Name: החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי Burnetii Coxiella במהלך siRNA השתקה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: חקור השתקת גנים באמצעות siRNA לבחינת השפעת תהליכי מארח על טרנסלוקציית חלבוני אפקטור בחיידקי Coxiella burnetii. השיטה משלבת ניסוי דיווח מבוסס FRET לחקירת אינטראקציות פתוגן-מארח בתאים אוקריוטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC) (מזהה מענק 1062383 ו-1063646) שהוענקו ל-HJN. EAL נתמך על ידי פרס אוסטרלי לתארים מתקדמים.

למחברים אין מה לחשוף.

מערכות הפרשה, ואת החלבונים מפעילים חיידק תחבורת מערכות אלה לתוך הציטופלסמה של תאי מארחים, הם מרכיב חשוב ארסיות שרב חיידקים פתוגניים לנצל להקים זיהום בתוך נישות בשכפול הדנ&quot;א ייחודיות. ההתמקדות של קבוצות מחקר רבות כבר לחקור את יחסי הגומלין בין effectors חיידקי חלבונים מארחים ואת ההשפעה שיש effectors אלה על מסלולים הסלולר מארחים. מחקר מצומצם מאוד, אם בכלל, בדק את פוטנציאל חלבונים מארחים להיות הכרחיים עבור טרנסלוקציה מפעיל חיידק מוצלח. <p class="jove_content" style=";text-ali...

