Name: תאי בידוד ובתאי Mesangiogenic (MPCs) מן האדם מח עצם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: למדו לבודד תאי מזנכימוגניים (MPCs) ממח עצם אנושי לחקר רפואה רגנרטיבית. שיטה זו מאפשרת בידוד עקבי של תאים עם פוטנציאל אנגיוגני ומיזוגני ליישומים קליניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחברים במיוחד רוצה להודות ד&quot;ר פאולו פרחי, במחלקה כירורגית, רפואיים לפתולוגיה מולקולרית Critical Care Medicine, אוניברסיטת פיזה, למתן דגימות מח עצם ובקיאותו-אבות osteo אדם

הערה: לאחר הסכמה בכתב, דגימות HBM התקבלו במהלך ניתוח אורתופדי עבור החלפת מפרק הירך. מיד לאחר osteotomy בצוואר הירך ולפני הירך קודחות מזרק 20 מ&quot;ל המכיל 500 UI של הפרין, שימש לשאוב בע&quot;מ טריים. הפרוטוקול הוא ייחשב נרחב החלים על כל מקור בע&quot;מ. 1. בידוד של תאים mononuclear מח האדם עצם (HBM-MNCs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 5 - 10 מ&quot;ל של BM טרי 50 מ&quot;ל, החלת פתרון בופר פוספט של Dulbecco (D-PBS) ומערבבים על ידי היפוך. לא פחות להפיץ 25 מ&quot;ל בשני צינורות חרוטי חדש 50 מ&quot;ל, להוסיף 25 מ&quot;ל של D-PBS על צינור אחד ומערבבים על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הצינורות לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר, להפרדת שברי עצם ושומן מפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות שומן צף עם ההשעיה תא פיפטה ולסנן פסטר סטרילית דרך 70 מיקרומטר מסננים מבלי להפריע גלולה שבר העצם. </li> &lt;li&gt; הגדר ארבעה צינורות 50 מ&quot;ל עם 15 מ&quot;ל של מדיום עבור צנטריפוגה שיפוע צפיפות רציפה (1.077 גרם / מ&quot;ל). ודא כי המדיום הזה הוא בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות שכבה 20 - 25 מ&quot;ל של בדילול BM על גבי בינוני שיפוע צפיפות. בצע פעולה זו בזהירות, לתת זרזיף השעית תא על קירות הצינור כדי למנוע שכבות ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע צנטריפוגה שיפוע צפיפות ב 400 XG במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם נכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הטבעת לבנבן של תאים הממוקמים בין שני השלבים בעזרת פיפטה פסטר סטרילי ולהעביר אותו צינור 50 מ&quot;ל טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם מדיום תרבות טרי: גלוקוז נמוך, אדום ללא פנול (1,000 מ&quot;ג / ליטר) הבינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) ואקווה א.ב. בסרום סוג האדם (PhABS), 2 מ&quot;מ L- גלוטמין ו אנטיביוטיקה (DMEM / 10% PhABS). צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה ב 5 - 10 מ&quot;ל של DMEM טריים / 10% PhABS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ספירת תאים.לקבוע את מספר תאי הדם הלבנים ע&quot;י 1: 1 דילול trypan. זה החל על hemocytometer, ולבחון תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. אל תכלול אריתרוציטים קטן ומעוגל מושלם ותאים מתים כחולים מוכתם מן ספירת התאים. הערה: מומלץ מאוד כדי אצוות מסך PhABS לביצועים שלהם בהחלמה MPC. PhABS ממקורות ארה&quot;ב נתן תוצאות הטובות ביותר בעוד רוב סר ממוצא שונה הביא תרבויות MPC עם אחוזים גבוהים של תאי MSC הדמויים. </li></ol> בידוד 2. של MPCs מ-MNCs HBM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר צלוחיות T-75 הידרופובי עם 15 מ&quot;ל של PhABS טרי DMEM / 10% ולתת לאזן pH וטמפרטורה ידי הדגירה טרום ב 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 זרע - 6 x 10 7 HBM-MNCs לכל בקבוק לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק תאים בינוניים שאינם חסיד צלוחיות. הוסף 15 מ&quot;ל של PhABS DMEM / 10% טרי לדגור על 37 מעלות צלזיוסב 5% CO 2. לשמור על תרבויות למשך 6 - 8 ימים, שינוי בינוני כל 48 שעות. אופציונאלי: כדי להגדיל את תשואת MPC, לא חסידי תאי 2.3 יכולים להיות מחדש מצופים בבקבוק התרבות חדש ומתוחזק כמתואר עבור התרבויות העיקריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק בינוני צלוחיות, לשטוף עם DMEM טריים להוסיף 2 מ&quot;ל של פרוטאז חינם בעלי חיים ניתוק פתרון. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 - 15 דקות (למנוע דגירה ממושכת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של PhABS טרי DMEM / 10%, לשאוב את ההשעיה תא צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 - 2 מ&quot;ל של DMEM טריים / 10 PhABS%. המשך ספירת תאים כמתוארים בשלב 1.10. הערה: אל תשתמש טריפסין / EDTA כמו ניתוק מגיב. MPCs הוא טריפסין עמיד. הקרנה מורפולוגי של התרבויות, לפני קטיף תא, מומלצת מאוד כדי להעריך הנוכחות של תאי MSC הדמוי דמוי כישור. בסכום תיקים רב של תאי MSC הדמויים הם דetected, להגדיל את הטוהר של מוצר התא על ידי הסרת התאים המזוהמים באופן סלקטיבי. לשם כך, עיכול טריפסין יכול להתבצע לפני קצירת MPC, על ידי הוספת 2 מ&quot;ל של טריפסין / EDTA 0.05% למשך 2 דקות. תרבויות שטפו פעמיים עם 5 מ&quot;ל של DMEM / 10% PhABS, ולאחר מכן להמשיך פרוטאז טיפול כנ&quot;ל. </li></ol> אפיון Cell 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר דגימות כפולות של 10 תאים 5 טריים מנותקים בתמיסת כביסה: D-PBS בתוספת 0.5% (v / v) אלבומין בסרום שור (BSA) ו- 0.02% (w / v) יזיד הנתרן. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות. זהירות: אזיד הנתרן הוא רעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות כדורים ב 200 μl של פתרון כביסה ולהוסיף אנטי CD90, אנטי CD45, אנטי CD73 נוגדנים נגד CD31 מצומדות עם צבעי ניאון ( &quot;TEST&quot;); במקביל להגדיר בקרת isotype ( &quot;CTRL&quot;). הערה: סכומים של מכתים נוגדנים צריכים להיקבע על ידי טיטרציה או אקורדינג להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות. Re להשעות תאי 500 μl של פתרון כביסה ולרכוש לפחות 5 x 10 4 אירועים על תזרים ססגוני cytometer 7 9 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התוצאות על ידי חלקות-נקודה ולהשתמש &quot;CTRL&quot; אירועים שנרשמו להגדיר רביעים. הערה: על מנת להגדיר את התרבות כתרבות MPC אחוז CD73 נג CD90 נג CD45 + CD31 + תאים צריך להיות מעל 95%. עבור יישומים ספציפיים מסוימים, כלומר, ניתוח ביטוי גנים, חתוכי ההתאוששות צריך להיות מוגברים עד 97 - 98%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי Nestin וניתוח ארגון F- אקטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט MPCs טרי הפרד, שקופיות קאמרית תרבות (20,000 / 2 ס&quot;מ). אפשר תאים לדבוק ידי דגירת לילה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים בתמיסה וסיבי כביסהx ב 4% (w / v) פסקה פורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. כדי להסיר מקבע ולהוסיף פתרון כביסה, דגירה במשך 2 דקות ויוצקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור כביסה פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Permeabilize ברה-PBS בתוספת 0.05% (v / v) טריטון X-100 במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצוות ידי משפר אות בחינם חלבון (30 דקות &#39;ב RT) או פתרון חסימה סטנדרטי (D-PBS בתוספת 3% (w / v) BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר משפר אות / חסימת פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 7 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(w / v) של נוגדן ראשוני nestin אנטי אנושי דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתא humidified. במקביל, השתמש נוגדנים לשלוט isotypic להעריך אותות קרינה ספציפיים לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות על ידי הוספת D-PBS, להשאיר למשך 2 דקות ויוצקים. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(w / v) של נוגדנים משני מצומדות צבע פלואורסצנטי דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מחליק כנ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Phalloidin ניאון (5 UI / ml), לעזוב ב RT במשך 30 מ &#39;ב בחושך לשטוף 3 פעמים ב D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקירות קאמריים הר שקופיות במדיום הרכבה מימית בתוספת antifade מגיב 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לגילוי גרעינים. המשך הדמיה 7 9 10. </li></ol></li></ol> 4. בידול Mesengenic של MPCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 2 x 10 4/2 ס&quot;מ MPCs מבודדים טרי צלוחיות תרבות T75 TC שטופלו ולתת תאים לדבוק לילה DMEM / 10% PhABS על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף DMEM / 10% PhABS עם המדיום סרום מופחת רגיל, כ -200 μl / 2 ס&quot;מ, המיועד (בינוני MSC-RS) הרחבת התא סטרומה mesenchymal. לגדל תאים כדי מפגש (P1-MSCs), בדרך כלל 7 עד 10 ימים מיום האינדוקציה. רענן בינוני כל 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק בינוני צלוחיות, לשטוף עם המדיום MSC-RS טריים להוסיף 2 מ&quot;ל של פרוטאז חינם בעלי חיים ניתוק פתרון. לדגור על 3776; צלזיוס למשך 5 - 15 דקות (למנוע דגירה ממושכת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של מדיום MSC-RS טריים, לשאוב את ההשעיה תא צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 - 2 מ&quot;ל של מדיום MSC-RS טריים. המשך ספירת תאים כמתואר בשלב 1.10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך-תת תרבות להם על ידי זריעת 3 - 5 x 10 תאים 3/2 ס&quot;מ. לגדל תאים כדי מפגש (P2-MSCs). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי עיכול פרוטאז כמתואר משלב 4.3 לשלב 4.5 והמשך אפיון כמפורט בסעיף 3. הערה: אחוז של CD73 + CD90 + CD45 נג תאי CD31 נג נמוך מ -95% היה מצביע רק בידול חלקי ודורש מעבר תרבות נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> P2-MSCs פלייט ב 2 x 10 4 / cm 2 בשישה גם צלחות TC שטופלו ולגדול מפגש במדיום MSC-RS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מארק שתי בארות כמו &quot;אין הבדל&quot; ולרענן בינוני MSC-RS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מארק שני גםים כמו &quot;osteo&quot; ולהחליף בינוני עם 200 μl / 2 ס&quot;מ של מדיום osteogenic סטנדרטי, שתוכננה במיוחד עבור בידול MSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מארק שתי בארות כמו &quot;Adipo&quot; ולהחליף בינוני עם 200 μl / 2 ס&quot;מ של מדיום adipogenic סטנדרטי, שתוכננה במיוחד עבור בידול MSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תרבויות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 על ידי שינוי התקשורת כולה כל 48 שעות. הערה: מומלץ מאוד להשתמש תקן זמינה מסחרי מדיה הבחנה עבור שחזור מבחן. אחרי 2/3 שבועות בתנאי הבחנה, משקעי סידן להופיע בתרבויות מושרות osteogenic, תוך הצטברות טיפות שומנים תאיות ניכרת בתא מושרה adipogenic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק תקשורת ותרבות ולאחר מכן לשטוף עם D-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן התרבויות על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של 4% (w / v) פסקה פורמלדהיד במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר מקבע להוסיף D-PBS, דגירה במשך 2 דקות ויוצקים. חזור כביסהפעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם אחד &quot;אין הבדל&quot; יחד עם שני &quot;osteo&quot; מסומן בארות בתמיסת ניאון ספציפית hydroxyapatite ואחד &quot;אין הבדל&quot; יחד עם שני &quot;Adipo&quot; מסומן בארות 200 פתרון אדום ננומטר הנילוס. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 11,12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מכתים פתרונות ולשטוף D-PBS פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר D-PBS, להוסיף D-PBS בתוספת 50% (v / v) גליצרין והמשך הדמיה 7 9 10. </li></ol> 5. MPC אליפטית Assay הנבטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר spheroids 3D, שכב 20 טיפות μl של השעיה MPC מבודדים טרי (1.5 x 10 4 תאים / ירידה) על המשטח הפנימי של מכסה צלחת פטרי. הערה: ככל טיפות טיפול עלולות להוביל לקרע שלהם, זה מאוד לא מומלץ להניח להם עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להשתמש במכסה כדי לסכם בצלחת פטרי המכילות D-PBS כדי למנוע תלוי טיפות אידוי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2לילה כדי לאפשר לתאים המצרפי spheroids 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר ג&#39;ל סמיך של מטריקס בעכברים (ECM) חלבונים על ידי הוספת 300 aliquots μl של חלבוני ECM סטנדרטיים צלחת תרבות מראש בקירור 24 גם, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להתהפך מכסת צלחת פטרי בעדינות להרים את spheroids בעזרת פיפטה פסטר סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נח spheroids על ג&#39;ל חלבון ECM, להוסיף 700 aliquots μl של מדיום גידול תא האנדותל VEGF-עשיר רגיל ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות ו 7 ימים של תרבות, לצלם את תרבויות 3D בהספק הגדלת 4X. להעריך מבצבצות spheroids החלת תוכנת ניתוח תמונה על ידי מדידת המרחק הרדיאלי בין תא הפולש האחרון והקצה אליפטית. צעדים חזרו יחד לפחות 20 בכיוונים שונים. המרחק הממוצע הוא ייחשב כחיובי כאשר 50 מיקרומטר או מעל. </li></ol>

