Name: חלון ירך דגם קאמרי In vivo מעקב תא Murine מח עצם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: חקור מעקב תאי נויטרופילים בנישה הווסקולרית של מח העצם בעכברים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה מולטי-פוטון. שיטה זו מאפשרת גישה מיקרוסקופית לטווח ארוך לחקר דינמיקת תאי חיסון ותהליכים אונקולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות מתקן מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת (www.aomf.ca) בבית רשת בריאות באוניברסיטת לסיוע עם מיקרוסקופיה, ומר ג&#39;ייסון אליס מן חנות הנסיכה מרגרט Cancer Center מכונות להכנת הב&quot;ש והשלב הדמיה. אנו רוצים גם להודות לד&quot;ר איריס Kulbatski לעריכת כתב יד.

<ol><li>Zhao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and the control of immunity.</a> Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow+contains+large+numbers+of+functionally+competent+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).</li>
<li>Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+neutrophils%3A+friend+or+foe%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated neutrophils: friend or foe?</a> Carcinogenesis. , (2012).</li>
<li>Fridlender, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+tumor-associated+neutrophil+phenotype+by+TGF-beta%3A+%27N1%27+versus+%27N2+TAN%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN.</a> Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).</li>
<li>Coffelt, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17-producing+%5Bggr%5D%5Bdgr%5D+T+cells+and+neutrophils+conspire+to+promote+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis.</a> Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).</li>
<li>Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+promotion+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell promotion of metastasis.</a> Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).</li>
<li>Granot, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+entrained+neutrophils+inhibit+seeding+in+the+premetastatic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung.</a> Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).</li>
<li>Travlos, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of the bone marrow.</a> Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).</li>
<li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li>
<li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Imaging windows for long-term intravital imaging.</a> IntraVital. 3 (2), e29917(2014).</li>
<li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. (96), e52476(2015).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+Progenitor+Cell+Rolling+in+Bone+Marrow+Microvessels%3A+Parallel+Contributions+by+Endothelial+Selectins+and+Vascular+Cell+Adhesion+Molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1.</a> J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+4-Dimensional+Tracking+of+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Adult+Mouse+Calvarial+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow.</a> J. Vis. Exp. (91), e51683(2014).</li>
<li>Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+imaging+reveals+structural+and+functional+heterogeneity+in+different+bone+marrow+compartments%3A+functional+implications+on+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells.</a> Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).</li>
<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Balan, M., Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+for+ectopic%2C+chronic%2C+intravital+multiphoton+imaging+of+bone+marrow+vasculature+and+architecture+in+split+femurs%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs.</a> IntraVital. 4 (2), e1066949(2015).</li>
<li>Hansen-Algenstaedt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femur+window--a+new+approach+to+microcirculation+of+living+bone+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ.</a> J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).</li>
<li>Xu, N., Lei, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Neutrophil+Intraluminal+Crawling%2C+Transendothelial+Migration+and+Chemotaxis+in+Tissue+by+Intravital+Video+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (55), e3296(2011).</li>
<li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li>
<li>Bucher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Ly6G+antibodies+determine+macrophage+phagocytosis+of+neutrophils+and+alter+the+retrieval+of+neutrophils+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice.</a> J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), (2013).</li>
<li>Koewler, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+Monoclonal+Antibody+Raised+Against+Nerve+Growth+Factor+on+Skeletal+Pain+and+Bone+Healing+After+Fracture+of+the+C57BL%2F6J+Mouse+Femur%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur.</a> J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).</li>
<li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).</li>
<li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+femoral+segmental+defect+model+for+bone+tissue+engineering+using+a+novel+rigid+internal+fixation+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system.</a> J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bone%2C+hemopoietic+stem+cells%2C+and+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVacaru%2C+A+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).</li>
</ol>

