טכניקות האבולוציה של שמרי פנטוז-תוסס יציבים לשם bioconversion של lignocellulose כדי אתנול

המטרה הכוללת של הליך אבולוציה אדפטיבי זה היא להפיק זנים חזקים של שמרים מקומיים המוסיסים קסילוז scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 שיכולים לתסוס במהירות רבה יותר את סוכרי הקסוז והפנטוז בהידרוליזטים לא מחומצנים לאתנול הניתן לשחזור כלכלי. שיטה זו מניעה את הליגנוצלולוז לתעשיית האתנול קדימה על ידי מתן מפת דרכים לזנים עם שינויים מורכבים, המאפשרת תסיסה של סוכרים בהידרוליזטים המכילים מעכבים מיקרוביאליים. כאן, היתרון העיקרי של אבולוציה ממוקדת הוא שזנים חזקים מעוצבים משמרים מקומיים המסוגלים לתסוס קסילוז, מה שמבטל את הצורך להנדס זני סכרומיצס תעשייתיים.

הבנו שסביר להניח שזן שמרים בודד לא יהיה חזק בסוגים שונים של הידרוליזטים, כגון עשב תירס שטופל מראש ב-AFEX או עשב מתג שטופל מראש בחומצה מדוללת. היכולת של scheffersomyces stipitis לעבור מחזור רבייה מיני מועילה לניצול נוסף בעבודה הנוכחית מכיוון שניתן לשלב את הזנים השונים שפותחו לזן יחיד וחזק יותר באמצעות הזדווגות של זנים בעלי תכונות שונות אלה. מי שידגים את ההליך יהיו המחברות השותפות סטפני תומסון ומורין שי-אנדרש, שהן טכנאות מדעי הביולוגיה במעבדה שלי.

לפני תחילת הליך העשרה זה, הכינו תרבית מוקדמת של זן NRRL Y-7124 בבקבוק של 125 מיליליטר וסדרת דילול של האנזים התרחבות סיבי אמוניה סכרית שטופלה מראש בהידרוליזט תירס, או AFEX CSH. השתמש בפיפטה חוזרת כדי למלא מיקרופלטה של 96 בארות עם 15 מיקרוליטר לבאר, ושמונה בארות לכל דילול הידרוליזט. יש לחסן בכמה מיקרוליטרים של תרבית מוקדמת לבאר כדי לאפשר ספיגה ראשונית של 620 ננומטר, או A620 של יותר או שווה ל-0.1.

הניחו את המיקרופלייט בקופסת פלסטיק עם מגבת נייר רטובה ללחות ודגרו באופן סטטי למשך 24 עד 28 שעות בחום של 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש בספקטרופוטומטר קריאת מיקרו-צלחת כדי לזהות את התרביות שגדלו פיזית ל-A620 גדול מ-1.0 בדילול ההידרוליזט המרוכז ביותר. אסוף את הבארות שזוהו בצינור מיקרופוגה, והחלק לצלחת מילוי.

העבירו 1 עד 5 מיקרוליטר מצלחת המילוי לכל באר בסדרת דילול הידרוליזט חדשה כדי להשיג A620 ראשוני של גדול או שווה ל-0.1 ולדגור את הצלחת כמו קודם. עקוב אחר צמיחת התרביות במיקרופלייט באמצעות ספקטרופוטומטר קריאת מיקרופלייט. הכינו מלאי גליצרול של תרבויות הסתגלות באופן קבוע.

אגדו ארבע בארות בריכוז ההידרוליזט הגדול ביותר שנמצא בקריופיל, וערבבו אחת לאחת עם 20% גליצרול סטרילי. הקפיאו תאים במינוס 80 מעלות צלזיוס. חזור על הליך העשרה זה עד שהגידול ב-12% גלוקן AFEX CSH נראה באופן עקבי לאחר 24 שעות.

כדי להתחיל בהליך זה, פס מלאי גליצרול נבחר של תרביות הסתגלות לשמרים, מאלט, פפטון, דקסטרוז, או YM אגר. לאחר מכן, לאחר הצמיחה, השתמש בפסים כדי לחסן 50 מיקרוליטר של 3% או 6% גלוקן AFEX CSH בכל אחת משלוש בארות מיקרופלייט. דגרו על המיקרופלייט למשך 24 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.