Burnetii Coxiella הוא פתוגן תאי ייחודי שגורם קדחת Q הידבקות בני אדם zoonotic. מחלה זו קשורה עם קשת רחבה של מצגות קליניות המשתרעות seroconversion אסימפטומטית לזיהום כרוני מסכנות החיים שבאו לידי לעתים קרובות ככל שנים אנדוקרדיטיס לאחר חשיפת 1. הדבקת בני אדם מתרחשת בעיקר באמצעות השאיפה של אירוסולים מזוהמים מעלי גירת המאגר העיקרי לזיהום, בפרט, פרות חולבות, כבשים ועזים. למרות זיהום Coxiella אצל בעלי חיים אלה הוא בדרך כלל תת-קליני, הזיהום עלול לגרום להפלה ואת עומס החיידקים ניכר בתוך נוזל שלית הלידה יכול לזהם בסביבה המקומית 1. דוגמה של זיהום כגון עומס עצום יכול להיות משני בריאות הציבור ועל ענף החקלאות נצפתה לאחרונה פרוץ קדחת Q שאירעו בהולנד 2. בין 2007 ו2010 למעלה מ -4,000 מקרים של בני אדם קדחת Q אובחנו פרוץ זה היה קשור זיהום משמעותי של חוות עיזים 3. בנוסף, Coxiella הוא נשק ביולוגי פוטנציאלי, כפי שסווג על ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן, הודות ליציבות הסביבה של חיידקי מנת זיהומיות נמוכה צורך לגרום לתחלואה חמורה ולתמותה 4. Coxiella קיים בשני שלבים: שלב א &#39;אורגניזמים, מבודדים ממקורות טבעיים, הם ארסיים מאוד Phase II אורגניזמים הם נחלשו מאוד in vivo. לדוגמא, לאחר קטעי מספר במבחנה של Coxiella burnetii תשע המייל Phase I אורגניזמים, שני חיידקי השלב הופקו המכילות מחיקה כרומוזומליות בלתי הפיכה ותוצאת lipopolysaccharide הקטום (LPS) 5. זן זה, ג burnetii NMII, הוא phenotypically דומה Phase I במודלים בתרבית רקמה ומספק במצב בטוחl לחוקרים ללמוד בפתוגנזה Coxiella במעבדות 5. בשנים האחרונות כמה פריצות דרך במהירות קידמו בתחום הגנטיקה Coxiella. בעיקר, התפתחות המדיה axenic (acidified בינוני ציסטאין ציטראט - ACCM-2) אפשר את הגידול ללא תאים של Coxiella בשני הנוזליים על תקשורת מוצקה 6,7. זה הביא לשיפור ישיר של כלים גנטיים זמינים Coxiella כולל מערכת ביטוי גנים מושרה, וקטורי הסעות ומערכות transposon אקראיים 8-11. לאחרונה, שתי שיטות איון גן ממוקד גם פותחו, לסלול את הדרך לבחינת מועמדים גנים ארסיות ספציפית 12. בעקבות הפנמה על ידי מקרופאגים מכתשיים, Coxiella משכפל למספרים גבוהים בתוך תא קרום נכנס כינת Coxiella- המכיל vacuole (CCV). CCV דורש סחר endocytic מארח הendosomes המוקדם והמאוחר הגס עד שהוא מבשיל לכדי אברון נגזר ליזוזום 13. לאורך כל התהליך הזה, CCV רוכש גורמים מארחים כי גם מופיעים זמני או להישאר הקשורים vacuole, לרבות, אך לא רק, Rab5, Rab7, CD63 ו LAMP-1 13-15. שכפול של Coxiella בתוך תאי מארחים תלוי לחלוטין מערכת הפרשה Dot מתפקדת במלואה / ICM סוג IVB (T4SS) 8,16,17. מערכת ההפרשה זהו מבנה רב-חלבון הקשורים אבותיהם של מערכות נטייה והוא משתרע הוא ממברנות חיידקי vacuolar לספק חלבונים חיידקיים, כינת effectors, לתוך הציטופלסמה המארח 18. Coxiella T4SS מבחינה פונקציונלית מאוד דומה היטב את המערכת מאופיינת סוג IVB Dot / הפרשת ICM של הלגיונלה pneumophila 19,20. מעניין לציין, כי הפעלת טרנסלוקציה מפעיל T4SS ולאחר אינה מתרחשת עד Coxiella מגיע ליזוזום הנגזרות חומציאברון, כ 8 שעות לאחר הפגיעה 17,21. נכון להיום, מעל 130 effectors Dot / ICM זוהה 9,17,22-24. רבי effectors אלה לשחק תפקידים חשובים סבירים בעת שכפול של Coxiella בתוך תאי מארחים; עם זאת, effectors רק כמה מתאפיינים תפקודי 25-29. במחקר זה אנו מנצלים assay טרנסלוקציה הקרינה מבוססי המסתמכת על המחשוף של המצע CCF2-AM סריג (להלן המכונה המצע כלאם) באמצעות פעילות β-lactamase בתוך הציטופלסמה התא המארח (איור 1). הגן של עניין הוא התמזג TEM-1 β-lactamase (בום) על פלסמיד כתב המספק ביטוי מכונן. מצע כלאם מורכב משני fluorophores (coumarin ו והעמסה) יוצרות זוג סריג. עירור של תוצאות coumarin ב סריג של וההעמסה ו פליטת קרינה