יש המחברים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

הדמיה בזמן אמת, סידורי של התהליכים התאיים הדינמיים במח עצם מספקת מידע כי הוא מאתגר אחרת להשיג באמצעות טכניקות קונבנציונליות כגון היסטולוגיה וספירת דם מוחלטת. מודל WC הירך המתואר כאן מספק הזדמנויות ייחודיות לחקור שינויים הסלולר מבניים במח העצם לאורך זמן. למרות מודל WC הירך דווח בעבר, עיצוב הרומן שלנו מספק בתחום הדמיה גדול מבט וגודל WC הכולל קטן יותר, אשר תואם יותר לשימוש עכברים בוגרים. מודל WC הירך ניתן להשתמש במגוון של זני עכבר כולל מערכת חיסון תקין ו / או עכברי כתב מהונדסים. ...

מוח עצם הוא איבר חשוב המעורב hematopoiesis ורגולציה חיסונית. הוא מורכב מרכיב hematopoietic המכיל תאי גזע אבות היווצרות דם (HSPCs), ומרכיב סטרומה המכיל ובתאים הלא hematopoietic כי להצמיח תאי mesenchymal 1. שני שלישים של פעילות hematopoietic מוקדש לדור של תאים מיאלואידית 2. בפרט, מספר רב של נויטרופילים מיוצר במח העצם, עם 1-2 x 10 11 תאים שנוצרו ליום בתוך אדם מבוגר נורמלי 2. נויטרופילים הם קו ההגנה הראשון מפני זיהומים מיקרוביאליים שמורות בעיקר במח העצם עד מתח מפעילה התגייסותם להשלים נויטרופילים היקפי 1,3. בנוסף להשפעות שלהם אנטי מיקרוביאליים, מחקרים אחרונים מראים תפקיד חשוב של נויטרופילים בביולוגיה סרטן, נתקל בשני פרו פנוטיפים אנטי tumorigenic תלוי צמיחה הפיכתבטא גורם (TGF-β) איתות 4,5 microenvironment הגידול. יתר על כן, מחקרים הראו כי נויטרופילים שמצטברים גידולים ראשוניים להשפעות פרו-tumorigenic ו גרורתי ידי דיכוי הפונקציה ציטוטוקסיות של תאי T 6,7, תוך נויטרופילים במחזור להפעיל ציטוטוקסיות, אנטי-גרורתי השפעה 8. ככזה, החקירה של תאי hematopoietic במח העצם, במיוחד נויטרופילים, היא חיונית כדי הבהרת תפקידם בתקנה חיסונית גידול. Histopathology וספירת דם היקפית מלאה משמשים באופן שיגרתי כדי להעריך שינויים הסלולר מבניים מח עצם 9. עם זאת, שיטות אלה רק לספק מידע סטטי של אוכלוסיות תאים שונות או microstructures רקמות. אורך in vivo הדמיה ניתן להשתמש בשילוב עם השיטות הסטנדרטיות כדי להעריך את הדינמיקה של מרכיבים תאיים, כלי דם ואת סטרומה מרובים וכן תא אל גאינטראקציות ell באופן אורכי. מיקרוסקופיה Intravital (IVM), מוגדר הדמיה של חיים חיים ברזולוציה מיקרוסקופית 10, הוא שימושי במיוחד