התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

המטרה הכללית של הליך זה היא לנטר את דיוק הפרדת הכרומוזומים במהלך המיטוזה בעובר דג זברה חי, באמצעות שימוש בכרומטין ובחלבונים של ממבנה התא המסומנים פלורוצנטית, אשר יתועדו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המיטוזה, כגון כיצד פגמים במיטוזה מובילים לפגם התפתחותי או להיווצרות גידולים באורגניזם חוליי חי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא התצפית על מיטוזה באורגניזם חוליי חי, המאפשרת איסוף נתונים בעלי רלוונטיות פיזיולוגית.

לאחר השבחה של דגי זברה בוגרים והזרקת ביצים עם RNA של H2A. F/Z-EGFP ו/או pCS2 mCherry-CAAX, כשלשעתיים לפני הדמיה, השתמשו במיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי כדי לזהות עוברים חיוביים ל-GFP. העבירו עוברים המבטאים GFP ובעלי גוון ירוק בוהק לצחנת פטרי חדשה בגודל 100 על 15 מילימטר המכילה מצע E3 blue.

הרתח תמיסה מלאי של 1% agarose בדרגת המסה נמוכה ב-E3 blue. העבר מנה של שלושה מיליליטר של ה-agarose המומס למבחנת תרבית של 17 על 100 מילימטר. שמור על ה-agarose חם על ידי הנחת מבחנת התרבית במקלח מים בטמפרטורה של 42°C עד למועד השימוש.

הכינו tricaine בריכוז 15-millimolar, עוברים שעברו סינון, agarose בעל נקודת התכה נמוכה, E3 blue, צלחת תרבית עם תחתית של כיסוי זכוכית בקוטר 35-millimeter, ומיקרוסקופ סטריאוסקופי להבדילה. לאחר מכן, בעזרת פינצטה מספר 5, הסירו בזהירות את הכוריונים משלושה עוברים, והניחו את העוברים במכל נפרד לצורך הרדמה. לאחר מכן, בעזרת פיפטה להעברה, הוסיפו שלוש טיפות של 15-millimolar tricaine אל הצלחת המכילה את העוברים וחמישה milliliters של מצע תרבית.

הוסיפו שלוש עד ארבע טיפות של תמיסת tricaine בריכוז 15-millimolar למבחנה המכילה agarose מומס בריכוז 1%. כאשר העוברים מורדמים מספיק, העבירו את העוברים המורדמים לצלחת בעלת תחתית של coverslip, באמצעות פיפטמן P200 שקצהו נגזר בסנטימטר אחד. הסירו כל שארית של תמיסת E3 blue tricaine.

הוסיפו באיטיות 5 עד 10 µL של תמיסת low-melt-agarose-tricaine מעל העובריים, תוך שמירה על הפרדה בין כל טיפה, כדי להבטיח שהעובריים לא יסחפו קרוב זה לזה. לאחר מכן, בעזרת מחט 21-gauge באורך one-and-a-half, כווןו בעדינות את העובריים באגרוז למנח הרצוי, כאשר את האזור המבוקש מכוונים קרוב ככל האפשר לזכוכית כיסוי (coverslip) אם משתמשים במיקרוסקופ הפוך. בשל תזוזות שעלולות להתרחש, ייתכן שיהיה צורך לחזור לכל עובר כדי לוודא שהם נשארים במנח הנדרש.

ייתכן שיהיה צורך לבצע זאת מספר פעמים, עד להשגת המיקום האידיאלי בזמן שהאגר קדח. לאחר מספר דקות, כדי לבדוק אם הוא התגבש, השתמשו במחט כדי לשבור חלק קטן מהאגרוז. כאשר ניתן למשוך אותו מהטיפה, השתמשו באגרוז נוסף בעל נקודת התכה נמוכה (low-melt agarose) כדי ליצור כיפה מעל העוברים המוטמעים, כך שהכיפה תכסה את כל הזכוכית המכסה.

בזמן שהאגרוז מתמצק, הכינו שלושה מיליליטר של מצע E3 blue עם חמש טיפות של tricaine בריכוז 15-millimolar, שיונחו מעל העוברים המוטמעים במהלך הדמיה. כדי לבצע הדמיית קונפוקליסטית ב-5D של עוברי זבבור ปลา-זברה חיים, פתחו את תוכנת ההדמיה והגדירו את המיקרוסקופ לעדשה בעלת הגדלה של 60X ומספר מפתח (numerical aperture) של 1.4. מרחו שמן טבילה (immersion oil) על העדשה והניחו את צלחת התרבית במחזיק השקופיות על במה המיקרוסקופ.

באמצעות בקר הצירים, מרכזו את העובר הרצוי מעל עדשת העצם, והעלו את העדשה עד שתפגוש את צלחת התרבית. מזגו תמיסת E3 blue ותמיסת tricaine על העוברים המוטמעים באגר. לאחר מכן, לחצו על סמל ה-Eye Port כדי לצפות בעוברים דרך העינית.

בטל את בחירת ה-Eye Port, ובחר ב-View, Acquisition Controls, A1 Scan Area, כדי לפתוח את כלי ה-A1 Scan Area. בחר בערוץ ה-GFP, הפעל מחדש את הסריקה, ומקד על אזור עניין הקרוב לכיסוי (coverslip). עצור את הסריקה, בחר בערוצי ה-GFP וה-mCherry, והגדר את אפשרות ממוצע השורות (line-averaging) למצב normal.