<ol><li>Stoltz, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+and+Regenerative+Medicine%3A+Myth+or+Reality+of+the+21th+Century%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Stem Cells and Regenerative Medicine: Myth or Reality of the 21th Century.</a> Stem Cells Int. 2015, 734731(2015).</li>
<li>Pacini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+and+stochastic+approaches+in+the+clinical+application+of+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Deterministic and stochastic approaches in the clinical application of mesenchymal stromal cells (MSCs).</a> Front Cell Dev Biol. 2, 50(2014).</li>
<li>Galvez, P., Clares, B., Hmadcha, A., Ruiz, A., Soria, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cell-based+medicinal+product%3A+regulatory+structures+in+the+European+Union%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Development of a cell-based medicinal product: regulatory structures in the European Union.</a> Br Med Bull. 105, 85-105 (2013).</li>
<li>Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+in+the+development+of+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Risk factors in the development of stem cell therapy.</a> J Transl Med. 9, 29(2011).</li>
<li>Petrini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+mesodermal+progenitor+cells+from+human+adult+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow.</a> Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).</li>
<li>Trombi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+culture+of+mesodermal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Selective culture of mesodermal progenitor cells.</a> Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).</li>
<li>Pacini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+pluripotency-associated+genes+in+mesodermal+progenitor+cells+%28MPCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of pluripotency-associated genes in mesodermal progenitor cells (MPCs).</a> PLoS One. 5 (3), 9861(2010).</li>
<li>Pacini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+integrin+expression+is+associated+with+podosome-like+structures+on+mesodermal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Specific integrin expression is associated with podosome-like structures on mesodermal progenitor cells.</a> Stem Cells Dev. 22 (12), 1830-1838 (2013).</li>
<li>Fazzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+progenitor+cells+%28MPCs%29+differentiate+into+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29+by+activation+of+Wnt5%2Fcalmodulin+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesodermal progenitor cells (MPCs) differentiate into mesenchymal stromal cells (MSCs) by activation of Wnt5/calmodulin signalling pathway.</a> PLoS One. 6 (9), 25600(2011).</li>
<li>Tormin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146+expression+on+primary+nonhematopoietic+bone+marrow+stem+cells+is+correlated+with+in+situ+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD146 expression on primary nonhematopoietic bone marrow stem cells is correlated with in situ localization.</a> Blood. 117 (19), 5067-5077 (2011).</li>
<li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+red%3A+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).</li>
<li>Wang, Y. H., Liu, Y., Maye, P., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+mineralized+nodule+formation+in+living+osteoblastic+cultures+using+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Examination of mineralized nodule formation in living osteoblastic cultures using fluorescent dyes.</a> Biotechnol Prog. 22 (6), 1697-1701 (2006).</li>
<li>Horwitz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarification+of+the+nomenclature+for+MSC%3A+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).</li>
<li>Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of mesenchymal stem cells.</a> J Hematol Oncol. 5, 19(2012).</li>
<li>Si, Y. L., Zhao, Y. L., Hao, H. J., Fu, X. B., Han, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSCs%3A+Biological+characteristics%2C+clinical+applications+and+their+outstanding+concerns%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">MSCs: Biological characteristics, clinical applications and their outstanding concerns.</a> Ageing Res Rev. 10 (1), 93-103 (2011).</li>
<li>Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+expression+and+immunologic+properties+of+differentiated+and+undifferentiated+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells.</a> Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).</li>
<li>Phinney, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cell+populations%3A+clues+to+their+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy.</a> Cell Cycle. 6 (23), 2884-2889 (2007).</li>
<li>Phinney, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells%3A+implications+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: implications for cell therapy.</a> J Cell Biochem. 113 (9), 2806-2812 (2012).</li>
<li>Tolar, J., Le Blanc, K., Keating, A., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+hitting+the+right+spot+with+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: hitting the right spot with mesenchymal stromal cells.</a> Stem Cells. 28 (8), 1446-1455 (2010).</li>
<li>Corselli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tunica+adventitia+of+human+arteries+and+veins+as+a+source+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 21 (8), 1299-1308 (2012).</li>
<li>Bieback, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+alternatives+to+fetal+bovine+serum+for+the+expansion+of+mesenchymal+stromal+cells+from+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow.</a> Stem Cells. 27 (9), 2331-2341 (2009).</li>
<li>Watson, L., Elliman, S. J., Coleman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+isolation+to+implantation%3A+a+concise+review+of+mesenchymal+stem+cell+therapy+in+bone+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">From isolation to implantation: a concise review of mesenchymal stem cell therapy in bone fracture repair.</a> Stem Cell Res Ther. 5 (2), 51(2014).</li>
<li>Pacini, S., Petrini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+MSCs+angiogenic+cells%3F+New+insights+on+human+nestin-positive+bone+marrow-derived+multipotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Are MSCs angiogenic cells? New insights on human nestin-positive bone marrow-derived multipotent cells.</a> Front Cell Dev Biol. 2, 20(2014).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי אינטרסים אחרים.

