Name: התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: למד לצפות במיטוזה חיה בעוברי דג זברה באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור פגמים בחלוקת כרומוזומים ולהבין את הקשר לבעיות התפתחותיות וסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לקריסטן קוואן על הווקטורים pCS2-H2A.F/Z-EGFP ו-pCS2-mCherry-CAAX. אנו מודים לכריס רודש על שהדריך אותנו בהדמיה חיה בדגי זברה. אנו מודים לשון וויליאמס, אריק מאלארקי ובראד יודר על הסיוע בהדמיה קונפוקלית ב-UAB ובמתקן ההדמיה ברזולוציה גבוהה ב-UAB. מתקן ההדמיה ברזולוציה גבוהה נתמך על ידי מענק התמיכה המקיף של מרכז הסרטן של UAB (P30CA013148) ומרכז הליבה למחלות ראומטיות (P30 AR048311). JMP נתמך על ידי המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי (NIH R21 NS092105), ומענקי פיילוט מהאגודה האמריקאית לסרטן (ACS IRG-60-001-53-IRG) ומרכז הסרטן המקיף של UAB (P30CA013148). S.M.P. נתמך על ידי מענק ההכשרה לביולוגיה תאית ומולקולרית T32 (5T32GM008111-28).

תמלול 1. במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize וקטורים pCS2-H2A.F / Z-EGFP ו / או pCS2-mCherry-CAAX ידי הגבלה NotI האנזים לעכל 31. שימוש RNA בערכת שעתוק במבחנה, ליצור מוצרי mRNA 5 &#39;כתרים מכל תבנית, על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את ה- mRNA כתרים באמצעות ערכת טיהור. עקוב אחר ההוראות של היצרן. Elute עם H RNase ללא 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של RNA על ידי ספיגה ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. (OD 260 x דילול x 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את RNA ל 100 ng / μl עבור כל H2A.F / Z-EGFP ו mCherry-CAAX עם RNase ללא H 2 O. אם ריכוז RNA הוא נמוך מדי, את הקרינה תפחת או נעדר. דגימות בהירות תקטנה את חשש phototoxicity ואת photobleaching. מצד השני, גם RNA הרבה יכול להיות רעיל ו / או לגרום מחוץ תופעות יעד. הערה: אחסן את הנותריםmRNA מטוהר במקפיא -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. גידול דג זברה, אוסף עובר, הזרקת mRNA 36-38 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב טנקי רבייה עם מחסום להפריד הטנק לשני אזורים וממלאים כל אקווריום רבייה במי מערכת מדגה בשימוש במתקן דג הזברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע רבייה בטרם עת, הנח שני דג זכר בצד אחד של המחסום ושני דגים נקבה בצד השני אמש רבייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להפשיר את התערובת mRNA הכין בעבר על הקרח. החלף את המים במיכלים רבייה במי מערכת מדגה טריים להסיר את המחסומים. מייד לאחר המחסומים נמשכים, לחמם עובש הזרקה ל -28.5 מעלות צלזיוס, להגדיר את הציוד עבור microinjection. הערה: לקבלת מידע על תבניות להזרקה, עיין גרלך 36. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ביצים כל 10 - 15 דקות באמצעות מסננת תה ולשטוף את הביצים לתוך צלחת 100 x 15 מ&quot;מ פטרי נקי באות E3 כחול (5 mM NaCl, KCl 0.17 מ&quot;מ, 0.33 מ&quot;מ 2 CaCl, 0.33 מ&quot;מ 4 MgSO, 10 -5% מתילן כחול). E3 הכחול משמש למניעת גידול פטרייתי ולהבטיח התפתחות תקינה של דגי זחל. לקבלת מידע נוסף על הזדווגות ואיסוף עובר, עיין גרלך 36 ו Porazinkski 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השבץ חד-תאים מבוימים עוברת בתוך תבנית הזרקה חממה ולהזריק את הרנ&quot;א בחלמון בסך הרצוי של עוברים (איור 1 א). חשבון למוות עוברי טבעי עוברים מופרים על ידי ביצוע זריקות עובריות ב -15% יותר עובר מדרוש לצורך הניסוי. לפרטים נוספים על microinjection של עוברי דג הזברה, עיין גרלך 36 ו Porazinkski 37. הערה: לשימוש לראשונה של mRNA, מבצע ניתוח מנה-עקום כדי לקבוע את המינון האופטימלי עבור קרינה ואת הכדאיות (המוגדרת אין פגמים התפתחותיים ברוטו עד 5 DPF) לפני ביצוע הדמית 5D. 150 - 200 ng / μlמוזרק לעוברים הוא לעתים קרובות הריכוז האופטימלי, ולכן הוא נקודת התחלה טובה עבור הריכוז הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לחלץ את העוברים המוזרקים מהתבנית בעזרת פיפטה פסטרה זכוכית 9 &quot;שונה. כדי לשנות את פיפטה, להמס את הסוף באמצעות מבער בונזן עד שנוצר כדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים עוברים מוזרקים בצלחת 100 x 15 מ&quot;מ פטרי ב E3 הכחול ובית C חממת 28.5 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שש שעות לאחר הזרקה, להסיר כל עוברים מתים או מופרים מהצלחות ולהוסיף נקי E3 הכחול. בית העוברים על 28.5 ° C. </li></ol> 3. הכנה והטבעה של עוברי דג הזברה חי הדמיה (איור 1B) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתי שעות לפני ההדמיה, להקרין את העוברים המוזרקים עבור GFP באמצעות מיקרוסקופ לנתח ניאון. מניחים עוברים GFP להביע ירוק בהיר בצלחת 100 x חדש 15 מ&quot;מ פטרי עם E3 כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים פתרון המניות של agarose נמוכה להמיס 1% על ידי הוספת 1 גרם של נמוכה להמיס agarose ל -100 מ&quot;ל של E3 כחול. לאחר שימוש agarose, מכסה את הבקבוק עם רדיד אלומיניום. הפתרון המניה נשאר שימושי עד חודש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 3 מ&quot;ל של אגר מומסת לתוך צינור תרבות 17 x 100 מ&quot;מ. שמור על חם agarose על ידי הנחת צינור תרבות באמבט מים C ° 42 עד מוכן לשימוש. הכן פתרון 15 מ&quot;מ Tricaine במים deionized כדי להרדים את עוברי דג הזברה 36. הערה: אם ההדמיה קודמת זמן נקודות היא רצויה, הריכוז אגר ניתן ירד נמוך כמו 0.3% 39. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את 15 מ&quot;מ Tricaine, עוברים הוקרן, נמוכה להמיס agarose, E3 כחול, וצלחת תרבות התחתונה coverslip זכוכית 35 מ&quot;מ עד מיקרוסקופ אור לנתיחה. מוציאים בזהירות את של סיסית העובר עם פינצטה 5 #. האם זה במשך שלושה עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים dechorionated במיכל נפרד כדי להיות מורדם. המכסה של המנה coverslip התחתונה משמשת לעתים קרובות למטרה זו. בעזרת פיפטה העברה, להוסיף שלוש טיפות (כ 150 μl)של 15 מ&quot;מ Tricaine כדי בצלחת של כחול 5 מ&quot;ל E3 (אם באמצעות המכסה של צלחת coverslip למטה) או עד עוברים כבר הרדים מספיק. בנוסף, להוסיף 3-4 טיפות (כ 150 - 200 μl) של 15 מ&quot;מ פתרון Tricaine אל הצינור agarose מומסת 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה p200 עם 1 ס&quot;מ של קצה פיפטה מנותקים; להעביר את העוברים בהרדמה כדי בצלחת coverslip בעל תחתית. הסר את כל עודפי E3 כחול: פתרון Tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט מוסיף 5 - 10 μl של agarose הנמוכה להמס: פתרון Tricaine על עובר, שמירה על כל טיפה נפרדת כדי להבטיח את העוברים לא להיסחף בטעות קרובה אחד לשני. אזהרה: אם agarose חם מדי, זה יגרום נזק לעובר. טמפרטורה טובה כדי לשמור על אגרה היא C ° 42. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 21 G ½ 1, בעדינות לכוון את העובר ב agarose למיקום הרצוי. בעת שימוש במיקרוסקופ הפוכה הדמיה זמן לשגות, כוון את האזור של עניין (ROI) קרוב coverslip כמו possible. הערה: כללית, באזור הזנב מציע וקלות ההתמצאות בהירות עקב (איור 1 א) יחסית רזה רקמות. רקמות אחרות, כגון שכבת האפיתל סביב קפלי חלמון סנפיר, ניתן להשתמש 28,29. רקמות אלה מציעות בבהירות רבה, אולם האזורים אלה הם רק כמה שכבות תאים עבים. לצורך בפרוטוקול זה, זה מועיל לתמונה באזור הזנב לרכוש חלוקות תא רבות ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן כמה דקות עבור מיצוק חלקי של אגר. השתמש מחט להתפרק פיסה קטנה של אגר כדי לבדוק מיצוק שלה. כאשר פיסה אגר ניתן התרחקה הטיפה, המשך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את coverslip כולו עם אגר נמוך להמס ויוצרים כיפה על העוברים המוטבעים. אפשר אגר לגבש לפני הזזת צלחת הדמיה confocal (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תהליך ההתמצקות אגר (לוקח כ -10 דקות), להכין 3 מיליליטר of E3 כחול פתרון עם חמש טיפות של (כ 250 μl) 15 מ&quot;מ Tricaine להציב על העוברים מוטבע במהלך ההדמיה. </li></ol> 4. הדמיה Confocal 5D של 40,41 עוברים דג הזברה חי הערה: ראה Ariga 40 ו אובריאן 41 לפרטים על כיצד לבצע הדמית 5D באמצעות מערכות confocal אחרות. עבור Z-מרווח, Z- מחסנית, Z-עומק, מרווח הזמן, והגדרות 5D ראה תרשים 1C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת ההדמיה ולהגדיר מיקרוסקופ כדי 1.4 עדשה אובייקטיבית 60X NA. החל שמן טבילה אל העדשה האובייקטיבית ומניח בצלחת התרבות מחזיקה שקופיות על במת מיקרוסקופ. באמצעות בקר הציר, למרכז את עובר עניין מעל העדשה האובייקטיבית ולהביא את העדשה האובייקטיבית כלפי מעלה כדי לפגוש את מנת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש על סמל עין החתיכה ולעבור מסנן GFP על המיקרוסקופ. דגש על ROI. התמקדות הרקמה הקרובה ביותר coverslip יהיה offer תוצאות ההדמיה הטובות ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המשתלבים. בחר את ערוצי GFP ו mCherry (אורכי גל שנקבע מראש בתוכנה) ולהגדיר את הקו הממוצע אפשרות לקדמותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;צפה / בקרת רכישה / A1 שטח סריקה&quot; פקודה כדי לפתוח את כלי שטח סריקת A1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל בסריקה. באמצעות בקר הציר, עמדה עובר כך את אזור הסריקה מתמלא כמה שיותר דג הזברה ככל האפשר. כוח לייזר לא צריך להיות אופטימלי בשלב זה. מנמיכים את כוח לייזר כדי למנוע photobleaching מיותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;בקרות צפו / רכישה / רכישת ND&quot; פקודה כדי לפתוח את לוח בקרת רכישת ND. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין סריקה כדי להגדיר את הפרמטרים מחסנית Z. קבע את הגבול העליון Z- מחסנית למקום שבו התאים הם לא בפוקוס גבול תחתון למקום שבו תאים אינם גלויים. לאפשר מרחב 3 מיקרומטר מעל המדגם לצמיחת תנועת תא, אשר עשוי להתרחב לתחום ההדמיה. The Z-ערימה עבור הדמויות המוצגים פרו זהtocol מכוסה בעומק-Z של 40 מיקרומטר הזנב העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל הצעד Z-מרווח 2 מיקרומטר. בממוצע, תא הוא 10 מיקרומטר קוטר; ולכן 2 מיקרומטר יפיקו חמישה במרווחים של נתוני הדמיה להיות מנותחים עבור כל תא. הערה: עומק התמונה שניתן לרכוש תלויה מרווח Z. רזולוצית Z הוא הקריב כדי להשיג עומק הכולל בממד Z כדי תמונה כמו תאים רבים עוברים מיטוזה כמו (Z- עומק גדול) אפשרי. המצב ההפוך הוא נכון, באותה, על ידי הפחתת גודל הצעד, ברזולוציה Z הוא זכה, תוך עומק Z הוא הקריב (Z- עומק קטן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את כוח לייזר תמונה, HV, וקיזזו רמות. עבור הניסויים הפגינו פרוטוקול זה, להשתמש בכוח הליזר הבא, HV, וקזז רמות להגדיר ברמות המקבילות, בהתאמה, עבור ערוץ ה- GFP; 2 - 5, 120 - 140, ו -9 ל -11. עבור ערוץ mCherry, השתמש כוח הליזר הבא, HV, וקזז רמות, בהתאמה; 3 - 6, 120 - 140, ו -3 כדי-8. לאחר הפרמטרים נקבעים, לכבות את הסריקה כדי למנוע חשיפת ליזר מיותרת שעלולות לגרום phototoxicity ואת photobleaching של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את סמל מיצוע קו 2x. &quot;אין מיצוע&quot; מייצר תמונה מגורענת בזמן &quot;קו 4x הממוצע&quot; מאריך את זמן הסריקה באופן דרסטי. השימוש מיצוע קו 2x מספק את איכות התמונה הגבוהה ביותר וזמן הסריקה המהירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את משך המתאים מרווח זמן הזמן הדרוש לצורך הניסוי. עבור חטיבות wild-type, מרווחי זמן של שתי דקות במשך שעה 2. עדיף לקביעת משך mitotic (ששימשו איורים 1, 2, 3 א, ו 3B). חטיבות המפעילות את מחסום הרכבת ציר עבור יותר מ -30 דקות מתאימות יותר של חמש דקות במשך ארבע שעות על מנת לשמר קרינה כפי שמודגם באיור 3C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את תיבת &quot;ולשמור את הקובץ&quot; ואת שם הקובץ כדי לשמור את הקובץ באופן אוטומטי כפי שהוא נרכש. בדוק היטב את כל parameters הוגדר כהלכה ופגע &quot;התחל הפעלה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרכישה תושלם, כדי לראות את הקובץ בפורמט תלת ממדים, לחץ על סמל סף נפח. </li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השימוש בשיטה זו מאפשר להסיק פירוט מעטפת הגרעין, היווצרות של צלחת metaphase ידי קבצים מצורפים microtubule-קינטוכור, והפרדה של כרומטידה אחות ליצירת שני תאים חדשים vivo ובאופן שהזמן גרמן. היכולת להתבונן מיטוזה דג הזברה יש יתרון על פני דגימות קבועות ומערכות תרבית תאים כי התאים להיות הדמיה בפיסיולוגיה הטבעית, הרקמה שקופה המאפשר לשמש חלבוני ניאון, הם מפתחים יחסית מהר, הזמן לשגות הדמיה ניתן לרכוש. שימוש דג הזברה מבוגרת עבור פרוטוקול זה מוגבל בשל העומק-Z המוגבל שניתן לרכ...