כעת, בחרו ב-View, Acquisition Controls, ND Acquisition, כדי לפתוח את כלי ה-A1 ND Acquisition. התחילו בסריקה. לאחר מכן, בעזרת בקר הצירים, מקמו את העוברים כך ששטח הסריקה ימולא בכמות גדולה ככל האפשר של דגי הזברפיש.

הגדירו את הגבול העליון של ה-Z-stack לנקודה שבה התאים כבר אינם במיקוד, תוך השארת מרווח נוסף של שלושה מיקרומטרים מעל הדגימה, לצורך גדילה ותנועת תאים. לאחר מכן, הגדירו את הגבול התחתון לנקודה שבה התאים כבר אינם נראים, והגדירו את גודל הצעד של מרווח ה-Z לשני מיקרומטרים. עבור הניסויים המוצגים כאן, כווןו את עוצמת לייזר הדימות, את ה-HV או ה-gain, ואת רמות ה-offset, בהתאמה, כפי שמופיע להלן.

לאחר קביעת הפרמטרים, הפסיקו את הסריקה כדי למנוע חשיפה מיותרת ללייזר שעלולה לגרום לפוטו-טוקסיות ולפוטו-בליצ'ינג של הדגימה. כעת, בחרו את סמל מיצוע השורות (line averaging) בפי 2, המספק את איכות התמונה הטובה ביותר ואת זמן הסריקה המהיר ביותר. בחרו את מרווח הזמן ואת משך הזמן המתאימים הדרושים לניסוי.

עבור חלוקות תאים של טיפוס פרא (wild-type), מרווחי זמן של שתי דקות למשך שעתיים מספיקים לקביעת משך המיטוזה. חלוקות המפעילות את נקודת הבקרה של הרכבת כישור המיטוטי (spindle assembly checkpoint) למשך יותר משלושים דקות מתאימות יותר למרווחי זמן של ארבע עד חמש דקות למשך ארבע שעות, וזאת כדי לשמר את הפלואורסצנציה, כפי שמוצג כאן. כדי לשמור את הקובץ באופן אוטומטי בזמן הרכישה, סמנו את תיבת "Save to File" ותנו שם לקובץ.

לבסוף, בדקו שוב שכל הפרמטרים הוגדרו נכון, ולחצו על Run Now. לאחר השלמת הרכישה, כדי להציג את הקובץ בפורמט תלת-ממדי, לחצו על סמל ה-Volume Threshold. דמות זו מדגימה את היכולת לצפות בחלוקות תאים רבות באמצעות שדה ראייה רחב של זנב דג זבנג (zebrafish) מסוג AB wild-type.

חלוקות התאים מסומנות בכוכביות. הסרטון התואם מוצג כאן. בממוצע, נצפו 50 תאים המתחלקים ב-AB, ו-30 תאים המתחלקים במוטציה של aurora B.

כדי להתחשב במספר המופחת של תאים במצב מיטוזה שצולמו בעוברים עם מוטציה ב-aurora B, חושב היחס בין מספר התאים במצב מיטוזה למספר התאים שצולמו, ממצא המצביע על כך שלא מדובר במספר נמוך יותר של תאים העוברים מיטוזה בעוברים עם מוטציה ב-aurora B, אלא במספר כולל נמוך יותר של תאים שצולמו. כדי לכמת את משך המיטוזה, הכפילו את מספר מקטעי הזמן הדרושים לחלוקה אחת של תא במקטע הזמן שבין כל Z-stack. כפי שניתן לראות בגרף זה, זמן החלוקה הממוצע ב-AB מסוג wild-type הוא 25 דקות, ו-58 דקות עבור המוטנט של aurora B.

כפי שנראה בעוברים מסוג בר (wild-type), ניתן להבחין בכל שלב של המיטוזה. עם זאת, בעובר מוטנט של aurora B נצפו פגמים מיטוטיים, הכוללים עצירה מיטוטית וכישלון של הציטוקינזה, שמובילים לתא דו-גרעיני וליצירה עוקבת של מיקרו-גרעינים, התומכים בזמן החלוקה המוארך שנמדד במוטנט זה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשעה אחת, החל מסריקת העוברים ועד להגדרת הפרמטרים של מיקרוסקופ הקונפוקלי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור את הקשרי הניסוי הנוכחי, ככל שהם נוגעים לאזור העניין, למשך הזמן, למרווחי הזמן ולעומק ה-Z. דבר זה יעזור למקסם את היעילות, וכן למנוע פוטובליצ'ינג (photobleaching) ופוטוטוקסיות. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון פריסת כרומוזומים, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לגורם לפגמים המיטוטיים שנצפו, או להשתמש בטיפול תרופתי כדי לקבוע את ההשפעות על התקדמות המיטוזה, משכה או גורל התא.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה לבחון מיטוזה בהקשר של ביולוגיה התפתחותית וביולוגיה של הסרטן באמצעות דגי zebrafish. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן הטמעת עוברים של zebrafish, ביצוע דימות חי של מיטוזה, וניתוח של תדירות המיטוזה, משכה וגורל התאים. זכרו כי עבודה עם לייזרים בעוצמה גבוהה ואור פלואורסצנטי עלולה להזיק לעיניים, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון הימנעות ממגע עיני ישיר עם הלייזרים, בעת ביצוע הליך זה.