להערכת תהליכים תאיים דינמיים לאורך זמן באותו המדגם, צמצום מספר בעלי חי ניסוי הנדרש. IVM היא לעתים קרובות בשילוב עם תא חלון מושתלים כרוני (WC) לגשת איבר עניין הדמיה במשך זמן של שבועות עד חודשים. מודלי WC גולגולתי ו-skinfold הגבו יש את ההיסטוריה הארוכה ביותר של שימוש שראשיתה אמצע 1990. לאחרונה, מודלים WC איבר ספציפי אחרים כגון אלה של כרית שומן החלב ואת אברי הבטן השונים פותחו 11. הגישה הטיפוסית הדמית מח עצם in vivo יש בעיקר מעורבת חשיפת מִכסֵה הַגוּלגוֹלֶת של עכברים, שם העצם הדליל מאפשר הדמיה ישירה של תאים בודדים עם התערבות כירורגית מינימאלית 12-14. עם זאת, מח עצם calvarial עשוי bדואר שונה מזו של עצמות אחרות, כגון עצם הארוך, כפי שהוכח על ידי מספר נמוך יותר של HSPCs ותאי היפוקסי ב מִכסֵה הַגוּלגוֹלֶת, מעידה מופחתת תחזוקה ופיתוח של HSPCs 15. לכן, גישות חלופיות להערכת מרכיבים תאיים ב העצם הארוך נחקרו. אלה כוללים חשיפה ישירה של מח עצם ירך 16 והשתלות אקטופי של ירך פילוג skinfold הגבה בב&quot;ש 17. עם זאת, לשעבר הוא הליך מסוף שאינו מאפשר מעקב של שינויים הסלולר, מבניים ותפקודיים לאורך תקופות זמן ארוכות, ואת הסיכוי האחרון מפריע פונקצית מח עצם נורמלית עקב השתלת עצם הירך לאתר אקטופי בתוך WC הגבה skinfold. שיטה נוספת המאפשרת הדמיה סדרתי orthotopic של מח עצם הירך לאורך זמן הוא השימוש של WC בעצם הירך. בדוח הקודם אחת הפגינו הדמיה לטווח ארוך מיקרו מחזורי במח העצם הירך באמצעותירך WC בעכברים 18. בנוסף, החוקרים הדגימו ויזואליזציה של תאים סרטניים בעצם הירך, המציין השירות שלה גרור במח עצם ניטור. עם זאת, עיצוב בב&quot;ש זה היה מוגבל על ידי גודל גדול שלה (בקוטר 1.2 ס&quot;מ) ואזור הדמיה קטן יחסית (4 מ&quot;מ קוטר), אשר היה מתאים רק עכברים גדולים (26-34 גרם, 3-6 חודשים של גיל) ובכך להפוך את להתקרב מעשי לשימוש שגרתי. לכן, אסלה חדשה עם גודל כולל קטן ואזור הדמיה הפנימית גדול נועדו לצורך מחקר זה. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לקבוע שיטת הדמית סוגי תאים שונים במח עצם הירך. מודל WC הירך פותח בתוך הבית ושמש לדמיין ולעקוב אחר נויטרופילים בתוך רשת כלי דם 3D. באמצעות מודל זה, IVM של מח העצם ניתן לבצע באופן סדרתי על 40 ימים. גישה זו ניתן ליישם במגוון תחומי הבהרת תהליכי hematopoiesis, תקנה חיסוניתהתפתחות גידולים nd.