מיטוזה הוא חיוני בתהליכים תאיים קריטי לצמיחה, בידול, והתחדשות בכל יצור חי. עם הכנה מדויקת שכפול של דנ&quot;א ביניים, התא ערוך לחלק. השלב הראשון של מיטוזה, prophase, הוא שיזם ההפעלה של cyclin B / Cdk1. Prophase מאופיין עיבוי של חומר הכרומטין לתוך הכרומוזומים. פירוט המעטפה גרעיני מתרחש במעבר בין prophase ו prometaphase. בשנת prometaphase, centrosomes, במרכז nucleating להיווצרות ציר, להתחיל להגר הקטבים תוך הארכת microtubules בחיפוש מצורף קינטוכור. עם קובץ מצורף, המרות קצה בדבר עיקול microtubule וכוחות המתח לכוון את הכרומוזומים להרכיב צלחת metaphase 1. אם כל הכרומוזומים מחוברים כהלכה, מחסום הרכבת הציר בא על סיפוקו, טבעות cohesin מחזיקות את כרומטידה האחות יחד הם בקעו, ו microtubules לקצר למשוך אחותוכרומטידה כדי קטבים מנוגדים במהלך anaphase 2,3. השלב הסופי, telophase, כרוך התארכות התא הרפורמציה של מעטפת הגרעין סביב שני הגרעינים החדשים. Cytokinesis משלים את התהליך החלוקה על ידי הפרדת הציטופלסמה של התאים הבת החדשים שני 4-6. שינוי מסלולי mitotic מפתח (כלומר, מחסום הרכבת ציר, שכפול centrosome, לכידות כרומטידה אחות, וכו.) יכול לגרום למעצר metaphase, missegregation של הכרומוזומים, 7-10 יציבות גנומית. בסופו של דבר, פגמי מיטוזה שליטת מסלולים יכולים לגרום פרעות התפתחותיות וסרטן, ויזואליזציה מחייב של מיטוזה והפגמים שלה חי, חוליות, רב תאי אורגניזם 10-16. עוברי דג הזברה לשרת כאורגניזם מודל נהדר עבור הדמיה לחיות בשל רקמה שקופה, קלות microinjection, ופיתוח מהיר. שימוש דג זברה, המטרה הכוללת של כתב היד הזה היאמתארים שיטה של 5D חי (מידות X, Y, Z, זמן, אורך הגל) הדמיה של מיטוזה 17 (תרשים 1C). שימוש מוטצית דג הזברה פגומה במסלולי mitotic שונים להדגים התוצאה של פגמים כאלה. עבור פרוטוקול זה, מוטציות אורורה B ו- Esco2 נבחרו כדי להמחיש את הפגמים הללו. אורורה B הוא קינאז כי הוא חלק מקומפלקס נוסעים כרומוזום (CPC) המעורבים ביצירת ציר והתקשרות microtubule. היא נדרשת גם להיווצרות הקמט מחשוף ב cytokinesis 18,19. בשנת דג הזברה, מחסור ב אורורה מוביל פגמים אינדוקציה תלם, cytokinesis, וכרומוזום הפרדה 20. Esco2, ומצד שני, הוא acetyltransferase כי הוא חיוני עבור לכידות כרומטידה אחות 21,22. זה acetylates cohesin על החלק SMC3 של הטבעת ובכך מייצב cohesin כדי להבטיח הפרדה כרומוזום נכונה במעבר metaphase-anaphase 23. אובדן Esco2 דג הזברה מוביל CHmissegregation romosome, הפרדת כרומטידה אחות מוקדמת, חוסר יציבות גנומית, ו- p53 תלוי אפופטוזיס עצמאית 24,25. בשל הזמינות, auroraB hi1045, ו hi2865 esco2 דג הזברה מוטציה (להלן המכונה aurB מ / מ &#39;esco2 מ / מ&#39;, בהתאמה) ישמש כדי להמחיש את הטכניקה הזו 25-27. מיקרוסקופיה זיווגי confocal עם מכונות תא ניאון מתויגות אפשרה לחוקרים לחזות דינמיקת הכרומטין קרום התא במהלך מיטוזה 25,28,29. פלורסנט מתויג היסטונים שימשו היסטורית לדמיין הכרומטין. ההיסטונים הם חלבונים גרעיניים מורכב מארבעה זוגות שונים (H2A, H2B, H3, H4 ו) כי הם אחראי המבנה הנוקלאוזום כי מלחינת כרומוזומים 30. בעוד H2B הוא לטעון את היסטון השימושי ביותר עבור חלבוני ניאון בהעכבר תרבית תאים, השימוש היסטון 2A, Z משפחה (H2A.F / Z) הוכיח גם לשימוש 31,32 דג הזברה. Concanavalin A ו- קזאין קינאז 1-גמא למשל, למקם את קרום התא בעבר הוכח יעיל לדמיין את קרום תא קיפודי ים תסיסנית 33,34. מחקרים אחרים הראו כי חלבון פלואורסצנטי מתויג CAAX תוויות קרום התא היה מוצלח דג זברה 31. CAAX הוא מוטיב כי הוא מוכר על ידי אנזימים שינוי שלאחר translational כגון farnesyltransferases ו geranylgeranyltransferases. שינויים על ידי אנזימים אלה לגרום חלבונים להפוך קרום קשור, ובכך תיוג קרום התא 35. בשל השימוש לפני דג זברה, פרוטוקול זה בחר להשתמש H2A.F / ת ו CAAX לתייג הכרומטין קרום התא. יישום של שיטה זו יאפשר החוקר לפקח מיטוזה ברמת התא היחידה להתבונן כרומוזום פרטדינמיקה, וכן בו זמנית לפקח חלוקות תא מרובות עלולים להשפיע בידול רקמות ופיתוח. מאמר זה יתמקד הדמית הדינמיקה של פרדה כרומוזום במהלך מיטוזה ברמת התא היחידה. בתוך כתב היד הזה, את היכולת להתבונן כמה חטיבות mitotic, לחשב זמן חלוק, ולפענח פנוטיפים mitotic שתודגם ודנה. באמצעות פרמטרים אלה, נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ניתן לאסוף להחיל מצבי מחלה כמה מושפע פגמים mitotic.