ירוקה בהעדר טרנסלוקציה מפעיל; עם זאת, אם בלהM-מפעיל חלבון היתוך הוא translocated לתוך הציטופלסמה המארחת, כתוצאת β-lactamase פעילות וחותכת את טבעת β-לקטם של מצע כלאם, הפרדת זוג הסריג לייצר פליטת קרינה כחולה הבאות עירור. Assay טרנסלוקציה זה הוכח גם כגישה לזהות חלבונים מפעיל מתוך מגוון רחב של חיידקים תאיים תאיים שונים, כולל ג burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, trachomatis כלמידיה, וחיידק E. coli, סלמונלה Brucella 17,30-35. כדי לקבוע את התפקיד של גורמי מארח ספציפיים על טרנסלוקציה מפעיל Coxiella אנו מנצלים שיטה מבוססת היטב עבור להשתקת גנים המכונית התערבות RNA, ב RNA התערבות הקטן במיוחד (siRNA). במקור מזוהה elegans Caenorhabditis, התערבות RNA היא תהליך הסלולר אנדוגני משומר המשמש defe המולדNSE מפני וירוסים כמו גם ויסות הגנים 36,37. לאחר עקדת siRNA רצף ספציפי, השפלה של mRNA מתרחשת דרך RISC (מורכב השתקה המושרה RNA) וכתוצאה מכך להשתקת גנים ספציפיים או 38 מציאה. במחקר זה, siRNA שמש למקד שני חלבונים מארחים, Rab5A ו Rab7A, אשר הם רגולטורים חשובים של מסלול endocytic. ההשפעה של השתקת Rab5A ו Rab7A על טרנסלוקציה מפעיל הוברר באמצעות ג burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 נבחרה כפי שהוא הוצג בעבר להיות translocated ידי מערכת הפרשת Dot / ICM Coxiella של 17. ניצול הוא להשתקת גני siRNA ואת assay טרנסלוקציה fluorescencebased המתואר כאן, אנחנו מתחילים להקים לחיקוי עבור גורמי המארח טרנסלוקציה של חלבונים מפעילים ידי Coxiella. גישה זו ניתן ליישם במגוון רחב של שניהם חיידקים תאיים תאיים שיש להם secretio דומהמערכות n אחראיות טרנסלוקציה של חלבונים מפעילים.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>סיגמא</td><td>C0759</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>סיגמא</td><td>S4641</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט</td><td>סיגמא</td><td>60218</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>קלביוכימיה</td><td>442611</td><td>ACCM-2 בינוני רכיב</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>C5080</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>ברזל גופרתי</td><td>פישר</td><td>S93248</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>S9625</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>סיגמא</td><td>C6852</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>Bacto-neopeptone</td><td>BD</td><td>211681</td><td>ACCM-2 בינוני רכיב</td></tr><tr><td>חומצות קסאמינו</td><td>פישר</td><td>BP1424</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>מתיל בטא ציקלודקסטרין</td><td>סיגמא</td><td>C4555</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-036</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>סיגמא</td><td>C0378</td><td>לתרבית חיידקים</td></tr><tr><td>ON-TARGETplus בקרה לא ממוקדת בריכה (OTP)</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10-05</td><td>בקרה לא ממוקדת</td></tr><tr><td>siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-003290-01-005</td><td>גורם למוות של תאים; מדד יעילות הטרנספקציה</td></tr><tr><td>siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-004009-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-010388-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>5x מאגר siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>B-002000-UB-100</td><td>השתמש במים סטריליים ללא RNase כדי לדלל 5x מאגר siRNA למאגר siRNA 1x</td></tr><tr><td>DharmaFECT-1 Transfection