<table><tbody><tr><td>עכברים עירומים אתימיים NRCNU-F</td><td>Taconic</td><td>Ncr עירום</td><td>בן 8-10 שבועות, נקבת</td></tr><tr><td>מלח</td><td>בקסטר</td><td>JB1302P</td><td></td></tr><tr><td>קטמין הידרוכלוריד</td><td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.&nbsp;</td><td>DIN 01989529</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>וילון כירורגי</td><td>פרוקסימה</td><td>DYNJP2405</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום חשמלית</td><td>Life Brand</td><td>57800827375</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>Leica M60</td><td></td></tr><tr><td>משחת עיניים (ג'ל דמעות)</td><td>נוברטיס&nbsp;</td><td>T296/2</td><td></td></tr><tr><td>7.5% בטדין</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>70% אלכוהול איזופרופיל</td><td>GreenField</td><td>P010IP7P</td><td></td></tr><tr><td>10% betadine</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-150-05</td><td></td></tr><tr><td>ידית אזמל Fine</td> <td>Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל (#15)</td><td>VWR</td><td>89176-368</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיציים מעוקלים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>תינוק-מיקסטר Hemostat</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים במיוחד כלים</td><td>למדע עדין</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>המוסטטים של יתושים Halsted-Mosquito</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מקדחה</td><td>הרווארד Apparaus</td><td>72-6065</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מקדחה קוצים</td><td>Fine Science</td><td>Tools 19007-14</td><td></td></tr><tr><td>תא חלון עצם הירך</td><td>חנות מכונות PMCC</td><td>עיצוב מותאם אישית</td><td>9.1 מ"מ- 8.5 מ"מ- 7.5 מ"מ (קוטר חיצוני לפנימי), 2.16 מ"מ (רדיוס של שני חורים), 13.9 מ"מ (מרחק בין שני חורים), 0.7 מ"מ (עובי)</td></tr> <tr><td>בר בצורת U</td><td>חנות מכונות PMCC</td><td>עיצוב</td> <td>מותאם אישית13.8 מ"מ (אורך), 1.6 מ"מ (רוחב), 3.7 מ"מ (גובה)</td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית (8 מ"מ)</td><td>וורנר אינסטרומנטס&nbsp;</td><td>HBIO 64-0701 CS-8R</td><td></td></tr><tr><td>טבעת שמירה (8 מ"מ)</td><td>ACKLANDS GRAINGER</td><td>UNSPSC #</td><td></td></tr> 31163202 <tr><td>אגוזים (נירוסטה משושה)</td><td>Fastenal</td><td>70701</td><td></td></tr><tr><td>צמנט דנטלי</td><td>3M</td><td>RelyX U200</td><td></td></tr><tr><td>תפר (5-0 שחור מודולר)</td><td>Covioien</td><td>SN-5698</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט Halsey</td><td>Fine Science Tools</td><td>12501-13</td><td></td></tr><tr><td>בופרנורפין (טמגסיק)</td><td>רקיט בנקיזר</td><td>DIN 0281251</td><td></td></tr><tr><td>מלוקסיקם (Metacam)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>DIN 02240463</td><td></td></tr><tr><td>אמוקסיצילין (Clamavox)</td><td>פייזר</td><td>DIN</td> 02027879-FITC-Dextran <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>APC- אנטי-עכבר Ly-6G (Gr-1)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-9668</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דו-פוטוני LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td></td></tr><tr><td>שלב הדמיה</td><td>חנות מכונות PMCC</td><td>עיצוב מותאם אישית</td><td>15.9 ס"מ (אורך), 11 ס"מ (רוחב), 0.9 ס"מ (גובה)</td></tr> <tr><td>תוכנת אימאריס</td><td>Bitplane</td><td>Imaris 8.0</td> תוכנת <td>ניתוח תמונה המתוארת בסעיף 3 לפרוטוקול&nbsp;</td></tr><tr><td>Zen 2012</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2012</td><td>תוכנת רכישת תמונות המתוארת בסעיף 2 של הפרוטוקול&nbsp;</td></tr></tbody></table>