בריכה משכפלת בארות מיושבות בחוזק ההידרוליזט הגבוה ביותר עם צמיחה חזקה. וצלחת דילול ל-YM או 6% גלוקן AFEX CSH אגר. דגרו את הצלחות באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות.

בחרו חמש מושבות בודדות מצלחת הדילול הגבוהה ביותר המציגות צמיחה להקפאה כתרביות מלאי גליצרול. פס כל מושבה לצלחת YM ודגירה למשך 24 שעות. בעזרת לולאה סטרילית, העבירו פס מפותח של תאים לנפח קטן של 10% גליצרול מעורבב כדי להשהות את התאים ולהפיץ לשניים עד שלושה קריופילים להקפאה במינוס 80 מעלות צלזיוס.

כדי לבדוק מבודדים בתרביות אצווה פשוטות של 6% גלוקן AFEX CSH, העבירו תאים מצלחות של 48 שעות מפוספסות ממלאי גליצרול למאגר אשלגן פוספט pH 7 להכנת תרחיפי תאים. לאחר מדידת הצפיפות האופטית של כל מתלה תאים, כוונן את עוצמת הקול עם מאגר נוסף כדי להגיע ל-A620 של עשרה. השתמש במיקרוליטר אחד מכל תרחיף כדי לחסן כל אחת מארבע בארות של 50 מיקרוליטר של הידרוליזט גלוקן 3% ל-A620 ראשוני של 0.2.

דגרו את המיקרופלטה למשך 24 שעות. לאחר מכן, העבירו שתי בארות מיקרו-פלטות של 24 שעות כדי לחסן תרביות מוקדמות של 25 מיליליטר של 6% גלוקן AFEX CSH ב-pH 5. סוגרים את הצלוחיות עם סגירות ספוג סיליקון ודוגרים למשך 24 שעות בחום של 25 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד.

השתמש בתרביות קדם-תרביות AFEX CSH של 6% גלוקן כדי לחסן תרביות גידול דומות של 25 מיליליטר בשכפול ל-A620 ראשוני של 0.1. דגרו על תרביות הגידול למשך 24 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד. כדי לבדוק מחסור דיאוקסי של מבודדים בתרביות אצווה של מדיום מוגדר אופטימלי, או ODM, עם סוכרים מעורבים, יש לחסן תרביות מוקדמות של 75 מיליליטר ODM עם 150 גרם לליטר קסילוז בצלוחיות של 125 מיליליטר עם סגירת ספוג סיליקון.

דגירה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד. השתמש בתרבויות המוקדמות כדי לחסן ל-A620 של 0.1 תרביות בדיקה כפולות דומות של 75 מיליליטר עם ODM המכיל 75 גרם לליטר גלוקוז ו-75 גרם לליטר קסילוז ב-pH 6.5. צלוחיות טלטול ב-25 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד.

24 שעות לפני חיסון תרבית רציפה, הכינו תרבית מוקדמת של מושבה סובלנית מייצגת AFEX CSH ב-ODM נטול אתנול בבקבוק של 125 מיליליטר. השתמש בחמישה עד 10 מיליליטר של תרבית מבודדת סובלנית AFEX CSH כדי לחסן 100 מיליליטר ODM בבקבוק ספינר של 100 מיליליטר כדי לקבל A620 ראשוני של 0.5. שמור על נפח החזקת התרבות על 25 מעלות צלזיוס.

מערבבים אותו ב-200 סל"ד ומציידים אותו באלקטרודת pH הניתנת לעיקור, בקר pH ואמבט מים במחזור מבוקר טמפרטורה. בתחילה, מכיוון שצמיחת התאים תהיה איטית עקב החשיפה לאתנול, הגדר משאבה המופעלת על ידי pH כך שכאשר תסיסת התרבית מורידה את ה-pH ל-5.4, המשאבה תזין pH 6.3 ODM עם 100 גרם לליטר קסילוז ו-50 גרם לליטר אתנול כדי לעצור ירידות נוספות של ה-pH. שמור על הנפח על 100 מיליליטר בעזרת משאבת קולחין המרפרפת ברציפות על משטח התרבות.

מדוד את נפח השפכים שנאסף ושאב דגימות מתרביות רציפות כל 48 עד 72 שעות לניתוח ריכוז תאים, תוצרים ומצעים ברי קיימא כמתואר בכתב היד. שמור את מלאי הגליצרול באופן קבוע על ידי בידוד מושבות מצלחות כדאיות של דילול דגימות חוצץ היוצרות 30 עד 100 מושבות, המייצגות את המושבות החזקות הנפוצות ביותר באותה תקופה בהעשרה. הציפו את הצלחות בחמישה מיליליטר של 10% גליצרול כדי לאפשר הכנת קריוקבצים כפולים.