<table><tbody><tr><td>וקטורים pCS2</td><td>מתנה מ- K. Kwan</td><td></td><td>לפלסמיד מעניין</td></tr><tr><td>אנזים הגבלה NotI-HF</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>R3189S</td><td>לעיכול הגבלה של</td></tr><tr><td>ערכת mMessage SP6</td> של פלסמיד <td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>עבור in vitro תמלול</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>לטיהור mRNA</td></tr><tr><td>100 x 15 מ"מ צלחות פטרי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB0875712</td><td>לדיור עוברים</td></tr><tr><td>עובש מיקרו-הזרקה</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td>להחזקת עוברים במהלך מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>אגרוז II</td><td>אמרסקו</td><td>0815-25G</td><td>להטמעת עוברים</td></tr><tr><td>טריקאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E10521-10G</td><td>להרדמת עוברים</td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9888</td><td>עבור מי עובר (E3 כחול), מומסים ב-UltraPure H2O</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3911</td><td>עבור מי עובר (E3 כחול), מומסים ב-UltraPure H2O</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C8106</td><td>עבור מי עובר (E3 כחול), מומסים ב-UltraPure H2O</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>M7506</td><td>למי עובר (E3 כחול), מומסים בצינור תרבית UltraPure H2O</td></tr><tr><td>מתילן כחול הידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>MB1</td><td>למי עובר (E3 כחול), מומסים בצינור תרבית UltraPure H2O</td></tr><tr><td>100 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-819-812</td><td>לאגר מומס</td></tr><tr><td>35 מ"מ כיסוי זכוכית צלחת תרבית תחתונה&nbsp;</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C&nbsp;</td><td>מס' 0, זכוכית 20 מ"מ, להטמעת עוברים</td></tr><tr><td>#5 פינצטה</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>להסרת כוריון</td></tr><tr><td>עוברים 21 G 1 1/2 מחט מד</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>למיקום עוברים באגר</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח</td><td>ניקון AZ100</td><td></td><td>לסינון והטמעת עוברים, כל היקף ניתוח יעשה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Nikon A1 +</td><td></td> <td>להדמיה בזמן-lapse</td></tr><tr><td>תוכנה קונפוקלית</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>לרכישת ועיבוד תמונות</td></tr></tbody></table>