בעשורים האחרונים, MSCs נחקרו בהרחבה והוערכו פרה-קלינית ליישום אפשרי בטיפול בהפרעות שונות של עצמות/מפרקים, אימונולוגיות, נוירולוגיות, לב וכלי דם, מערכת העיכול והמטולוגיות14,15. הבידוד הקל והזול של MSCs רב-פוטנטיים, מרקמות רבות ושונות, יחד עם היעדר אימונוגניות משמעותית16, תורמים להפיכת תאים אלה לאחת מאוכלוסיות התאים המעניינות ביותר ליישום בטיפולים מבוססי תאים. עם זאת, השכיחות הנמוכה מאוד ברקמת המקור מייצגת מגבלה גדולה ליישום MSCs במרפאות, מה שמאלץ את הרחבת התאים הללו, במבחנה, לפני העירוי או ההשתלה. 
תרביות MSC מורחבות חשפו דרגות גבוהות של הטרוגניות ושונות17-19 , מה שמקשה על הגעה להסכמה לגבי פרוטוקולי ייצור ואפיון MSC. יתר על כן, מחקרים אחרונים הצביעו על נוכחות של אבות קדמונים מרובים in vivo MSC במגוון רחב של רקמות, התורמים להטרוגניות תרבית10,20. למעשה, הוצע כי תנאי תרבית מסוימים עשויים לבחור או פשוט לקדם תת-אוכלוסיות ספציפיות של אבות MSCs הנמצאים באחוזים שונים בדגימות "גולמיות" ולא מעובדות כמו מח עצם (hBM-MNCs) או רקמות שומן (מקטע כלי דם סטרומלי)2. לפיכך, השונות באוכלוסיות התאים היוזמים MSC יחד עם המספר הרב של פרוטוקולי העשרה/בידוד ותרבית שונים המיושמים, מהווים מכשול גדול להגדרה של טיפולים מבוססי MSC אפשריים.
גורם מכריע המשפיע על ההטרוגניות של תרביות MSC הוא תוספי סרום21. בידינו, החלפת FBS ב-PhABS בתרביות ראשוניות מ-hBM-MNCs, בשילוב עם זריעה בצפיפות גבוהה על פלסטיק הידרופובי, הובילה לבידוד של אוכלוסיית תאים חדשה בעלת דבקות גבוהה עם מאפיינים ביולוגיים מובהקים בשם MPCs5,6. ראינו כי תוספת של אחוזים קטנים של PhABS לתרביות ראשוניות של FBS אפשרה גם בידוד MPC, מה שמרמז על נוכחות של חומרים מעוררי MPC בסרום האנושי6. כרגע, פרוטוקול הבידוד/אפיון MPC הוא שיטה ייחודית הזמינה להשגת MPCs כמעט טהורים. הפרוטוקול הותאם בקפידה והוא ניתן לשחזור מאוד להקרנה איכותית של תכשירי MPC לפני יישומים נוספים.
MPCs יכולים לשמש כמקור לייצור MSC, ובכך להגביל את השונות המוצגת על ידי שימוש בחומר מוצא לא מקוטע. ההגדרה המדויקת של השלבים המרובים המאפיינים התמיינות מזנגנית של MPC שדווחה9 תאפשר התרחבות תאים מזנכימלית מסונכרנת. עם זאת, מצב אחרון זה יכול להתממש אך ורק באמצעות אוכלוסיית MPC מטוהרת מאוד, כתוצאה מאפיון תוצרי התאים המתקבלים על ידי הפרוטוקול המתואר כאן, תוצאות בעלות חשיבות מכרעת. שיטת בידוד זו דווחה ומאפשרת התאוששות MPC עם טוהר בדרך כלל בסביבות 95%. עם זאת, שונות של תורם/מטופל יחד עם השונות הקשורה לאצוות השונות של סרום מאוגד אנושי מיושם, עלולה להוביל לאחוז משמעותי של תאים דמויי MSC מבודדים יחד עם MPCs, בתנאים סלקטיביים. 
לא ברור אם תאים דמויי MSC "מזהמים" אלה יכולים לנבוע מאבות ה-in vivo השונים האחרים המתוארים במח עצם22 או מהתמיינות MPC לא מבוקרת וספונטנית. בכל מקרה, אחוז עקבי של תאים דמויי MSC בתוצרי MPC מבטל את האפשרות ליישם תאים אלה כחומר מוצא הומוגני להרחבת ה-MSC. לפיכך, כאן הוצעה שיטה פשוטה וזולה, המבוססת על עמידות MPC לעיכול טריפסין, מה שמגביר את טוהר מוצרי ה- MPC. תוצאות דומות או אפילו טובות יותר בטיהור תרביות MPC יכולות להיות מושגות על ידי מיון תאים פלואורסצנטיים או מגנטיים המבצע דלדול CD73 ו/או CD90, אך מאריך משמעותית את זמן התהליך ומגדיל את העלויות.
יתר על כן, MPCs הראו ביטוי של סמנים הקשורים לפלוריפוטנטיות ו-Nestin, כולם אבדו במהירות במהלך התמיינות מזנגנית7. בדיקת הנבטה חשפה יכולת MPC לפלוש לג'ל חלבון ECM של עכברים. יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך שיש להתייחס ל-MPCs כאב קדמון לא בוגר יותר, השומר על פוטנציאל אנגיוגני. עם זאת, ההתלהבות הראשונית לגבי פוטנציאל ההתמיינות המזודרמלי של MPCs דועכת. למעשה, לאחר יותר מ-7 שנים של מחקרים על MPCs, פוטנציאל מזנגני ואנגיוגני תוארו בהרחבה5-9, אך עדיין חסרה התמיינות כלפי כל תא אחר ממוצא מזודרמלי. לפיכך, כאן אנו מציעים הגדרה חדשה וקפדנית יותר של תאים אלה כ"תאי אב מסנגיוגניים", תוך שמירה על ראשי התיבות MPCs.
אנו גם מאמינים שרוב המחלוקות לגבי הפוטנציאל האנגיוגני של MSC יכולות להיות קשורות להרכב ההטרוגני של תרביות מורחבות המורכבות מתת-אוכלוסיות של MPCs ו-MSCs באחוזים משתנים23.
לבסוף, MPCs יכולים גם למלא תפקיד מכריע ביישום CBMPs הרלוונטיים לשחזור רקמות, מכיוון שתאים אלה יכולים גם לתמוך בניאו-וסקולריזציה. למעשה, מחקרים עתידיים על התחדשות צריכים לקחת בחשבון שצמיחת הרקמה החדשה שנוצרה צריכה להיות נתמכת על ידי ניאו-אנגיוגנזה במקביל. הקיום המשותף של פוטנציאל מזנגני ואנגיוגני ב-MPCs יכול לשפר משמעותית את פוטנציאל ההתחדשות של גישות טיפוליות חדשות הכוללות תאים מעניינים אלה.

תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) הם בעלי ערך קליני רלוונטי עבור קיבולת בידול רב השושלת שלהם ואת יכולתם לתמוך hemopoiesis, להפריש גורמי גדילה / ציטוקינים כמו גם לשחק תפקיד immunoregulation 1. בהגדרה של ייצור ויישום תא טיפולים מבוססים MSC כבר מושא המחקר קליני הנרחב טרום קליני 2, תוך שימת דגש מיוחד ברגולציה בינלאומית ספציפית את הבטיחות והיעילות של תא מבוסס מוצר רפואי (CBMP) טיפולים 3. MSCs אדם מתורבתים בהרחבה בתקשורת המכיל תוספי ריאגנטים מן החי, כגון בסרום שור העובר (FBS) טריפסין שור. לכן, לצד סיכונים זיהומיות הקשורות מניפולצית תא, חולים גם להתמודד עם חשיפת פריון וכן סיכונים אימונולוגיים צמודים חלבונים, פפטידים או ביומולקולות אחרות מן החי שיכולים נמשך לאחר תא קציר transplantation 4. כדי לעקוף את הבעיה, אנחנו מתורבתי מח עצמות אדם (HBM) MSCs -derived במדיום חיה ללא, החלפת FBS עם סרום סוג AB אדם אסף (PhABS). בתנאים אלה, לצד MSCs גדל זיהינו אוכלוסיית תא רומן. תאים אלה היו מורפולוגית phenotypically שונה MSCs והראו פרופיל ביטוי גנים ייחודי וכן נכסי הידבקות מאפיין גידול /. הם שמרו הוא mesengenic ו angiogenic פוטנציאל ולכן נקראו תאי mesodermal ובתאים (MPCs) 5. בהמשך לכך, הצלחנו להגדיר תנאי תרבות סלקטיבית לשחזור כדי ליצור MPCs על ציון גבוה של טוהר 6. בנוסף, אנו חקרנו את תכונות מורפולוגיות ביולוגיות של MPCs. MPCs הראה להיות nestin החיובי, איטי ב אופניים, Ki-67-שליליים, ועם הכרומוזומים מאופיינים טלומרים ארוכים 5. הם הביעו plurשעתוק הקשורים ipotency גורמי אוק-4 ו Nanog ולא רגולטורים MSC Runx2 ו Sox9 7. Phenotypically, MPCs הביע endoglin (CD105) ברמה נמוכה יותר מאשר MSCs כאשר לא היתה להם mesenchymal סמנים CD73, CD90, CD166. MPCs גם הראה בדפוס ייחודי של מולקולות הדבקה מאופיין ביטוי עקבי של PECAM (CD31), integrins αL (CD11a), αM (CD11b), αX (CD11c) וכן β2 integrin (CD18) באופן ספציפי ומקיים מבנים podosome דמוי 8 . במדיה הרחבים MSC סטנדרטיים, MPCs הבדיל מייד לתוך MSCs דרך שלב ביניים המציג את הפעלת תא Wnt5 / calmodulin איתות 9. MPCs גם שומרים על תכונותיהם angiogenic, כפי שהוכח על ידי יכולתם צומחים מתוך spheroids ב מטריקס בעכברים (ECM) תרבויות 3D חלבון. פוטנציאל angiogenic אבד במהירות לאחר בידול MPC לאורך שושלת mesengenic. כאן אנו מציגים פרוtocols אופטימיזציה לבודד ולאפיין MPCs נקיים במיוחד מדגימות דם HBM. פרוטוקולים לשחזור עבור mesengenic MPC והבחנה angiogenic מתוארים גם.