חלון ירך דגם קאמרי<em&gt; in vivo</em&gt; מעקב תא murine מח עצם

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

מח עצם הוא איבר מורכב המכיל תאים המטופויאטיים ולא המטופויאטיים שונים. תאים אלה מעורבים בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל המטופואיזה, ויסות חיסוני וויסות גידולים. שיטות נפוצות להבנת פעולות תאיות במח העצם, כגון היסטולוגיה וספירת דם, מספקות מידע סטטי במקום ללכוד את הפעולה הדינמית של רכיבים תאיים מרובים in vivo. כדי להשלים את השיטות הסטנדרטיות, פותח מודל מבוסס תא חלון (WC) כדי לאפשר הדמיה סדרתית in vivo של תאים ומבנים במח העצם של העכבר. פרוטוקול זה מתאר הליך כירורגי להתקנת האסלה בעצם הירך, על מנת לאפשר גישה אופטית ארוכת טווח למח עצם הירך. בפרט, כדי להדגים את התועלת הניסיונית שלה, נעשה שימוש בגישת WC זו כדי לדמות ולעקוב אחר נויטרופילים בתוך רשת כלי הדם של עצם הירך, ובכך סיפקה שיטה חדשה להמחשה וכימות של סחר וויסות תאי חיסון במח העצם. ניתן ליישם שיטה זו כדי לחקור תהליכים ביולוגיים שונים במח העצם של העכבר, כגון המטופואיזיס, השתלת תאי גזע ותגובות חיסוניות במצבים פתולוגיים, כולל סרטן.