התבוננות mitotic חטיבת dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

מיטוזה היא קריטית לצמיחה האורגניזם והבחנה. התהליך הוא מאוד דינמי ומחייב הורה אירועים להשיג עיבוי הכרומטין נכון, מצורף קינטוכור-microtubule, פרדה כרומוזום, ואת cytokinesis בתוך מסגרת זמן קטנה. שגיאות בתהליך העדין יכולות לגרום מחלות אנושיות, כוללים מומים מולדים וסרטן. גישות מסורתיות חוקרות מצבי מחל mitotic אדם לעתים קרובות מסתמכות על מערכות תרבית תאים, אשר חסרים את הפיסיולוגיה הטבעית בהקשר התפתחותי / רקמות ספציפיות יתרון כאשר לומדים מחלות אנושיות. פרוטוקול זה מתגבר על מכשולים רבים על ידי מתן דרך לחזות, עם רזולוציה גבוהה, דינמיקת כרומוזום במערכת החולייתנים, דג הזברה. פרוטוקול זה יפרט גישה, שניתן להשתמש בם כדי להשיג תמונות דינמיות של תאים מתחלקים, הכוללים: במבחנת שעתוק, רביית דג זברה / איסוף, הטבעה עוברת, ולאחר הזמן לשגות הדמיה. אופטימיזציה modifications של פרוטוקול זה גם נחקר. שימוש H2A.F / Z-EGFP (תוויות הכרומטין) ו mCherry-CAAX (קרום התא תוויות) עוברים מוזרק mRNA, מיטוזה ב AB wild-type, auroraB hi1045, ו hi2865 esco2 דג הזברה מוטציה הוא מדמיין. הדמיה לחיות ברזולוציה גבוהה של דג זברה מאפשרת להתבונן mitoses המרובה לכמת פגמי mitotic סטטיסטיים ועיתוי של התקדמות mitotic. בנוסף, תצפית של היבטים איכותיים המגדירים תהליכי mitotic פסולים (כלומר, פגמי congression, missegregation של כרומוזומים, וכו &#39;) ותוצאות כרומוזומליות פסולות (כלומר, aneuploidy, polyploidy, גרעינונים, וכו&#39;) הם נצפו. assay זה יכול להיות מיושם על תצפית של / בידול רקמת פיתוח הוא נוח לשימוש דג הזברה מוטציה וסוכני תרופתי. ויזואליזציה של כמה פגמים מיטוזה להוביל להפרעות סרטן והתפתחותיות יהיה מאודלשפר את ההבנה של בפתוגנזה של המחלה.

<html> איור 2 מדגים את היכולת להתבונן חלוקות תא רבות באמצעות תצוגת שדה רחב של זנב דג הזברה wild-type AB. במשך שבע התאים mitotic הם צילמו בתוך מסגרת זמן 14 דק &#39;(סרט 1). בתוך מנות זמן שני hr, למעלה מ -40 אירועים mitotic נתפסו. בממוצע, 50 תאים מתחלקים נצפו AB ו -30 תאים המתחלקים בעוברי Aur B מ / מ &#39;(איור 2 ב). כדי להסביר את מספר התאים צילמו, היחס של...