<table><tbody><tr><td>מטריצת ממברנת מרתף Matrigel</td><td>BD Bioscience (סן חוזה, קליפורניה-ארה"ב)</td><td>354230</td><td>חלבוני ECM עכבריים ריכוז מלאי: 100% (9 - 12 מ"ג/מ"ל) ריכוז סופי: 100%</td></tr> <tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco (D-PBS)</td><td>Sigma (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m מסננים</td><td>Miltenyi Biotec (BergischGladbach, גרמניה)</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM&nbsp;</td><td>GE Healthcare (אופסלה, שוודיה)</td><td>17-5442-03</td><td>בינוני לצנטריפוגה שיפוע בצפיפות לא רציפה</td></tr><tr><td>סרום אנושי מסוג AB (PhABS)</td><td>LONZA (Walkersville MD-USA)</td><td>14-490E</td><td>ריכוז סופי: 10%</td></tr> <tr><td>Glutamax-I</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp; MA ארה"ב)</td><td>35050-038</td><td>L-גלוטמין מיוצב ריכוז מלאי: 100x ריכוז סופי: 2 מ"מ</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>סיגמא (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>A8412</td><td>ריכוז מלאי: 7.5% ריכוז סופי: 0.5%</td></tr> <tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>S8032</td><td>ריכוז סופי: 0.02%</td></tr> <tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין (Pen Strep)</td><td>Gibco ( גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב)</td><td>15070-063</td><td>אנטיביוטיקה ריכוז מלאי: 5,000 UI/ml פניצילין, 5,000 & #956; גרם/מ"ל סטרפטומיצין ריכוז סופי: 50 UI/ml פניצילין, 50 &#956; גרם/מ"ל בקבוק תרבית סטרפטומיצין</td></tr><tr><td>T-75 לתרביות תרחיף</td><td>גריינר ביו-וואן&nbsp; (פריקנהאוזן, גרמניה)</td><td>658 190</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית T-75 TC מטופל</td><td>Greiner Bio-one&nbsp; (פריקנהאוזן, גרמניה)</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp; MA ארה"ב)</td><td>12563-011</td><td>תמיסת ניתוק פרוטאזות ללא בעלי חיים ריכוז מלאי: 1x ריכוז סופי: 1x</td></tr><tr><td>טריפסין/EDTA</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp; MA ארה"ב)</td><td>15400-054</td><td>פנול אדום חופשי ריכוז מלאי: 0.5% ריכוז סופי: 0.25%</td></tr> <tr><td>נוגדן נגד CD90 APC&nbsp; (CD90)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)</td><td>130-095-402</td><td>ריכוז סופי: 1:40</td></tr><tr><td>נוגדן anti-CD45 APC-Vio770 (CD45)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)</td><td>130-096-609</td><td>ריכוז סופי: 1:40</td></tr><tr><td>נוגדן anti-CD73 PE (CD73)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)</td><td>130-095-182</td><td>ריכוז סופי: 1:40</td></tr><tr><td>נוגדן anti-CD31 PE Vio-770 (CD31)</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)</td><td>130-105-260</td><td>ריכוז סופי: 1:40</td></tr><tr><td>נוגדן IgG1 APC של עכבר</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)</td><td>130-098-846</td><td>ריכוז סופי: 1:40</td></tr><tr><td>נוגדן IgG2a APC Vio770 של עכבר</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)</td><td>130-096-637</td><td>ריכוז סופי: 1:40</td></tr><tr><td>נוגדן IgG1 PE של עכבר</td><td>MiltenyiBiotec ( BergischGladbach, גרמניה)</td><td>130-098-845</td><td>ריכוז סופי: 1:40</td></tr><tr><td>נוגדן IgG1 PE Vio-770</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)</td><td>130-098-563</td><td>ריכוז סופי: 1:40</td></tr><tr><td>גלוקוז נמוך Dulbecco Modified Eagle Medium&nbsp; (DMEM)</td><td>ThermoFisher (וולת'אם,&nbsp; MA ארה"ב)</td><td>13-1331-82</td><td>פנול ללא אדום מינימלי חיוני בינוני ריכוז מלאי: 1,000 מ"ג/ליטר גלוקוז</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp; (FBS)</td><td>ThermoFisher (וולת'אם,&nbsp; MA ארה"ב)</td> <td>10500</td><td>ריכוז מלאי: 0.2 מ"ג/מ"ל ריכוז סופי: 2 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>מגיב אנטי-פייד Prolong Gold עם 4',6-diamidino-2-phenylindole</td><td>Invitrogen (Waltham, MA,&nbsp; ארה"ב)</td><td>P-36931</td><td>מדיום הרכבה מימי + DAPI ריכוז סופי: 1x</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>P6148</td><td>Fixative ריכוז סופי: 4%</td></tr><tr><td>LAB-TEK מגלשות תא דו-בארות</td><td>סיגמא (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>C6682</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד נסטין [שיבוט 10C2]</td><td>Abcam (קיימברידג', בריטניה)</td><td>ab2035</td><td>ריכוז מלאי: 1 מ"ג/מ"ל ריכוז סופי: 7 &mu; גר'/מ"ל</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Phalloidin</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp; MA ארה"ב)</td><td>A34055</td><td>ריכוז מלאי: 200 UI/ml ריכוז סופי: 5 UI/ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Euroclone (מילאנו, איטליה)</td><td>EMR237500</td><td>ריכוז סופי: 0.05%</td></tr> <tr><td>MesenPRO RS בינוני&nbsp; (מדיום MSC-RS)</td><td>ThermoFisher (וולת'אם,&nbsp; MA ארה"ב)</td> <td>12746-012</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ערכת SFX נגד עכבר</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp; MA ארה"ב)</td> <td>A31619</td><td>נוגדן משני נגד עכבר עיזים + משפר אותות ריכוז מלאי: 2 מ"ג/מ"ל ריכוז סופי: 2 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>פסטר פיפטה</td><td>Kartell Labware&nbsp; (Noviglio (MI), איטליה )</td><td>329</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS AdipoDiff&nbsp; מדיה</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)</td><td>130-091-679</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS OsteoDiff&nbsp; מדיה</td><td>MiltenyiBiotec (BergischGladbach, גרמניה)</td><td>130-091-678</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת מינרליזציה של עצם Osteoimage</td><td>LONZA (Walkersville MD-USA)</td><td>PA-1503</td><td>תמיסת צביעה פלואורסצנטית ספציפית הידרוקסיאפטיט</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי פוליסטירן</td><td>גריינר ביו-וואן (Kremsm&uuml; nster אוסטריה)</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>ThermoFisher (Waltham,&nbsp; MA ארה"ב)</td><td>N1142</td><td>תמיסת צביעה פלואורסצנטית לשומנים ריכוז מלאי: 100 מ"מ ריכוז סופי: 200 ננומטר</td></tr><tr><td>גליצרין</td><td>סיגמא (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>G2289</td><td>ריכוז סופי: 50%</td></tr> <tr><td>צלחות פטרי פוליסטירן</td><td>סיגמא (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>גריינר ביו-וואן GmbH (פריקנהאוזן, גרמניה)</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>מדיום גידול אנדותל, EGM-2 BulletKit&nbsp; (EGM-2)</td><td>LONZA (ווקרסוויל MD-ארה"ב)</td><td>CC-3162</td><td>מדיום גידול תאי אנדותל עשיר ב-VEGF</td></tr><tr><td>Leica Qwin Image Analisys Software</td><td>Leica (Wetzlar, גרמניה)</td><td></td><td>תוכנת ניתוח תמונה</td></tr></tbody></table>