מח עצם ירך Murine הוא לגשת בהצלחה באמצעות WC לאפשר ויזואליזציה של נויטרופילים פרט רשתות כלי דם. איור 1 מציג את מכשיר WC ומתאר את ההליך כירורגי, אשר כרוך בחשיפה של העצם ודילול הירך של עצם קורטיקלית כדי לקבל גישה אופטית בתוך עצם. הניתוח ונסבל היטב עכברים; הם עברו הערכה תגובות פיזיות שליליות, כגון נפיחות הגפיים האחוריות, הלא נושאת משקל על הגפיים, פגיעה עצמית, צלוליטיס דרמטיטיס, כמו גם נזק בב&quot;ש במשך 5 ימים לאחר הניתוח, ללא דיווח ע...

הפרוטוקול מתאר מודל חדש של תא חלון עצם הירך של עכברים שניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר תנועת תאים במח עצם הירך in vivo. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רב-פוטונית תוך-חיונית משמשת להדמיית שלושה מרכיבים של מח עצם הירך (כלי דם, מטריצת קולגן ונויטרופילים) לאורך זמן.

חלון ירך דגם קאמרי<em&gt; In vivo</em&gt; מעקב תא Murine מח עצם

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע דימות מיקרוסקופי ומעקב ארוך טווח של נויטרופילים במבנים כליים בתוך מח העצם של עכבר, באמצעות תא חלון כרוני מושתל מעל עצם הירך. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח באימונולוגיה ובאונקולוגיה בנוגע לתפקידם של מונוציטים בבקרת זיהום, בתהליכי קרצינוגנזה ובגרורות גידולים. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת גישה מיקרוסקופית ארוכת טווח למח העצם של הירך, אתר מרכזי של המטופואזיס, ומספקת מידע דינמי שקשה להשיגו בדרכים אחרות באמצעות שיטות קונבנציונליות.אף ששיטה זו ספציפית לדימות נויטרופילים בתוך רשת כלי דם, ניתן להשתמש בה גם להדמיה של אוכלוסיות תאי חיסון אחרות בעלות עניין. ביום הניתוח, ודאו את רמת הסדציה המתאימה על ידי היעדר תגובה לצביטה בבהו של עכבר עירום אתמי (athymic nude mouse). לאחר מכן, הניחו את העכבר על משטח חימום חשמלי, מכוסה בסדין כירורגי, תחת מיקרוסקופ סטריאו.בשלב הבא, מרחו משחה על עיני בעל החיים, ועקרו את אזור הניתוח באמצעות שתי נגבים רצופים של 7.5% povidone-iodine, 70% isopropyl alcohol ו-10% povidone-iodine. לאחר הכנת בעל החיים, השתמשו בסקאלפל עם להב מספר 15 כדי לבצע חתך עורי אורכי של 10 millimeter לכיוון ה-femur מהצד הלטראלי. לאחר מכן, בצעו דיסקציה קהה באמצעות פינצטה וקליפסים (hemostats) כדי לחשוף את ה-femur בין שרירי הכפיפה (flexor) והפשיטה (extensor).כאשר ניתן להבחין בעצם הירך (femur), הכנסו מוט בצורת U מתחת לעצם והתקינו את תא החלון (window chamber). בעזרת שני אומים, הדקו את המוט לחלון. לאחר מכן, הדקו את האומים באמצעות פינצטה.השתמשו בפינצטה כדי להחזיר את שרירי הכופפים והפושטים למיקומם המקורי. מלאו את הרווח שבין העצם לתא החלון (window chamber) במלט דנטלי כדי לקבע את תא החלון במקומו. לאחר מכן, השתמשו במקדח מיקרוסקופי כדי לשחוק שטח של 6 על 2 מילימטרים בעצם הקורטיקלית כדי להשיג גישה אופטית לחלל המוח (marrow cavity).לאחר שהושגה שכבת פריוסטה (periosteal layer) שקופה כמעט של העצם, הנח זכוכית כיסוי של שמונה מילימטרים על פתח החלון, והשתמש בטבעת קיבוע (snap ring) כדי להבטיח את זכוכית הכיסוי במקומה. כעת, סגור את הדרמיס באמצעות תפר 5-0 ומחזיק מחטים. לאחר מכן, העבר את העכבר לכלוב חדש עם מצע נקי, והשגח אותו עד להחלמתו המלאה.כדי לקבל תמונות משולבות של מיקרוסקופיה מולטי-פוטונית וקונפוקלית דרך תא החלון, ראשית, יש להזריק למעבדה את תמיסות הסימון הפלואורסצנטיות המתאימות עבור נויטרופילים בכלי הדם של העכבר באמצעות וריד הזנב. קבעו את קצות תא החלון באמצעות תפסני תנין כדי להצמיד את העכבר לבמה בהתאמה אישית. לאחר מכן, הניחו את במת הדמיון על המיקרוסקופ המולטי-פוטוני והקונפוקלי המשולב.