Reagent</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>לטרנספקציה</td></tr><tr><td>Opti-MEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td>מדיום סרום מופחת המשמש לטרנספקציה</td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>לתרבית תאים וזיהום</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי מומת בחום (FCS)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>יכול להשתמש במוצר שווה ערך חלופי</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>לאחסון זן קוקסיאלה</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>0.05% טריפסין + EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>dH2O</td><td></td><td></td><td>לדילול דגימות ותקנים עבור qPCR</td></tr><tr><td>Quick-gDNA Mini Prep</td><td>ZYMO Research</td><td>D3007</td><td>יכול להשתמש במוצר שווה ערך חלופי כדי לחלץ gDNA</td></tr><tr><td>SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-98020</td><td>יכול להשתמש במוצר qPCR מאסטר מיקס שווה ערך חלופי לתגובת qPCR</td></tr><tr><td>ערכת טעינה של LiveBLAzer FRET-B/G עם CCF2-AM</td><td>Invitrogen</td><td>K1032</td><td>למדידת טרנסלוקציה באמצעות פלואורסצנטיות ויצירת תמיסת הטעינה 6X (מכילה תמיסה A, B, C ו-DMSO)</td></tr> <tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>Merck</td><td>106469</td><td>רכיב תמיסה Probenicid</td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td>רכיב תמיסת Probenicid</td></tr><tr><td>di-נתרן מימן אורתופוספט</td><td>Merck</td><td>106586</td><td>Probenicid רכיב</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Sigma</td><td>P8761</td><td>רכיב תמיסת Probenicid</td></tr><tr><td>DRAQ5 תמיסת בדיקה פלואורסצנטית (5 מ"מ)ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td>62251</td><td>צבע גרעינים לקביעת חיוניות התא. השתמש ב-1:4000 מדולל ב-PBS.&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת 4% PFA (paraformaldehyde) ב-PBS</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>תמיסת קיבוע לתאי HeLa 229</td></tr> בקבוק <tr><td>תרבית רקמות 25 ס"מ2 עם מכסה מאוורר</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>לגידול זן חיידקים</td></tr><tr><td>96 Well Flat Clear תחתית פוליסטירן שחור מטופל TC, עטוף בנפרד, עם מכסה,</td><td>קורנינג</td> סטרילי <td>3603</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית רקמות 75 ס"מ2 עם מכסה מאוורר</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>לגידול תאי HeLa 229</td></tr><tr><td>175 ס"מ2 בקבוק תרבית רקמות עם מכסה מאוורר</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>לגידול תאי HeLa 229</td></tr><tr><td>Haemocytometer</td><td></td><td></td><td>לכימות תאי HeLa 229</td></tr><tr><td>Tear-A-Way 96 Well PCR לוחות</td><td>4titude</td><td>4tiude 4ti-0750/TA</td><td>עבור qPCR תגובה</td></tr><tr><td>8-שרשרת מכסה, שטוחה</td><td>Sarstedt</td><td>65.989.002</td><td>עבור תגובת qPCR</td></tr><tr><td>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bench top microfuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספסל עליון מערבולת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אורביטלית מערבל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>לגלולה תרבית חיידקים</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td>לכימות gDNA</td></tr><tr><td>Mx3005P QPCR מכונת</td><td>Aligent Technologies</td><td>401456</td><td>לכימות גנום קוקסיאלה בתרבית 7 ימים</td></tr><tr><td>ClarioSTAR microplate קורא</td><td>BMG LabTech</td><td></td><td>למדידת פלואורסצנטיות</td></tr></tbody></table>

