ניתוח של המוח המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ סידורי בלוק פן אלקטרונים סורק

המטרה הכוללת של טכניקת מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פנים סדרתית היא לנתח מורפולוגיה, מבנה, תפוצה, נפח ומספר מיטוכונדריאלי באזור מוגדר במוח העכבר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח רבות בנוירוביולוגיה, כגון האם שינויים במבנה, במספר ובהתפלגות של המיטוכונדריה במוח תורמים באופן משמעותי להפרעות ניווניות ונוירו-התפתחותיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא הופכת את תהליך ההדמיה של קטעים סדרתיים לאוטומטי על ידי שילוב אולטרה-מיקרוטום מותאם אישית המובנה בתא מיקרוסקופ האלקטרונים הסורק בוואקום נמוך.

כדי להתחיל בניסוי, שטפו את הרקמות הקבועות בגלוטרלדהיד שהוכנו קודם לכן שלוש פעמים למשך חמש דקות כל אחת במאגר קקודילאט 0.1 מולרי. לאחר תיקון הרקמות עם 1 מיליליטר של קקודילאט חומצה טאנית 0.1% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבוע יש לשטוף את הטישו במאגר קקודילאט.

ממיסים 0.3 גרם אשלגן פרוציאניד ו-0.86 גרם נתרן קקודילאט ב-10 מיליליטר מים מזוקקים. רגע לפני השימוש, הוסיפו 10 מיליליטר של 4% אוסמיום טטרוקסיד וצבעו את הרקמות בתמיסת 2% אוסמיום פרוציאניד למשך 90 דקות על קרח. לאחר הצביעה יש לשטוף את הרקמה במים מזוקקים.

טפל בדגימות בתמיסת 1% תיוקרבוהידרזיד או TCH שהוכנה טרייה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שוטפים את הדגימות. לאחר מכן, יש להכתים את הרקמות בטטרוקסיד אוסמיום מימי 2% למשך שעה.

לאחר הצביעה יש לשטוף את הרקמות במים מזוקקים. דגרו את הדגימות למשך הלילה ב-1% אורניל אצטט במים מזוקקים ב-4 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הטישו במים מזוקקים ודגרו עליהם עם כתם העופרת אספרטט של וולטון בתנור.

השגת הצביעה הטובה ביותר האפשרית של רקמות היא קריטית להדמיה, שכן צביעה לקויה גורמת לתופעת טעינה על הדגימה שהופכת את ההדמיה לקשה או בלתי אפשרית. שוטפים את הטישו במים מזוקקים. ייבשו את הדגימות באמצעות סדרה מדורגת של אלכוהול באמצעות תמיסות צוננות של אתנול למשך חמש דקות כל אחת, ולאחר מכן התייבשות של 100% אתנול שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת.

שוטפים את הדגימות פעמיים למשך 15 דקות כל אחת בתחמוצת פרופילן. מניחים את הרקמות בתערובת 1:1 של שרף הטמעה ותחמוצת פרופילן, מכסים את הבקבוקון ודוגרים על הרקמות למשך הלילה. הסר את הבקבוקון לאחר שעתיים כך שתחמוצת הפרופילן תתאדה במהלך תקופה של תשע שעות.

העבירו את הרקמות לשרף הטמעה טרי ב-100% בבקבוקונים נקיים למשך שעתיים. הטמע את הדגימות בשרף הטבעה טרי בתבניות שטוחות המכילות תוויות נייר מודפסות ורפא אותן בתנור. לאחר שעה, בדוק את מיקום הרקמה ויישור והתאם במידת הצורך.

חתוך את הדגימות לאזור העניין והרכיב אותן על סיכת אלומיניום באמצעות דבק סופר ציאנואקרילט ג'ל. לאחר מכן מצפים את הדגימה במשחת כסף קולואידית סביב צידי הבלוק כדי לספק נתיב מוליך לסיכת האלומיניום. בדוק את דגימות הרקמה באמצעות מערכת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק המצוידת בשלב אולטרה-מיקרוטום בתוך החדר וגלאי אלקטרונים מפוזר לאחור בקילו-וולט נמוך.

צלמו את הדוגמאות עם הגדרות אלה. התחל בניתוח על-ידי בחירה באפשרות Image, Type ולאחר מכן 8 סיביות כדי להמיר את התמונות לתבנית TIFF של 8 סיביות מתבנית 16 הסיביות המקורית. אם המרת ניגודיות ו/או בהירות אוטומטית בשלב זה אינה אידיאלית לתמונות, פתחו מחדש את תמונות 16 הסיביות ולחצו על Image, Adjust, Brightness/Contrast.

בחר טווח שמתאים לכל התמונות ולחץ על Apply. לאחר מכן בצע את ההמרה. אם הייתה תנועת תמונה לא מקובלת בין פרוסות, יישר את אוספי התמונות על-ידי בחירה ב-Plugins, Registration ו-Linear Stack Alignment עם SIFT והגדר את היישור למצב תרגום בלבד ולא לגוף קשיח.

הגדל את בד הציור לפני ההרשמה על-ידי בחירה באפשרות Image, Adjust, Canvas Size. לחלופין, צמצם את התמונה לאזור עניין על-ידי בחירת האזור הרצוי ולאחר מכן חיתוך. במידת הצורך, שנה את קנה המידה של התמונות לגודל קטן יותר וקל יותר לניהול באמצעות ImageJ, ולאחר מכן בחר Image and Scale.

מיקרוסקופיה קונפוקלית על תרביות עצביות בצפיפות נמוכה הראתה כי מיטוכונדריה השוכנת בסומה עצבית יוצרת רשת רשתית, ואילו אלה השוכנים בנויריטים דיסטליים מציגים מורפולוגיה מוארכת בדידה. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק-פנים סדרתי, או טכניקת SBFSEM, נצפו בבירור המיטוכונדריה, הדנדריטים והדליות האקסונליות במוח העכבר. שחזורים של שלושה ימים של מיטוכונדריה בנויריטים של רקמת מוח עכבר הראו הבדל בגודל בין מיטוכונדריה דנדריטית לאקסונלית.

נתונים שחולצו מתמונת SBFSEM דו-ממדית מייצגת חשפו כי נפח או גודל המיטוכונדריה השוכנים בתוך הפרה-סינפסות העצביות היו קטנים משמעותית מאלה השוכנים באזור החוץ-סינפטי. התמונות שנרכשו על ידי ניתוח SBFSEM מספקות רזולוציה מוגברת לחזות את המאפיינים האולטרה-מבניים של מיטוכונדריה בודדת. ניתן לסווג את התא התאי של המיטוכונדריה על ידי קביעת קרבתו למבנים הניתנים לזיהוי בקלות כמו מיטוכונדריה סומטית לא סינפטית ומיטוכונדריה פרה-סינפטית.

טכניקה זו יכולה להיעשות תוך כשבעה ימים, הכוללים שלושה ימים של צביעה, יומיים לריפוי שרף, יום אחד של הדמיה להפקת ערימה המתאימה לניתוח זה, וכשעתיים עד ארבע שעות לעיבוד לאחר התמונה כהכנה לניתוח. ניתן להשתמש בהליך זה גם בשילוב עם שיטות אחרות להדמיית מיטוכונדריה כגון הדמיה חיה עם מיטוכונדריה מתויגת גנטית כדי לענות על שאלות על סחר במיטוכונדריה והדינמיקה של הביקוע וההיתוך שלהם.