תאי בידוד ובתאי mesangiogenic (mpcs) מן האדם מח עצם

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

במחקר שמטרתו לבודד תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) שמקורם במח עצם אנושי (hBM) ליישומים קליניים, זיהינו אוכלוסיית תאים חדשה שנבחרה במיוחד לגידול במדיום תוסף סרום אנושי. תאים אלה מאופיינים בתכונות מורפולוגיות, פנוטיפיות ומולקולריות הנבדלות מ-MSCs וקראנו להם תאי אב מזודרמליים (MPCs). MPCs הם עגולים, עם אזור ליבה עבה מאוד; הם מראים היצמדות חזקה ועמידה לטריפסין לפלסטיק. כישלון להרחיב את ה-MPC חשף ישירות שהם איטיים במחזור. זה כפי שמוצע גם על ידי שליליות Ki-67. מצד שני, גידול MPCs במדיום סטנדרטי המיועד להרחבת MSC, הוליד אוכלוסייה של תאים דמויי MSC הגדלים באופן אקספוננציאלי. מלבד הפגנת יכולת התמיינות מזנכימלית, MPCs שמרו על פוטנציאל אנגיוגני, מה שמאשר את אופי האב הקדמון המרובה שלהם. כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי בעל יכולת שחזור גבוהה לבידוד ואפיון hBM-MPCs על ידי ציטומטריית זרימה (CD73, CD90, CD31 ו-CD45), ביטוי נסטין וארגון F-actin. ניתנים גם פרוטוקולים להתמיינות מזנגנית ואנגיוגנית של MPCs. כאן אנו מציעים גם מינוח מתאים יותר לתאים אלה, ששמו שונה ל"תאי אב מסנגיוגניים".

התנאים תרבות סלקטיבית המתואר כאן אפשרו את הבידוד של רומן חסיד וכמעט חַד צוּרָתִי אוכלוסיית תאים כמו 1.0% של HBM-MNCs (0.5 - 2.0 x 10 6 HBM-MNCs מן 5 - 10 מ&quot;ל של דגימות BM טרי) 5,6 . זיהינו הגדולות האלה (40 - 60 מיקרומטר קוטר), מעוגל, שוקט, תאים Ki-67-שליליים כמו MPCs 5. מורפולוגית, הם מאופיינים בכושר-ביצת עין ייחודי עם אזור ליבה עבה מוקף בפריפריה דקה שטוחה מראה המון filopodia בהספק בהגדלה גבוה יותר (חצים לבנים ב א 1. איור 1). התארכות פולאר של גבול התא החיצוני הוא נצפה לעיתים קרובות (חיצים שחורים ב א 1. איור 1). מורפולוגיה כזו היא שונה בבירור מן מראה תא סטרומה mesenchymal הטיפוסי בצורת הכישור דיווח בתרבויות MSC סטנדרטיות. Cytometry זרימה הראתה מעל 95% של MPCs המבודד טרי להביע CD31 ו CD45 בעוד מ &#39;esenchymal סמנים הקשורים CD90 ו CD73 13 היו (א .2 איור 1) לגילוי. אנו רואים קבוצה המוגבלת הזאת של ארבעה אנטיגנים כמו אינדיקציות על MPCs. בהמשך סימני ההיכר של MPCs הם הפצה המקווקו F- אקטין חושף מספר מבנים דמויי podosome (אדום באיור 1 א .3) וביטוי אינטנסיבי של nestin (ירוק באיור 1 א .3), אשר לא זוהה בתאים מוכתם נוגדן שליטה isotypic (מידע לא מוצג). MPCs Culturing ב RS סטנדרטי שנועד בינוני עבור תוצאות הרחבה MSC התמיינות מהירה לתאים MSC דמוי גדל באופן אקספוננציאלי (איור 1 ב&#39;1). לאחר שני קטעים תאים לבסוף לעבור הפנוטיפ שלהם CD73 נג CD90 נג CD45 + CD31 + כדי CD73 + CD90 + CD45 נג CD31 נג (איור 1 ב .2). תוך כדי כך, MPCs מחדש organize F- אקטין לתוך סיבי מתח תוך ביטוי nestin הופך מרותק כמה תאים נדירים (איור 1 ב .3). בידול MPC mesengenic לתוך פנוטיפ MSC הדמוי מובהק מתרחש באמצעות שני צעדים ברורים שעולים מורפולוגיה תאים שונות. לאחר שבוע במדיום MSC RS אוכלוסייה שיורית של תאים דמויי MPC עדיין לזיהוי בתוך שכבת ומחוברות של שטוח, תאים רב-קנים מצולעים (P1-MSCs באיור 2 א). קטע נוסף נדרש כדי להשיג תרבות חַד צוּרָתִי כמעט של תאי MSC הדמוי דמוי כישור (P2-MSCs באיור 2 א). אקספוננציאלית גדל אלה תאים יכולים להתמיין אוסטאובלסטים או adipocytes בקלות כאשר מועברים לתוך התקשורת סלקטיבית עבור 2 שבועות לפחות, ובכך אישר הטבע MSC שלהם. בתרבויות מושרות osteogenic, משקעי סידן יכולים להיות מזוהים על ידי או כתם Alizarin-S colorimetric או צבעי ניאון ספציפיים (ירוק B איור 2). לאחר תאים אינדוקציה adipogenicלהראות הצטברות אגל השומנים כפי שעולה גם כתם אדום אדום שמן colorimetric או פלורסנט הנילוס (אדום B איור 2). הקלדת MPC אושרה על ידי הנבטת assay אנגיוגנזה. MPCs הראה יכולתם לפלוש (למעלה מ -50 מיקרומטר) ג&#39;ל murine ECM חלבון מן spheroids 3D לאחר 24 שעות VEGF-גירוי (איור 2 ג). לאחר תאים פולשים שבוע התגלו ב 300 - 600 מרחק מיקרומטר. לעומת זאת, יכולת פלישה אבדה P2-MSCs לאחר בידול mesengenic (איור 2 ד). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54225/54225fig1.jpg" /> איור 1. MPCs מבודדים טרי יש מאפיינים ייחודיים. Culturing HBM-MNCs ב DMEM / 10% PhABS במשך שבעה ימים מוליד אוכלוסייה של MPCs שקט (א) להבחין בקלות בין MSCs (B) </strong&gt; מבחינת מורפולוגיה (א .1, ב&#39;1, ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר), פנוטיפ (א .2, ב .2), הפצה F- אקטין (אדום א .3, ב .3), ו ביטוי nestin (ירוק A.3, ב .3, ברים בקנה מידה = 20 מיקרומטר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54225/54225fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54225/54225fig2.jpg" /> איור 2. MPCs להתמיין MSCs Standard ו- הצג הנבטה אנגיוגנזה במבחנה. החלפת DMEM / PhABS עם RS זמינים מסחרית שנועדה בינוני להרחבת MSC מפעילה אינדוקציה mesengenic של MPCs. אחרי שבוע בתרבות כמה MPCs שיורית עדיין לגילוי (P1-MSCs) תוך מעבר נוסף במדיום MSC-RS מוביל אוכלוסייה של תאים MSC דמוי ומחוברות (P2-MSCs, ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר). P2-MSCs סופני להתמיין osteocytes או adipocytes תחת הגירוי הנכון, כפי שהיא מתגלה על ידי בתצהיר סידן (ירוק B) וצבירת אגל השומנים (אדום B, ברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר), בהתאמה. MPCs להראות הנבטה עקבית spheroids ב ג&#39;ל חלבון murine ECM (C) בשעה הבדל עם P2-MSCs (D, ברים בקנה מידה = 1.0 מ&quot;מ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54225/54225fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי וניתן לשחזור מאוד לבידוד תאי אב מזודרמליים (MPCs) ממח עצם אנושי (hBM). MPCs אופיינו בזרימה ציטומטרית וביטוי נסטין. הם הראו את היכולת להוליד תרביות תאים דמויות MSC הגדלות באופן אקספוננציאלי תוך שמירה על הפוטנציאל האנגיוגני שלהן.