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em&gt; burnetii coxiella</em&gt; במהלך sirna השתקה

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Burnetii Coxiella, הגורם הסיבתי של קדחת Q, הוא פתוגן תאיים שנשענת על סוג IV Dot / ICM הפרשת מערכת להקים נישה בשכפול הדנ&quot;א. קבוצה של effectors הם translocated דרך המערכת הזאת לתוך התא המארח כדי לתפעל תהליכים המארח לאפשר את הקמתה של vacuole ליזוזום הנגזרות ייחודי עבור שכפול. השיטה המוצגת כאן כוללת שילוב של שתי טכניקות ומבוססות: להשתקת גנים ספציפית באמצעות siRNA ומדידה של טרנסלוקציה מפעיל באמצעות מצע סריג מבוסס המסתמך על פעילות β-lactamase. במסגרתו קיימים שתי גישות אלה, אנו יכולים להתחיל להבין את התפקיד של גורמים מארחים בתפקוד טרנסלוקציה מפעיל מערכת הפרשת חיידקים. במחקר זה בדקנו את התפקיד של Rab5A ו Rab7A, הוא רגולטורים חשובים של מסלול סחר endocytic. אנו מראים כי השתקת ביטוי גם בתוצאות חלבון לירידה מפעיל translocatioיעילות n. ניתן שיטות אלה לשנות בקלות לבחון פתוגנים תאיים תאיים אחרים כי גם לנצל מערכות הפרשה. בדרך זו, תמונה גלובלית של גורמי מארח מעורבים טרנסלוקציה מפעיל חיידק עשויה להתגלות.