לאחר שקיבעת את העכבר, הדלק את לייזר הדו-פוטון ואת מערכת הקונפוקאל, ולחץ על Start System כדי להפעיל את התוכנה לרכישת תמונות. כדי להגדיר את ערוצי הדימות, תחת לשונית Acquisition, לחץ על Smart Setup ובחר את הלייזרים לדימות. בחר ב-Best signal ולחץ על Apply.הוסיפו ידנית את ערוץ רכישת התמונה של יצירת הרמוניה שנייה (second harmonic generation) על ידי הפעלת לייזר הפוטונים הכפולים בחלון הלייזר (Laser), והגדרת אורכי הגל המתאימים לרכישה עבור יצירת הרמוניה שנייה. תחת לשונית Locate, לחצו על Oculars online, ואתרו את אזור העניין (region of interest) דרך המיקרוסקופ באמצעות בדיקה חזותית. לחצו על Oculars offline, ופתחו את לשונית Acquisition.בחלון הערוצים (Channels), בחרו בערוץ ה-FITC, ולחצו על Live כדי לצפות בתצוגה מקדימה של תמונת ה-FITC-Dextran עם עדשה של 5x. כווננו את המיקוד לפי הצורך. לאחר מכן, לחצו על Stop תחת לשונית הרכישה (Acquisition) כדי להפסיק את התצוגה המקדימה.כעת, בחרו ידנית בעדשה שמןית 20x והביטו שוב בתמונת ה-FITC-Dextran, תוך התאמת ה-Gain הראשי וה-Pinhole תחת חלון הערוצים (Channels) כדי להשיג את האות והניגודיות הטובים ביותר. לאחר שהתקבלה תמונה אופטימלית עבור כל שלושת הערוצים, בחרו את כל הערוצים בחלון הערוצים, ולחצו על Snap תחת לשונית הרכישה (Acquisition) כדי לרכוש תמונת מצב (snapshot) דו-ממדית. לאחר מכן, כדי לרכוש תמונת Time-lapse דו-ממדית, בחרו ב-Time Series כדי לפתוח את חלון ה-Time Series, והזינו אפס עבור המרווחים (intervals) ו-40 עבור מספר הסריקות הכולל כדי לקבל 40 תמונות ברציפות ללא מרווח זמן.כדי לנתח את התמונות, פתחו את התוכנה המתאימה לניתוח תמונות ופתחו קובץ תמונה. כדי להפיק מסלולי מעקב של אובייקטים באמצעות תמונות ה-time-lapse, בתצוגת ה-Surpass, פתחו את התמונה לניתוח ולחצו על האייקון עם תמונת הנקודות הכתומות כדי לפתוח את חלון ה-Spots החדש. לאחר הגדרת פרמטרי המעקב (Tracking parameters), סמנו את תיבת ה-Fill gaps with all detected objects כדי להתחיל במעקב.לחצו על החץ הכחול כדי לעבור לשלב הבא. תחת סוג המסנן (Filter Type), בחרו במסנן משך המעקב (Track Duration), ולחצו על החץ הירוק כדי לסיים את המעקב. לאחר מכן, בדקו את המסלולים שהופקו, וחזרו לשלב הקודם במידת הצורך.כדי למדוד את התנועה התאית, המוגדרת על ידי עקבות האובייקטים (Object tracks) בתמונות ה-time-lapse, בחלון Edit Tracks, סמנו את תיבת ה-Tracks ובחרו עקבה התואמת לתנועת התא הרלוונטי. העקבה הנבחרת תסומן בצהוב בתמונת סדרת הזמנים. לבסוף, תחת לשונית Statistics, לחצו על האייקון עם תמונת הגרף כדי לפתוח את חלון ה-Statistics.לאחר מכן, תחת Selection, לחצו על החץ הפונה כלפי מטה כדי להפיק את ה-Track Speed Mean. ניתן לדמיין את כלי הדם בתוך מחול השגג באמצעות צבעים תוך-כליים, כגון FITC-Dextran. מכיוון שהניגודיות תלויה בהזרקת הצבע, התמונה שהתקבלה מייצגת את כלי הדם התפקודיים שבהם קיים זרימת דם מספקת.תמונות אלו של אותו אזור במוח העצם בנקודות זמן שונות מדגימות את נוכחותם של נויטרופילים הן בחללים התוך-כליים והן בחללים החוץ-כליים לאורך תקופה של מספר ימים. הדמיון של עצם קורטיקלית זו, המורכבת בעיקר מסיבי קולגן, בוצע באמצעות יצירת הרמונית שנייה (second harmonic generation), מה שממחיש עוד יותר את חדירת הנויטרופילים לרקמה כלי הדם. נויטרופילים אלו נמעקבו בנישה הווסקולרית של מוח העצם ללא מרווחי זמן נוספים בין סריקה לסריקה, מה שאיפשר מעקב מדויק אחר תנועתם.ניתן למדוד את מהירות המסלולים שהופקו על ידי תוכנת ניתוח התמונות כדי לנתח את המהירות של כל תא. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון שימוש בתאים מסומנים ex vivo או בעכברי דגמי רב-גנית (transgenic reporter mice), כדי להעריך תהליכים ביולוגיים אחרים in situ, כגון השפעת תאי מערכת החיסון על התקדמות הגידול הגרעוני וגרורות.