מיטוזה היא קריטית לכל אורגניזם חי ופגמים מובילים לעתים קרובות לסרטן ולהפרעות התפתחותיות. באמצעות פרוטוקול הדמיה זה ודגי הזברה כמערכת מודל, חוקרים יכולים לדמיין מיטוזה באורגניזם בעל חוליות חי ואת שלל הפגמים המתעוררים כאשר תהליכים מיטוטיים פגומים.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לנטר את דיוק הפרדת הכרומוזומים במהלך המיטוזה בעובר דג זברה חי, באמצעות שימוש בכרומטין ובחלבונים של ממבנה התא המסומנים פלורוצנטית, אשר יתועדו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המיטוזה, כגון כיצד פגמים במיטוזה מובילים לפגם התפתחותי או להיווצרות גידולים באורגניזם חוליי חי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא התצפית על מיטוזה באורגניזם חוליי חי, המאפשרת איסוף נתונים בעלי רלוונטיות פיזיולוגית.לאחר השבחה של דגי זברה בוגרים והזרקת ביצים עם RNA של H2A. F/Z-EGFP ו/או pCS2 mCherry-CAAX, כשלשעתיים לפני הדמיה, השתמשו במיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי כדי לזהות עוברים חיוביים ל-GFP. העבירו עוברים המבטאים GFP ובעלי גוון ירוק בוהק לצחנת פטרי חדשה בגודל 100 על 15 מילימטר המכילה מצע E3 blue.הרתח תמיסה מלאי של 1% agarose בדרגת המסה נמוכה ב-E3 blue. העבר מנה של שלושה מיליליטר של ה-agarose המומס למבחנת תרבית של 17 על 100 מילימטר. שמור על ה-agarose חם על ידי הנחת מבחנת התרבית במקלח מים בטמפרטורה של 42°C עד למועד השימוש.הכינו tricaine בריכוז 15-millimolar, עוברים שעברו סינון, agarose בעל נקודת התכה נמוכה, E3 blue, צלחת תרבית עם תחתית של כיסוי זכוכית בקוטר 35-millimeter, ומיקרוסקופ סטריאוסקופי להבדילה. לאחר מכן, בעזרת פינצטה מספר 5, הסירו בזהירות את הכוריונים משלושה עוברים, והניחו את העוברים במכל נפרד לצורך הרדמה. לאחר מכן, בעזרת פיפטה להעברה, הוסיפו שלוש טיפות של 15-millimolar tricaine אל הצלחת המכילה את העוברים וחמישה milliliters של מצע תרבית.הוסיפו שלוש עד ארבע טיפות של תמיסת tricaine בריכוז 15-millimolar למבחנה המכילה agarose מומס בריכוז 1%. כאשר העוברים מורדמים מספיק, העבירו את העוברים המורדמים לצלחת בעלת תחתית של coverslip, באמצעות פיפטמן P200 שקצהו נגזר בסנטימטר אחד. הסירו כל שארית של תמיסת E3 blue tricaine.הוסיפו באיטיות 5 עד 10 µL של תמיסת low-melt-agarose-tricaine מעל העובריים, תוך שמירה על הפרדה בין כל טיפה, כדי להבטיח שהעובריים לא יסחפו קרוב זה לזה. לאחר מכן, בעזרת מחט 21-gauge באורך one-and-a-half, כווןו בעדינות את העובריים באגרוז למנח הרצוי, כאשר את האזור המבוקש מכוונים קרוב ככל האפשר לזכוכית כיסוי (coverslip) אם משתמשים במיקרוסקופ הפוך. בשל תזוזות שעלולות להתרחש, ייתכן שיהיה צורך לחזור לכל עובר כדי לוודא שהם נשארים במנח הנדרש.ייתכן שיהיה צורך לבצע זאת מספר פעמים, עד להשגת המיקום האידיאלי בזמן שהאגר קדח. לאחר מספר דקות, כדי לבדוק אם הוא התגבש, השתמשו במחט כדי לשבור חלק קטן מהאגרוז. כאשר ניתן למשוך אותו מהטיפה, השתמשו באגרוז נוסף בעל נקודת התכה נמוכה (low-melt agarose) כדי ליצור כיפה מעל העוברים המוטמעים, כך שהכיפה תכסה את כל הזכוכית המכסה.בזמן שהאגרוז מתמצק, הכינו שלושה מיליליטר של מצע E3 blue עם חמש טיפות של tricaine בריכוז 15-millimolar, שיונחו מעל העוברים המוטמעים במהלך הדמיה. כדי לבצע הדמיית קונפוקליסטית ב-5D של עוברי זבבור ปลา-זברה חיים, פתחו את תוכנת ההדמיה והגדירו את המיקרוסקופ לעדשה בעלת הגדלה של 60X ומספר מפתח (numerical aperture) של 1.4. מרחו שמן טבילה (immersion oil) על העדשה והניחו את צלחת התרבית במחזיק השקופיות על במה המיקרוסקופ.באמצעות בקר הצירים, מרכזו את העובר הרצוי מעל עדשת העצם, והעלו את העדשה עד שתפגוש את צלחת התרבית. מזגו תמיסת E3 blue ותמיסת tricaine על העוברים המוטמעים באגר. לאחר מכן, לחצו על סמל ה-Eye Port כדי לצפות בעוברים דרך העינית.בטל את בחירת ה-Eye Port, ובחר ב-View, Acquisition Controls, A1 Scan Area, כדי לפתוח את כלי ה-A1 Scan Area. בחר בערוץ ה-GFP, הפעל מחדש את הסריקה, ומקד על אזור עניין הקרוב לכיסוי (coverslip). עצור את הסריקה, בחר בערוצי ה-GFP וה-mCherry, והגדר את אפשרות ממוצע השורות (line-averaging) למצב normal.