לצורך המחקר הזה, ג burnetii זן pBlaM-CBU0077 נבחר CBU0077 הוכח בעבר להיות מפעיל translocated של מערכת הפרשת Coxiella Dot / ICM 17. לפני ההדבקה, המספר הכולל של ml / הגנום של ג שבעה ימים תרבות burnetii pBlaM-CBU0077 הייתה מנויים באמצעות qPCR. איור 4 מדגי דוגמא של סף המחזור (CT) ערכים צפויים משני תקני הדגימות הבאים qPCR. ערכי CT (המיוצגים בעלילת ההגברה (האיור 4B) ומספרית ...

חוקר את יחסי הגומלין בין חיידקים פתוגנים מארחיהם הוא אזור חשוב של מחקר ביולוגי. כאן אנו מתארים טכניקות צורך למדוד טרנסלוקציה מפעיל ידי burnetii Coxiella במהלך להשתקת גנים siRNA שימוש המצע כלאם.

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; במהלך siRNA השתקה

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

המטרה הכללית של הליך ניסיוני זה היא לבחון את ההשפעה של תהליכי מאכסן ספציפיים על היכולת של פתוגנים חיידקיים להעביר חלבוני אפקטור. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה התאית, ובמיוחד באופן שבו המאכסן מעורב בחסימה או בקידום של העברת אפקטורים של virulent של חיידקים אל תוך תא המאכסן.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת שתי טכניקות מבוססות: השתקת גנים באמצעות siRNA ומסיי רפורטר (reporter assay) למדידת טרנסלוקציה של חלבונים בקטריאליים, וזאת כדי לחקור את האינטראקציה שבין פתוגנים לתא איקריוטי.שיטה זו מספקת תובנות לגבי הפתוגניזציה של coxiella וניתן ליישמה גם כדי לחקור את האינטראקציות בין המאכסן לפתוגן של חיידקים אחרים התלויים בתעתוק חלבונים יעיל. לדוגמה, chlamydia, salmonella ו-attaching interfacing E.coli. לאחר גידול של C.burnetii המבטא CBU0077, יש להוסיף את ה-betalactamase בהתאם לפרוטוקול הכתוב בבקבוק תרבית של 25 centimeter squared עם פקק מאוורר.בצע הזרקה (Inoculate) של 20 µL מהחיידקים לתוך 10 mL של מצע ACCM2 שחומם מראש ומכיל 3 µg/mL של chloramphenical. גדל את התרבית בטמפרטורה של 37 °C, בריכוז של 5% CO2 ו-2.5% חמצן למשך שבעה ימים. לצורך ביצוע reverse transfection של תאי HeLa באמצעות siRNA, ולאחר הכנת ה-siRNA בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הנח DMEM בתוספת 10% FCS, trypsin EDTA בריכוז 0.5% ו-PBS באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות לחימום לפני השימוש.עבור כל טרנספקציית siRNA ניסויית, ערבבו 0.4 microliters של סוכן טרנספקציה ו-63.6 microliters של מצע עם סרום מופחת בתוך מבחנת מיקרופוג נפרדת. ערבבו את כל מבחנות המיקרופוג בוורטקס והמתינו חמש דקות בטמפרטורת החדר להיווצרות קומפלקסים של הרכיבים. הוסיפו 16 microliters מכל siRNA ניסויי למבחנות המיקרופוג המתאימות המכילות את קומפלקס הטרנספקציה.לאחר מכן, ערבבו ב-vortex והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. במהלך הדגירה של 20 הדקות, הוסיפו 20 µL של תערובת ריאגנט הטרנספקציה, מצע עם סרום מופחת ו-siRNA לבארים המתאימות במגש 96 בארים סטרילי, שחור, שטוח עם תחתית שקופה. כמו כן, במהלך הדגירה של 20 הדקות, השתמשו ב-10 mL של PBS מחומם מראש כדי לשטוף שכבה אחת של תאי hela בצפיפות מלאה (confluent) או תת-צפיפה (subconfluent) בבקבוק של 75 cm².הוסף מיליליטר אחד של תמיסת trypsin EDTA בריכוז 0.5% לבקבוק והדגר בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% carbon dioxide למשך שלוש עד חמש דקות כדי לנתק את התאים. אסוף את התאים לתוך תשעה מיליליטר של DMEM שחומם מראש עם 10% FCS. השתמש בhemocytometer כדי לספור את התאים.לאחר מכן, בעזרת DMEM 10%FCS, הביאו את התאים לצפיפות סופית של 4.9 times 10 to the four תאים למיליליטר. מיד לאחר דגירה של 20 דקות, העבירו בפיפט 80 µl מהתאים לכל באער של פלטת 96 באערים המכילה את תערובת הטרנספקציה של ה-siRNA, מה שיביא את צפיפות התאים ל-3.92 times 10 to the third תאים לבאער. זהו השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול.חשוב מאוד להוסיף את תאי ה-hela לתערובת הטרנספקציה של ה-siRNA מיד לאחר הדגירה של 20 דקות. אחרת, יעילות הטרנספקציה עלולה להיפגע. ודאו שהבארות הריקות מכילות רק 80 µL של DMEM בתוספת 10% FCS.דגרו את הפלטה למשך 24 שעות. לאחר מכן, באמצעות מתאם רב-ערוצי המחובר למקור ואקום ופיפטה, החליפו את המצע ב-100 µL של DMEM טרי בתוספת 10% FCS. דגרו את התאים למשך 48 שעות נוספות.