליטר HBSS.

השליכו את הצינור המכיל את פסולת רקמת השליה. צנטריפוגה את דגימת הסופרנטנט למשך חמש דקות ב-340 גרם כדי לגלול את התאים. תאי הדם האדומים נראים כשכבה בתחתית הגלולה, והתאים החד-גרעיניים, כולל MSCs, הם השכבה הקלה יותר על גבי תאי הדם האדומים.

החזר דגימות לארון הבטיחות הביולוגי. שפכו בזהירות את הסופרנטנט והשליכו. העבירו את הצינור מספר פעמים באצבע כדי להוציא את גלולת התא, והשעו מחדש את גלולת התא ב-35 מיליליטר של מדיה MSC.

העבירו את תרחיף התאים לבקבוק T175 אחד לכל 10 מיל רקמה, ותרבית באינקובטור של 37 מעלות עם 5% CO2. לאחר הבידוד, החליפו את אמצעי התרבות לאחר 48 שעות. האכילו את התרביות פעם בשבוע עד להתלכדות.

תרביות צריכות להיות מתכנסות בכ -14 יום. לבסוף, הרחב ושימור בהקפאה של תאים, ניתוח מאפייני MSC ושימוש בניסויים. לאחר 48 שעות של תרבית, MSC יתחבר לפלסטיק תרבית הרקמה, בעוד שאוכלוסיות תאים המטופויאטיות ואחרות לא יהיו.

בשלב זה, המדיום מוחלף ב -35 מיליליטר של מדיום תרבות טרי. המראה של הסופרנטנט התרבית יכול להשתנות באופן מהותי בין תורמי השליה. דוגמה 1 ו-2 מדגימות את השונות הזו.

שני הבידוד הללו בוצעו בו זמנית, אך משתי שליות שונות. לאחר השטיפה, התרביות נקיות מתאי דם אדומים ופסולת רקמות כפי שמוצג בדוגמה השלישית, ותוצאות ההתרחבות הבאות עקביות בדרך כלל. לאחר החלפת המדיה של 48 שעות, רק תאים בודדים מחוברים לבקבוק.

שבעה ימים לאחר הבידוד, מושבות MSC פיברובלסטיות נראות לעין, אם כי קיימים גם תאים שאינם MSC, כתאים עגולים או מחוברים באופן רופף. 13 יום לאחר הבידוד, מושבות MSC פיברובלסטיות גדולות, ולעתים קרובות השכבה החד-שכבתית של MSC מתכנסת מספיק ומוכנה למעבר. מהמעבר והלאה, החד-שכבתית של MSC מפתחת מורפולוגיה אופיינית דמוית מערבולת במפגש.

MSC השליה מציג פרופיל סמן MSC קלאסי על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה. התאים חיוביים ל-CD73, CD105 ו-CD90, ושליליים לסמנים ההמטופויאטיים של CD45, CD34 ו-HLA-DR. MSC השליה עובר בדרך כלל התמיינות אוסטאוגנית חזקה אך התמיינות אדיפוגנית גרועה.

פרסומים רבים מניחים שתאים שבודדו מהכוריון העוברי מניבים MSC עוברי בתרבית. עם זאת, כפי שדיווחנו בעבר, כל התרביות שמקורן בכוריון עוברי המשתמשות בפרוטוקול זה מועשרות במהירות עבור MSC אימהי, כפי שניתן היה לצפות עבור תרביות MSC אימהיות. הנתונים המוצגים כאן מכמתים את הרכב תאי העובר והאם של תרביות MSC השליה המבודדות מרקמות צלחת דצידואליות, כוריוניות וכוריוניות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג די טוב כיצד לבודד ולתרבית MSC שמקורו ברקמת השליה. אנו מקווים שתמצא שיטות אלה שימושיות במחקר וביישומים הקליניים שלך שעשויים להשתמש ב-MSCs שמקורם בשליה.