כעת, בחרו ב-View, Acquisition Controls, ND Acquisition, כדי לפתוח את כלי ה-A1 ND Acquisition. התחילו בסריקה. לאחר מכן, בעזרת בקר הצירים, מקמו את העוברים כך ששטח הסריקה ימולא בכמות גדולה ככל האפשר של דגי הזברפיש.הגדירו את הגבול העליון של ה-Z-stack לנקודה שבה התאים כבר אינם במיקוד, תוך השארת מרווח נוסף של שלושה מיקרומטרים מעל הדגימה, לצורך גדילה ותנועת תאים. לאחר מכן, הגדירו את הגבול התחתון לנקודה שבה התאים כבר אינם נראים, והגדירו את גודל הצעד של מרווח ה-Z לשני מיקרומטרים. עבור הניסויים המוצגים כאן, כווןו את עוצמת לייזר הדימות, את ה-HV או ה-gain, ואת רמות ה-offset, בהתאמה, כפי שמופיע להלן.לאחר קביעת הפרמטרים, הפסיקו את הסריקה כדי למנוע חשיפה מיותרת ללייזר שעלולה לגרום לפוטו-טוקסיות ולפוטו-בליצ'ינג של הדגימה. כעת, בחרו את סמל מיצוע השורות (line averaging) בפי 2, המספק את איכות התמונה הטובה ביותר ואת זמן הסריקה המהיר ביותר. בחרו את מרווח הזמן ואת משך הזמן המתאימים הדרושים לניסוי.עבור חלוקות תאים של טיפוס פרא (wild-type), מרווחי זמן של שתי דקות למשך שעתיים מספיקים לקביעת משך המיטוזה. חלוקות המפעילות את נקודת הבקרה של הרכבת כישור המיטוטי (spindle assembly checkpoint) למשך יותר משלושים דקות מתאימות יותר למרווחי זמן של ארבע עד חמש דקות למשך ארבע שעות, וזאת כדי לשמר את הפלואורסצנציה, כפי שמוצג כאן. כדי לשמור את הקובץ באופן אוטומטי בזמן הרכישה, סמנו את תיבת "Save to File" ותנו שם לקובץ.לבסוף, בדקו שוב שכל הפרמטרים הוגדרו נכון, ולחצו על Run Now. לאחר השלמת הרכישה, כדי להציג את הקובץ בפורמט תלת-ממדי, לחצו על סמל ה-Volume Threshold. דמות זו מדגימה את היכולת לצפות בחלוקות תאים רבות באמצעות שדה ראייה רחב של זנב דג זבנג (zebrafish) מסוג AB wild-type.חלוקות התאים מסומנות בכוכביות. הסרטון התואם מוצג כאן. בממוצע, נצפו 50 תאים המתחלקים ב-AB, ו-30 תאים המתחלקים במוטציה של aurora B.כדי להתחשב במספר המופחת של תאים במצב מיטוזה שצולמו בעוברים עם מוטציה ב-aurora B, חושב היחס בין מספר התאים במצב מיטוזה למספר התאים שצולמו, ממצא המצביע על כך שלא מדובר במספר נמוך יותר של תאים העוברים מיטוזה בעוברים עם מוטציה ב-aurora B, אלא במספר כולל נמוך יותר של תאים שצולמו. כדי לכמת את משך המיטוזה, הכפילו את מספר מקטעי הזמן הדרושים לחלוקה אחת של תא במקטע הזמן שבין כל Z-stack. כפי שניתן לראות בגרף זה, זמן החלוקה הממוצע ב-AB מסוג wild-type הוא 25 דקות, ו-58 דקות עבור המוטנט של aurora B.כפי שנראה בעוברים מסוג בר (wild-type), ניתן להבחין בכל שלב של המיטוזה. עם זאת, בעובר מוטנט של aurora B נצפו פגמים מיטוטיים, הכוללים עצירה מיטוטית וכישלון של הציטוקינזה, שמובילים לתא דו-גרעיני וליצירה עוקבת של מיקרו-גרעינים, התומכים בזמן החלוקה המוארך שנמדד במוטנט זה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשעה אחת, החל מסריקת העוברים ועד להגדרת הפרמטרים של מיקרוסקופ הקונפוקלי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור את הקשרי הניסוי הנוכחי, ככל שהם נוגעים לאזור העניין, למשך הזמן, למרווחי הזמן ולעומק ה-Z. דבר זה יעזור למקסם את היעילות, וכן למנוע פוטובליצ'ינג (photobleaching) ופוטוטוקסיות. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון פריסת כרומוזומים, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לגורם לפגמים המיטוטיים שנצפו, או להשתמש בטיפול תרופתי כדי לקבוע את ההשפעות על התקדמות המיטוזה, משכה או גורל התא.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה לבחון מיטוזה בהקשר של ביולוגיה התפתחותית וביולוגיה של הסרטן באמצעות דגי zebrafish. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן הטמעת עוברים של zebrafish, ביצוע דימות חי של מיטוזה, וניתוח של תדירות המיטוזה, משכה וגורל התאים. זכרו כי עבודה עם לייזרים בעוצמה גבוהה ואור פלואורסצנטי עלולה להזיק לעיניים, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון הימנעות ממגע עיני ישיר עם הלייזרים, בעת ביצוע הליך זה.