תאי בידוד ובתאי Mesangiogenic (MPCs) מן האדם מח עצם

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאי אב מזנגיוגניים או MPC ממח העצם האנושי באמצעות תנאי תרבית סלקטיביים. אנו בוחנים הן את הפוטנציאל המזוגני והן את הפוטנציאל האנגיוגני שלהם. תאי אב מזנגיוגניים מזוהים באחוז נמוך בתרבית תאי מזנכימליים-סטרומליים שעברה אופטימיזציה ליישום קליני.כאשר FBS הוחלף בסרום אנושי. טכניקה זו היא ייחודית, שכן היא מאפשרת בידוד עקבי מאוד של מספר רב של NPCs שעברו alli-pol-ification המתאימים לצמיחת אנגיוגנזה וליצירת תרביתי MSC מסונכרנות. גילינו זאת כאשר, לאחר שלבי עיכול של תרביתי MCS בסרום talgrum, נותרו מעט תאים בצורת ביצה טיגון צמודים, אך הם התמיינו ל-MCs לאחר טיפול ב-FPS.כדי לבודד תאים חד-גרעיניים ממוח עצם אנושי (MNC), התחל בדילול של 5 עד 10 מיליליטר של מוח עצם טרי עד לנפח כולל של 50 מיליליטר באמצעות DPBS, וערבב את תמיסת התאים על ידי היפוך. לאחר מכן, חלק באופן שווה 25 מיליליטר של תאים לשתי מבחנות קוניות חדשות של 50 מיליליטר, והוסף 25 מיליליטר של DPBS טרי לכל מבחנה לצורך ערבוב שני על ידי היפוך. לאחר מכן, השאר את התאים בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לשברי העצם המינרליים ולשומן להיפרד מהתמיסה.לאחר 10 דקות, השתמשו בפיפט פסטור כדי להסיר בזהירות את השומן הצף וסננו את תרחיפי התאים דרך מסנני 70 מיקרון בנפרד, מבלי להפריע למשקעי שברי העצם המינרליים. כדי לבודד את שכבת ה-MNC, העבירו 20-25 מיליליטר של מחית העצם המדוללת מעל מדיום גרדיאנט צפיפות של 1.007 גרם למיליליטר בטמפרטורת החדר, בכל אחת משתי מבחנות של 50 מיליליטר, והפרידו את התאים באמצעות סרכזגה. לאחר מכן, השתמשו בפיפט פסטור סטרילי כדי לאסוף את טבעות התאים הלבנבנות מממשקי השכבות למבחנה חדשה של 50 מיליליטר.שטפו את התאים החד-גרעיים המבודדים במצע תרבית טרי במשך חמש דקות ב-400 ×g ובטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השביו את המשקע ב-5 עד 10 ml של מצע תרבית טרי. כדי לבודד את ה-MPC, שווו בקבוקי T75 הידרופוביים עם 15 ml של מצע תרבית טרי ב-37 °C וב-5% CO2.לאחר 30 דקות, זרעו בין 4 ל-6 כפול 10⁷ תאי מונונוקלארים ממח העצם אנושי לכל בקבוק עבור אינקובציה של 48 שעות. ביום השני, השליכו את המצע ואת התאים שאינם נצמדים מהבקבוקים והזינו את התאים ב-15 milliliters של מצע תרבית טרי. החזירו את התרביות לאינקובטור למשך שישה עד שמונה ימים.בסיום הדגירה, שטפו את התאים הדבקים ב-DMEM טרי. לאחר מכן, דגרו את התאים עם שני מיליליטר של תמיסת ניתוק פרוטאוז ללא רכיבי בעלי חיים למשך חמש עד 15 דקות ב-37 °C. כאשר התאים ניתקו מהקרקעית של הבקבוק, הוסיפו 10 מיליליטר של מצע גידול טרי כדי לעצור את התגובה ואספו את התאים באמצעות סרצ'יפוגציה, תוך השהיה מחדש של המשקע בשני עד אחד מיליליטר של מצע גידול טרי.לאחר ספירת ה-MPC, העבירו 2*10⁴ תאים לסמ"ק לבקבוקי תרבית T75 שעברו טיפול לתרביות רקמה, והדביקו את התאים למשך לילה ב-15 milliliters של מצע תרבית טרי באינקובטור לתרביות תאים. למחרת בבוקר, החליפו את מצע התרבית ב-200 micro liters לסמ"ק של מצע הרחבה לתאי MSC, וטרבבו את התאים למשך 7 עד 10 ימים נוספים. כאשר התרביות הגיעו למצב של confluence, בצעו תת-תרבית בריכוז של 3-5*10³ תאים לסמ"ק עד להגעה ל-confluence חדש במעבר שני (passage 2) של MSC, ולאחר מכן בצעו עיכול באמצעות פרוטאוז כדי לאסוף את התאים כפי שהודגם בעבר.זריעו 2×10⁴ תאים לסמ"ר בצלחות 6 בארות שעברו טיפול לתרבית רקמות ובתוסף מצע הרחבה טרי. לאחר גידול התרביות עד להגעה שוב למצב של התמגשות (confluence), סמנו שתי בארות כ"ללאה Differntiation" והחליפו את מצע ההרחבה. סמנו שתי בארות כ"אוסטאובלסטים" והחליפו את המצע ב-200 µL לסמ"ר של מצע אוסטאוגני סטנדרטי המיועד ספציפית להגברת הדיפרנציאציה של MSC.לאחר מכן, סמנו שתי בארות כאתרי אדיפוגנזה והחליפו את המצע ב-200 µL לסמ"ר של מצע אדיפוגני סטנדרטי המיועד ספציפית לגילוי בידול של MSC. החזירו את התאים לאינקובטור לתרבית תאים למשך שבועיים עד שלושה שבועות, עד להשלמת בידול התאים. לאחר מכן, המשיכו לזיהוי פלואורסצנטי של משקעי סידן חוץ-תאיים והצטברות טיפות ליפידים תוך-תאיות.כדי להפיק ספרואידים בתלת-ממד, זרע מספר רב של טיפות בנפח 20 µL של תרחיף MPC שבודד טרי על פני השטח הפנימיים של מכסה צלחת פטרי. לאחר שכל הטיפות הונחו, הנח בזהירות את המכסה על בסיס של צלחת פטרי המכילה DPBS כדי למנוע התאיידות של הטיפות התלויות, והכנס את הצלחת לאינקובטור לתרביות תאים למשך הלילה. למחרת בבוקר, הוסף מנות של 300 µL של חלבונים סטנדרטיים של מטריצה חוץ-תאית לכל באער של פלטת תרבית בעלת 24 באערים בטמפרטורה של 4 °C, והגב את חלבוני המטריצה בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות.הוסף 700 µL של מצע גידול לתאי אנדותל העשיר בגורם גדילה אנדותליאלי וסקולרי (vascular endothelial growth factor) סטנדרטי על גבי חלבוני ה-ECM שהג'יליפו. כאשר תאי ה-MPC יתקבצו לספרואידים תלת-ממדיים, הפוך בזהירות את מכסה פטרי הבקרי והשתמש בפיפט פסטור סטרילי כדי לאסוף בעדינות את הספרואידים. לבסוף, זרע את הספרואידים אל תוך בארות התרבית והחזר את הפלטה אל האינקובטור.מבחינה מורפולוגית, MPC מאופיינים בצורת "ביצת עין" מובחנת, עם אזור ליבה עבה המוקף להיקף דק ושטוח המציג פילופודיה (philipodia) רבים. לעיתים קרובות נצפית גם התארכות פולרית של גבול התא החיצוני. גידול של MPC במדיום הרחבה של MSC מוביל לדיפרנציאציה מהירה אך חלקית לתאים שטוחים בעלי הסתעפויות רבות שנמצאים בשלב פרוליפרציה, כאשר עדיין ניתן לזהות MPC שנותרו ללא דיפרנציאציה.לאחר מעבר נוסף, התרביות מניבות שכבה אחת של תאים דמויי MSC הגדלים באופן מעריכי. בתהליך זה, ה-MPC מארגנים מחדש את ה-F-Actin שלהם לסיבי מאמץ (stress fibers), בעוד שהביטוי של Nestin מוגבל למספר מצומצם של תאים נדירים. ציטומטריה של MPC שבודדו לאחרונה מראה כי למעל 95% מהתאים יש ביטוי של CD31 ו-CD45, אך הם חסרים את האנטיגנים CD90 ו-CD73 הקשורים לתאי מזנכימה.אנטיגנים אלו מבוטאים ברמה גבוהה רק לאחר התמיינות מלאה לתאי MSC. כדי לאשש את טבעם המזנכימלי, כאשר התאים מוזנים במדיום התמיינות למשך שבועיים לפחות, ניתן להביאם בקלות להתמיינות לתאי osteoblasts, כפי שמעידים משקעי הסידן, או ל-adipocytes, כפי שניתן לראות מצבירת טיפות ליפידים. פעולה זו מאשרת את טבעם של תרביות התאים שטרם עברו התמיינות כ-MSC.סיווג ה-MPC מאומת עוד יותר בבדיקת בקיעת אנגיוגנזה, שבה התאים מפגינים יכולת לפלוש לג'ל חלבון מטריצה חוץ-תאית של myrian מתוך ספרואידים תלת-ממדיים לאחר 24 שעות של גירוי באמצעות גורם גדילה אנדותליאלי וסקולרי. לאחר שבוע, התאים הפולשים נודדים למרחק רב עוד יותר, יכולת פלישה שהולכת לאיבוד ב-MSCs במעבר השני לאחר התמיינות מזנגנית. ברגע שהשיטה נשלטת, ניתן להקים תרביות MSC בתוך שעה אחת אם הדבר מבוצע כראוי, מה שמספק בין מיליון לשני מיליון MPCs בתוך פחות משבוע.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להעריך את הביצועים של מנות CR אנושיות לפני השימוש בהן בתרבית. נכון לרגע זה, פרוטוקול בידוד ה-MPC שלנו הוא היחיד להשגת תרבית MC כמעט טהורה ובעלת הדירות גבוהה ליישומים המשכיים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הטיפולים מבוססי התאים לבחון את האפשרות ליישום MPC ברגנרציה של רקמת שלד.

