תאי בידוד ובתאי Mesangiogenic (MPCs) מן האדם מח עצם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי אב מסנגיוגניים או MPC ממח העצם האנושי על ידי תנאי תרבית סלקטיביים. אנו בודקים הן את הפוטנציאל המזוגני והן את הפוטנציאל האנגיוגני שלהם. תאי אב מסנגוגניים מזוהים באחוזים נמוכים עם תרבית תאים mesen-ki-ma-stro-mo המותאמת ליישום קליני.

כאשר FBS יוחלף בסרום אנושי. טכניקה זו ייחודית, למעשה היא מאפשרת בידוד עקבי מאוד של מספר רב של NPCs בעלי אליפול המתאימים להנבטת אנגיוגנזה ודור של תרביות MSC מסונכרנות. גילינו זאת כאשר לאחר נסיעות בעיכול של תרביות MCS בסרום טלגרום, כמה תאים בצורת ביצה מטוגנת נשארים מחוברים אך מובחנים ל-MCs לאחר טיפול FPS.

כדי לבודד תאים חד-גרעיניים של מח עצם אנושי או MNC, התחל בדילול של חמישה עד 10 מיליליטר של מח עצם טרי עד לנפח כולל של 50 מיליליטר עם DPBS וערבב את תמיסת התא על ידי היפוך. לאחר מכן מחלקים באופן שווה 25 מיליליטר תאים לשני צינורות חרוטיים חדשים של 50 מיליליטר ומוסיפים 25 מיליליטר DPBS טריים לכל צינור לתערובת שנייה על ידי היפוך. לאחר מכן הניחו את התאים בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לשברי העצם המינרליים והשומן להיפרד מהתמיסה.

לאחר 10 דקות השתמש בפיפטה פסטור כדי להסיר בזהירות את השומן הצף ולסנן את מתלי התאים דרך מסננים בודדים של 70 מיקרון מבלי להפריע לכדורי שברי העצם המינרליים. כדי לבודד את שכבת ה-MNC 20-25 מיליליטר של מח העצם המדולל על גבי טמפרטורת החדר 1.007 גרם למדיום שיפוע צפיפות מיליליטר בכל אחד משני צינורות של 50 מיליליטר ולהפריד את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן השתמש בפיפטה סטרילית כדי לאגד את טבעות התאים הלבנבנות בפנים הנכנסות בשפופרת חדשה של 50 מיליליטר.

שוטפים את התאים החד-גרעיניים המבודדים במדיום תרבית טרי למשך חמש דקות בטמפרטורה של 400 פעמים G וטמפרטורת החדר. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה בחמישה עד 10 מיליליטר של מדיום תרבית טרי. כדי לבודד את ה- MPC יש לאזן צלוחיות T75 הידרופוביות עם 15 מיליליטר של מדיום תרבית טרי ב -37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני.

לאחר 30 דקות זרע ארבע עד שש פעמים 10 עד שבעה תאים חד-גרעיניים של מח עצם אנושי לכל בקבוק למשך 48 שעות דגירה. ביום השני יש להשליך את התאים המדיום והלא דבקים מהצלוחיות ולהאכיל את התאים ב -15 מיליליטר של מדיום תרבית טרי. החזירו את התרבויות לחממה למשך שישה עד שמונה ימים.

בתום הדגירה יש לשטוף את התאים הדבקים ב-DMEM טרי. לאחר מכן דגרו על התאים עם שני מיליליטר של תמיסת ניתוק פרוטאות ללא בעלי חיים למשך חמש עד 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים התרוממו מתחתית הבקבוק, הוסיפו 10 מיליליטר של מדיום תרבית טרי כדי לעצור את התגובה ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, תוך השעיה מחדש של הגלולה במיליליטר אחד עד שניים של מדיום תרבית טרי.

לאחר ספירת צלחת ה-MPC פעמיים כפול 10 עד ארבעה לסנטימטר רבוע של התאים לתרבית רקמה, טופלו בצלוחיות תרבית T75 והדביקו את התאים למשך הלילה ב-15 מיליליטר של מדיום תרבית טרי בחממת תרבית התאים. למחרת בבוקר החליפו את המדיום המתורבת ב-200 מיקרו ליטר לסנטימטר רבוע של תא misancolmulstromul או מדיום הרחבה MSC ותרבו את התאים למשך שבעה עד 10 ימים נוספים. כאשר התרביות הגיעו לתת-תרבית מפגש בשלוש עד חמש כפול עשר לשלושה תאים לסנטימטר רבוע עד שהגיעו למפגש חדש של מעבר שתיים ב-MSC, בצע עיכול פרוטאות כדי לאסוף את התאים כפי שהודגם קודם לכן.