observing-mitotic-division-and-dynamics-in-a-live-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

הסרטון הנוכחי מדגים שיטה אשר מנצל שילוב של electroporation ו מיקרוסקופיה confocal לבצע הדמיה לחיות על הפרט ובתאים עצבית forebrain דג הזברה מתפתח.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

תהליכים התפתחותיים כגון התפשטות, דפוסים, בידול, והדרכה האקסון יכולים להיות מודל בקלות בחוט השדרה דג הזברה. במאמר זה, אנו מתארים הליך הרכבה לעוברי דג הזברה, אשר מייעל את ההדמיה של אירועים אלה.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

כאן, אנו מציגים שיטת הרכבה רב-תכליתית המאפשרת הדמיה ארוכת טווח של התפתחות הגוף האחורי של עוברי דג זברה חיים מבלי להפריע להתפתחות תקינה.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

כאן, אנו מראים את התהליך של יצירת קו דג זברה כתב מתח חשמלי הסלולר להמחיש את התפתחות, תנועה, דגים גידול תאים ויוו.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

אנו מדגימים שיטה המנצלת סריקה מהירה של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לבצע הדמיה חיה של תאי מיקרוגליה בטקטום האופטי המתפתח של דגי זברה, המאפשר ניתוח של הדינמיקה של תאים אלה in vivo.

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

מתוארת אסטרטגיית הכנת דגימה להדמיית עוברים מוקדמים של דגי זברה בתוך כוריון שלם באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור. הוא מנתח את הכיוונים השונים שהעוברים רוכשים בתוך הכוריון בשלבי 70% אפיבולי וניצן ומפרט אסטרטגיות הדמיה להשגת רזולוציה בקנה מידה תאי בכל העובר באמצעות מערכת יריעות האור.

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

למד לצפות במיטוזה חיה בעוברי דג זברה באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור פגמים בחלוקת כרומוזומים ולהבין את הקשר לבעיות התפתחותיות וסרטן.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

גלה סרטונים נוספים