femur-window-chamber-model-for-vivo-cell-tracking-murine-bone

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול זה מתאר הליך לדגימה סדרתית של מח עצם הירך (BM) מבלי לדרוש הקרבה של עכברים. הליך זה מקל על מחקרי אורך של הרכב ה-BM של עכברים לאורך זמן ומספק גישה סדרתית לתאים בתוך ה-BM למחקרי ex vivo והשתלות.

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

הטבע של האינטראקציות בין תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs) ונישות מח עצם הוא הבין היטב. שינויי חומרה מותאם אישית ופרוטוקול רכישה רב שלבים לאפשר את השימוש בשני הפוטונים ומיקרוסקופיה confocal לתמונת vivo לשעבר HSPCs שכותרתו התביית בתוך אזורי מוח עצם, אינטראקציות מעקב ותנועה.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

מונוציטים הם מווסתים מרכזיים של חסינות מולדת וממלאים תפקיד קריטי בחידוש המערכת הפגוציטית החד-גרעינית ההיקפית ובמקרה של דלקת. כתב יד זה מתאר את הליך ההדמיה בזמן אמת של מח העצם של קלווריה של העכבר כדי לחקור את מנגנון הגיוס של המונוציטים.

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; In vivo</em

מוצגת אסטרטגיה לניתוח כמותי של נתונים היסטולוגיים במח העצם. מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי בקטעי רקמה מביאה לתמונות דו-ממדיות, המנותחות אוטומטית. ניתוחי לוקליזציה משותפת של סוגי תאים שונים מושווים לנתונים מתמונות מדומות, ונותנים מידע כמותי על אינטראקציות תאיות.

אוטומטי כימות של תא המטופואטיות - אינטראקציות תא סטרומה בתמונות היסטולוגית של עצם Undecalcified

מיקרוסקופ זריחה intravital (IVFM) של החילונית מוחל בשילוב עם דגמים גנטיים בעלי חיים כדי ללמוד את יונת ואת engraftment של תאים hematopoietic גומחות מח עצם (מוניטור).

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

שיטה ליצור ולחיות תמונות שונים מוח העצמות נישות בעכברים מוצג. בהתבסס על נישה תומכת שנוצרו על ידי תאים mesenchymal האדם, תוספת של תאים אנדותל האדם גורם להיווצרות של כלי אדם, ואילו תוספת של rhBMP-2 גורם להיווצרות של רקמת העצם של המוח האנושי.

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח אולטרה מבנה של megakaryocytes במקום באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM). מח עצם מורין נאספים, קבועים, מוטבעים בשרף אפוקסי וחתוכים בחלקים אולטרה-דקים. לאחר כתמי ניגודיות, מוח העצם נצפה תחת מיקרוסקופ TEM ב 120 kV.

בסיטו חקר מורין Megakaryopoiesis באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

אנו מתארים כאן את השיטה להדמיית מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם הגולגולתית של עכברים חיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית.

ב-Vivo הדמיה דו-פוטונית של מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם של גולגולת העכבר

מיקרוסקופיה תוך-ויטלית מאפשרת לחקור תהליכים ביולוגיים דינמיים כגון התחדשות רקמות והתפתחות גידולים. מח העצם הגולריאלי, רקמה דינמית ביותר, מציע תובנות לגבי המטופואיזיס ותפקוד כלי הדם. שימוש בשתל קיבוע ראש מודפס בתלת מימד תואם ביולוגית מאפשר הדמיה אורכית חוזרת, ומשפר את ההבנה שלנו לגבי דינמיקת הרקמות ומיקרו-סביבת הגידול.

הדמיה אורכית תוך-חיונית של דינמיקת כלי הדם במח העצם הגולגולתי

מודל הפגיעה במח העצם של העכברים הוא כלי שימושי לחקר אוסטאוגנזה לאחר לידה באמצעות התעצמות פנימית. פרוטוקול כירורגי פשוט זה מתאר את הליך אבלציה של מח העצם להערכה במורד הזרם של היווצרות עצם חדשה ותגובות תאיות לאחר פציעה.

מתודולוגיה משופרת לחקר אוסטאוגנזה לאחר לידה באמצעות אוסיפיקציה אינטרמברנית במודל פגיעה במח עצם של עכברים

חקור מעקב תאי נויטרופילים בנישה הווסקולרית של מח העצם בעכברים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה מולטי-פוטון. שיטה זו מאפשרת גישה מיקרוסקופית לטווח ארוך לחקר דינמיקת תאי חיסון ותהליכים אונקולוגיים.

חלון ירך דגם קאמרי

גלה סרטונים נוספים