צלחת פעמיים כפול עשרה עד רביעי תאים לסנטימטר רבוע בתרבית רקמה שטופלה בשש צלחות באר ומדיום התפשטות טרי. לאחר גידול התרביות למפגש שוב, סמן שתי בארות כללא בידול ורענן את אמצעי ההתפשטות. סמן שתי בארות כפיצוצי אוסטאו, והחלף את המדיום ב-200 מיקרו ליטר לסנטימטר רבוע של מדיום אוסטאוגני סטנדרטי שתוכנן במיוחד עבור בידול MSC.

לאחר מכן סמן שתי בארות כאתרי adipo והחלף את המדיום ב-200 מיקרו ליטר לסנטימטר רבוע של מדיום adipogenic סטנדרטי שתוכנן במיוחד עבור בידול MSC. החזירו את התאים לאינקובטור תרבית התאים למשך שבועיים-שלושה עד שהתאים התמיינו. לאחר מכן המשך לזיהוי פלואורסצנטי של מרבצי סידן תאיים נוספים והצטברות טיפות שומנים תאיות מבוא לתאים.

כדי לייצר ספרואידים תלת מימדיים, זרעו מספר רב של 20 טיפות מיקרו ליטר של תרחיף MPC מבודד טרי על המשטח הפנימי של מכסה צלחת פטרי. לאחר שכל הטיפות הונחו בזהירות, הניחו את המכסה על בסיס צלחת פטרי המכיל DPBS כדי למנוע אידוי טיפות תלויות והניחו את הצלחת בחממת תרבית התאים למשך הלילה. למחרת בבוקר הוסיפו 300 מיקרו ליטר של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים סטנדרטיים לכל באר של צלחת תרבית באר של ארבע מעלות צלזיוס 24 וג'ל את חלבוני המטריצה ב-37 מעלות צלזיוס שלהם למשך 30 דקות.

הוסף 700 מיקרו ליטר של מדיום גידול תאי אנדותל אנדותליאלי סטנדרטי של כלי דם על גבי חלבוני ה-ECM הג'ל. כאשר ה-MPC הצטבר לספרואידים תלת מימדיים, הפוך בזהירות את מכסה צלחת הפטרי והשתמש בפיפטה פסטר סטרילית כדי לקצור בעדינות את הספרואידים. לבסוף זרעו את הכדורים לבארות התרבות והחזירו את הצלחת לחממה.

מבחינה מורפילוגית MPC מאופיינים בצורת הביצה המטוגנת הייחודית שלהם עם אזור ליבה עבה המוקף בפריפריה דקה ושטוחה המציגה פיליפודיות רבות. לעתים קרובות נצפית גם התארכות קוטבית של גבול התא החיצוני. תרבית MPC במדיום הרחבת MSC מביאה להתמיינות מהירה אך חלקית לתאים שטוחים ורב-מסועפים מתרבים עם שאריות MPC לא ממויינות שעדיין ניתנות לזיהוי.

לאחר מעבר נוסף, תרביות מביאות לשכבה חד-פעמית של תאים דמויי MSC הגדלים באופן אקספוננציאלי. בתהליך ה-MPC מארגן מחדש את ה-F-Actin שלהם לסיבי עקה בעוד ביטוי נסטין מוגבל לכמה תאים נדירים. זרימה של MPC מבודד טרי מראה למעלה מ-95% מהתאים המבטאים CD31 ו-CD45 אך חסרים אנטיגנים הקשורים ל-mis-en-com-al CD90 ו-CD 73.

האנטיגנים האחרונים הללו באים לידי ביטוי רק לאחר התמיינות מלאה ל-MSC. אישור טבעם השגוי כאשר הם מוזנים במדיום מבדיל במשך שבועיים לפחות, תאים אלה יכולים בקלות להיות מושרים לתוך אוסטאו, בלסטים, כפי שמצוין על ידי מרבצי הסידן שלהם או אדיפוסיט, כפי שניתן לראות על ידי הצטברות טיפות השומנים. אישור אופי ה-MSC של תרביות התאים המובחנות מראש.

הקלדת MPC מאושרת עוד יותר בבדיקת בראשית אנגיו נביטה כאשר התאים מציגים יכולת לפלוש לג'ל חלבון מטריקס אקסטרה תאי מכדורים תלת מימדיים לאחר 24 שעות של גירוי גורם גדילה אנדותל כלי דם. לאחר שבוע אחד, התאים הפולשים נודדים למרחק גדול עוד יותר, יכולת פלישה שאובדת במעבר השני של MSCs לאחר ההתמיינות המזנגנית. לאחר השליטה, ניתן לבסס את תרביות ה-MSC תוך שעה אחת אם מטפלים בכך כראוי, ומספקים בין מיליון או שניים ל-MPC פחות משבוע.

כאשר מנסים הליך זה, חשוב להעריך את הביצועים של אצוות CR אנושיות לפני שהם משתמשים בהן בתרבית. כרגע פרוטוקול בידוד ה-MPC שלנו הוא היחיד להשגת תרבית MC כמעט טהורה הניתנת לשחזור גבוה ליישום נוסף במורד הזרם. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הטיפולים מבוססי התאים לבחון את האפשרות ליישם MPC בהתחדשות רקמות השלד.