לאחר שבעה ימי גידול ב-ACCM2, סבבו במצב צנטריפוגה את 10 המיליליטרים של תרבית C.burnetii P BlaM CBU0077 במהירות של 15,000 g ובטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), השתמשו ב-10 מיליליטרים של DMEM FCS שחומם מראש כדי להשעות מחדש את המשקע. לאחר מכן, השתמשו במים להכנת מהלולים של 1:10 ו-1:100 בנפח סופי של 100 מיקרוליטרים מהתרבית, ובצעו QPCR בהתאם לפרוטוקול הכתוב.לאחר חישוב סך הגנומים למיליליטר בתרבית C.burnetii P BlaM CBU0077, השתמשו ב-DMEM FCS שחומם מראש כדי להתאים את נפח התרבית לשני מיליליטרים, עבור ריכוז של 1.88 × 10⁸ חיידקים למיליליטר. לאחר מכן, הסירו את המצע מהתאים בביקורת (blank) ומהתאים שעברו טרנספקציה הפוכה. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של החיידקים המדוללים לבארים המתאימות, והוסיפו 50 µL של DMEM FCS לבארות הביקורת ולבארות שאינן מזוהמות.לאחר הכנת התמיסות עבור מצע ה-BlaM בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכין תערובת מאסטר (master mix) על ידי שילוב של 1.8 µL של תמיסה A ו-16.2 µL של תמיסה B. ערבב את המבחנה היטב באמצעות וורטקס. לאחר מכן, הוסף 237 µL של תמיסה C ו-45 µL של probenecid בריכוז 0.1 M. ערבב את המבחנה שוב בוורטקס.הוסיפו 10 µL של תמיסת טעינה Six X ישירות לכל הבארים הריקות ובארים שעברו טרנספקציה הפוכה, ללא הסרת המצע הקיים. הדגירו את הפלטה בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. כדי לקבוע את רמת התעתוק (translocation), הגדירו במקרא מיקרופלטות פרוטוקול לעוצמת פלואורסצנציה תוך שימוש במצב קריאה מסוג Endpoint.בחרו בלוחית מיקרו 96 בארות, ולאחר מכן תחת הגדרות אופטיקה (optic settings), בחרו בשני רכיבים מולטיכרומטיים (multichromatics) והזינו עבור הגדרת המספר הראשונה עירור של 410-10 nanometers ופליטה של 520-10. עבור הגדרת המספר השנייה, הזינו עירור של 410-10 nanometers ופליטה של 450-10. לאחר מכן, ודאו שסימנתם Well multichromatics.לאחר מכן, בחרו ב-Orbital Averaging עם קוטר של three millimeters. תחת Optic, בחרו ב-Bottom optic. לאחר מכן, תחת Speed and Precision, בחרו ב-Precise.זהו מקביל לשמונה אזורים לכל באר. התאם את פריסת הפלטה על ידי בחירת הבארים המתאימים כבארים ריקות (blanks) וכבארי דגימה. לאחר מכן, בחר ב-Start measurement.הסירו את המכסה והניחו את המגש בתוך קורא הלוחיות. ודאו שערך ההגבר (gain) מותאם כדי למנוע הגעה לערכי פלואורסצנציה מקסימליים, זאת באמצעות ביצוע כיוון הגבר באחת הבארות המודבקות שעברו טרנספקציה הפוכה עם OTP siRNA. בחרו ב-Start measurement כדי למדוד את כל הבארות הרלוונטיות באמצעות Bottom fluorescence בעירור של 410 nanometers ופליטה של 450 nanometers ו-520 nanometers עבור פלואורסצנציה כחולה וירוקה, בהתאמה.נתחו את התוצאות בהתאם לפרוטוקול הכתוב. איור זה מציג דוגמה של ערך סף המחזור (cycle threshold) הצפוי הן מהסטנדרטים והן מהדגימות לאחר QPCR לקביעת המספר הכולל של גנומים למיליליטר בתרבית C.burnetii בת שבעה ימים. בהתבסס על נתונים אלו, היו 2.31 times 10 to the eight גנומים למיליליטר בתרבית החיידקים התלויה מחדש ב-10 מיליליטר.כאן מוצגת התוצאה של השתקה של Rab5A או Rab7A על התעתקות אפקטור משלושה ניסויים עצמאיים לאחר דגירה של התאים שעברו טרנספקציה הפוכה עם מצע BlaM. ירידה משמעותית ברמת ההתעתקות של BlaM CBU0077 התרחשה במהלך השתקה של Rab5A ושל Rab7A בהשוואה לבקרת OTP. כפי שמוצג בגרף זה, למרות שטיפול ב-Rab5A או ב-Rab7A גורם לירידה בחיוניות התאים בהשוואה לבקרת OTP, ירידה זו אינה חמורה כטיפול ב-PLK1, גן הידוע כגורם למות תאים כאשר הוא מושתק.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתיק מטרות ספציפיות של המארח באמצעות siRNA, ולאחר מכן לחקור את ההשפעה של פעולה זו על translocation של חלבון אפקטור חיידקי באמצעות בדיקת reporter המבוססת על FRET. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה להשתקת Rab GTPases בזמן זיהום של תאי hela על ידי coxieller. כדי להשתמש בשיטה זו לטרגוט של חלבונים אחרים במארח, יש לבצע אופטימיזציה לתנאי הטרנספקציה כדי להבטיח השתקת גנים יעילה.בדומה לכך, כדי להשתמש בשיטה זו עם פתוגנים חיידקיים אחרים, נדרשת אופטימיזציה של תנאי ההדבקה.