isolating-mesangiogenic-progenitor-cells-mpcs-from-human-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והרחבת הבאות של תאים סטרומה mesenchymal ותאי האנדותל המושבה להרכיב ללא שימוש בבעלי חיים בסרום ליצור זוגות עצמיים למטרות השתלה ניסיונית.

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

כלי דם בתוך אוכלוסיות אנושיות נמל שריר שלד כמה רבת שושלת המבשרת כי הם אידיאליים עבור יישומי משובי. שיטת בידוד זה מאפשרת טיהור בו זמני של שלוש אוכלוסיות תאי מבשר multipotent בהתאמה משלוש שכבות מבניות של כלי דם: תאי myogenic אנדותל מאינטימה, pericytes מתקשורת, ותאי adventitial מadventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

ברקמת לב אדם מטפחת אוכלוסיות תאי מבשר perivascular מולטיפוטנטיים שעשויה להיות מתאים התחדשות שריר לב. הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת בידוד סימולטני וטיהור שתי אוכלוסיות תאי סטרומה מולטיפוטנטיים קשורות כלי דם מקומיים, כלומר CD146 + CD34 - pericytes ו CD34 + CD146 - תאי adventitial, מן שריר הלב האנושי.

בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

Culturing תאי mesenchymal סטרומה אדם (hMSCs) עם סרום אוטולוגי, מפחית את הסיכונים של דחייה על ידי חומר xenogeneic והשפעות שליליות אחרות. זה גם מאפשר ההתאוששות של תת-קבוצה של אבות mesodermal, אשר יכול לספק hMSCs הטרי. Embedding hMSCs ב קריש הפיברין עצמי מאפשר טיפול קל והשתלת כירורגים יעילה.

תרבות משלוח Cell mesenchymal סטרומה ב עצמי תנאים: גישה חכמה עבור יישומים אורתופדיות

כאן אנו מציגים כיתה קליניים הרומן בידוד ותרבות שיטה כליות Perivascular סטרומה תאים (kPSCs) המבוסס על כל האיבר זלוף עם אנזימי עיכול והעשרה תא NG2. בשיטה זו, אפשרי לרכוש מספרי הטלפון הנייד מספיק לתרפיה תאית.

הרומן כיתה קלינית שיטת בידוד תאי סטרומה Perivascular כליה אנושית

המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד ובתאים אנדותל של דם טבורי. חלק מהיישומים כוללות שימוש תאים אלה כמו סמן לזיהוי חולים עם הסיכון למחלות לב, במחלות איסכמי, ובונה יצירת שסתום כלי הדם והלב רקמות מהונדסים.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד ולטפח מאתר תאי פיטום הצפק. אנו גם מתארים שני פרוטוקולים עבור שלהם אפיון פונקציונלי: הדמיה פלורסנט תאיים חינם Ca2 + ריכוז ואת וזמינותו degranulation בהתבסס על ערכי צבע מוחלטים כימות β-ההקסוזאמינידאז שוחרר.

בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם Ca2 +-הדמיה, מבחני Degranulation

אנו מציגים טכניקות עבור בידוד, culturing, אפיון, וההבחנה תאים האדם העיקרי שריר השריר (hMPCs) המתקבל רקמת שריר השלד ביופסיה.  hmpcs התקבל ומאופיין באמצעות שיטות אלה ניתן להשתמש לאחר מכן לכתובת מחקר שאלות הקשורות מיוגנזה האדם התחדשות השלד שריר.

בידוד, תרבות, אפיון, והבידול של תאים האדם שריר ביופסיה של השלד שרירי השגרה נוהל

שיטה זו מתארת את הטיהור על ידי ציטומטריית זרימה של MEP ו- MKP מעצמות הירך של העכברים, השוקה ועצמות האגן.

בידוד אבות מקרוציטים עכבר

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חסכונית לטיהור, הרחבה ואפיון תאי גזע מזנכימליים הומוגניים ביותר של מח עצם (BMSCs) מעכברים. גישה זו מאפשרת רכישה של כמויות גדולות של BMSCs עם פוטנציאל התפשטות והתמיינות גבוה, תמיכה במודלים של עכברים וקידום מחקר פרה-קליני.

טיהור, הרחבה ופנוטיפ מבוסס ציטומטריה של תאי גזע מזנכימליים במח עצם שמקורם בעכבר

למדו לבודד תאי מזנכימוגניים (MPCs) ממח עצם אנושי לחקר רפואה רגנרטיבית. שיטה זו מאפשרת בידוד עקבי של תאים עם פוטנציאל אנגיוגני ומיזוגני ליישומים קליניים.

תאי בידוד ובתאי Mesangiogenic (MPCs) מן האדם מח עצם

גלה סרטונים נוספים