applying-fluorescence-resonance-energy-transfer-fret-to-examine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

כאן אנו מתארים שיטה לדמיין mRNAs endoplasmic reticulum הקשורים בתאי תרבית רקמת יונקים. טכניקה זו כרוכה permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה עם digitonin להסיר תוכן cytoplasmic אחרי...

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

מחקרים של ביומולקולות in vivo חיוניים להבנת תפקוד מולקולרי בהקשר ביולוגי. כאן אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת הפנמה של ביומולקולות פלואורסצנטיות, כגון DNA או חלבונים, למיקרואורגניזמים חיים. ניתוח נתונים in vivo שנרשמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוצג ונדון גם כן.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

טרנסלוקציה של אפקטור לתאי מארח באמצעות מערכת הפרשה מסוג III היא אסטרטגיית אלימות נפוצה בקרב חיידקים גרם שליליים. יושם מבחן מבוסס היתוך אפקטור בטא-לקטמאז לניתוח כמותי של טרנסלוקציה. בתאים נגועים בירסיניה, ההמרה של מדווח FRET על ידי הבטא-לקטמאז מנוטרת באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר.

ניתוח של<em&gt; Enterocolitica Yersinia</em&gt; מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions

כתב יד זה מתאר שיטת תיוג תעתיקים RNA שליח בודדים (mRNA) עם הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH היא שיטת הדמיה המאפשרת זיהוי בו זמנית, לוקליזציה, כימות של יחיד מולקולות mRNA בתאים בודדים קבוע.

שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה

גישות מבוססות חלבון פלואורסצנטי לפקח effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התאים המארחים הם מאתגרים. זאת בשל בעיית אי התאימות בין חלבונים פלורסנט ומערכת ההפרשה סוג-III. כאן, מערכת ה-GFP פיצול ממוטב superfolder משמש עבור ויזואליזציה של effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התא הצמח הפונדקאי.

מערכת חלבון פלואורסצנטי ירוק לדמיין Effectors מועברת בין חיידקים במהלך זיהום

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בסדר הקירבה הצמוד כדי לבדוק את האינטראקציות של חלבון חלבון באתרו בתוך C. אלגיה germline.

באיתור באתרו של האסיפה המורכבת של ריבונאופאנפרוטאין ב -C. אלגיה germline באמצעות שיטת הסמיכות

פלואורסצנטיות RNA מולקולה אחת בהכלאה במקום (smFISH) היא שיטה לכימות מדויק של רמות ולוקליזציה של RNAs ספציפיים ברמת התא הבודד. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקולי המעבדה המאומתים שלנו לעיבוד ספסל רטוב, הדמיה וניתוח תמונה לכימות תאים בודדים של RNAs ספציפיים.

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

העברת אנרגיה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת היא שיטה העוקבת אחר הדינמיקה של ה- tRNA במהלך סינתזת חלבונים ריבוזומליים. על ידי מעקב אחר ריבוזומים בודדים, זוהו אוכלוסיות לאהומוגניות, אשר שופכים אור על מנגנונים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לעקוב אחר שינויים קונפורמציה ביולוגית באופן כללי כדי לחשוף קשרי גומלין דינמיים-פונקציה במערכות ביולוגיות מורכבות רבות אחרות. שיטות מולקולה בודדת יכולות לבחון צעדים מגבילים שאינם בקצב ומתווכים מרכזיים מאוכלסים נמוך, שאינם נגישים בשיטות הרכב קונבנציונליות בשל האפקט...

מולקולה בודדת פלואורסצנטית העברת אנרגיה מחקר של סינתזת חלבון ריבוזום

העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) היא טכניקת הדמיה לאיתור אינטראקציות של חלבונים בתאים חיים. כאן מוצג פרוטוקול FRET כדי לחקור את הקשר של אנזימים משני היסטון עם גורמי שעתוק המגייסים אותם למקדמי היעד לוויסות אפיגנטי של ביטוי גנים ברקמות צמחים.

חקירת אינטראקציות בין אנזימים המשנים היסטון לבין גורמי שעתוק in vivo על ידי העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית

מאמר זה מתאר את התיוג הכפול של רנ"א ארוך בעמדות טרמיני ואת אימוביליזציה של פני השטח שלהם באמצעות אנקפסולציה בשלפוחיות פוספוליפידים עבור יישומי מיקרוסקופיה FRET TIRF של מולקולה יחידה. שילוב טכניקות אלה מאפשר הדמיה מדויקת וניתוח של דינמיקת RNA ברמת המולקולה הבודדת.

תיוג סופי פלואורסצנטי ואנקפסולציה של רנ"א ארוך למיקרוסקופ FRET-TIRF בעל מולקולה אחת

חקור השתקת גנים באמצעות siRNA לבחינת השפעת תהליכי מארח על טרנסלוקציית חלבוני אפקטור בחיידקי Coxiella burnetii. השיטה משלבת ניסוי דיווח מבוסס FRET לחקירת אינטראקציות פתוגן-מארח בתאים אוקריוטיים.

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי

גלה סרטונים נוספים