אם תרביות יכולות לגדול בהתמדה בקצב ספציפי של יותר מ-0.01 לשעה על קסילוז בנוכחות יותר מ-25 גרם לליטר אתנול, התחל את הזנת התרבית הרציפה בקצב דילול נמוך של כ-0.01 לשעה לנפח ההחזקה של 100 מיליליטר. עם הזמן, העלו את האתנול במזון לכיוון 50 גרם לליטר. הקרנה אולטרה סגולה של חיסון להפעלה מחדש של תרביות רציפות היא אפשרות להאיץ את קצב המוטציות.

ללכוד אוכלוסיות מתקדמות במאגרי גליצרול. לפני בידוד מושבות תאים בודדים, אוכלוסיות מלאי גליצרול עם תסיסה משופרת של קסילוז בנוכחות אתנול, מזוהות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש באוכלוסיות המעולות הללו כדי לפספס צלחות.

הלוחות המפוספסים משמשים להכנת מתלי תאים חוצצים צפופים של A620 השווים לחמישה. לאחר מכן משתמשים בתרחיפי תאים לחיסון תרביות מוקדמות ב-96 צלחות באר עמוקות. דגירה במשך 48 שעות ב-25 מעלות צלזיוס, 400 סל"ד ומסלול אינץ' אחד.

לאחר מכן, העשר מושבות סובלניות על ידי שימוש בכל תרבית קדם-תרבית כדי לחסן 16 תרביות שכפול של מיליליטר אחד ל-A620 ראשוני של 0.5 במשקאות חריפים הידרוליזטים שטופלו מראש בחומצה, מעורבבים אחד לאחד עם ODM בתוספת 50 גרם לליטר קסילוז, ומספיק אתנול כדי לספק אתגר של 20, 30 או 40 גרם לליטר אתנול. דגירה במשך 48 שעות ב-25 מעלות צלזיוס, 400 סל"ד ומסלול אינץ' אחד. עבור כל מלאי גליצרול שונה, קצרו את בארות התרבות עם ריכוז האתנול הגבוה ביותר המאפשר צמיחה ושימוש בקסילוז.

יש להרחיב כל קו תאים לאגר YM כדי לקבל מושבות בודדות נפוצות לשימור בגליצרול. בחר 10 מושבות לכל קו תאים ופס כל אחת לצלחת אגר YM להכנת מלאי גליצרול. לאחר התאמה ל-AFEX CSH, השוואה של ביצועי התסיסה ב-ODM בין זן האב לאוכלוסיות המותאמות מגלה כי האוכלוסיות המותאמות משתמשות בקסילוז בצורה יעילה יותר כדי לייצר אתנול מהר יותר ובכמויות גבוהות יותר.

מושבה עמידה להידרוליזה פותחה עוד יותר לשיפור הסבילות לאתנול על ידי בחירת תרבית מתמשכת על ODM המכיל קסילוז ורמות גבוהות של אתנול. כל האוכלוסיות המותאמות עלו על ההורה ביכולת לגרום למטבוליזם של קסילוז בנוכחות 40 גרם לליטר אתנול. גרפים אלה מסכמים את הביצועים של מבודדים עמידים מעולים שהוערכו במונחים של שיעורי ספיגת קסילוז ותפוקת אתנול ביחס לזן האב עבור כל פורמולה של PSGHL.

הזנים הטובים ביותר שנבחרו מהמסך הראשי על PSGHL עשיר בקסילוז נבדקו לאחר מכן על שלושה הידרוליזטים שלמים ומדד הביצועים היחסי, או RPI, חושב עבור התסיסה של כל מבודד בתוך כל הידרוליזט. לאחר מכן, חושבו מדדי הביצועים הכוללים המשולבים עבור כל מבודד. לחמישה מבודדים, שלושה, 14, 27, 28 ו-33, היו RPI כולל מעל 60, מה שדירג אותם כחזקים ביותר לכל הווריאציות של הידרוליזט ותנאי תזונה ביחד.

לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם לדעת כיצד לאתגר שמרים מותססים קסילוז כמו scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 בתהליך אבולוציה ממוקד, להעשיר, לבודד ולהעריך נגזרות חזקות יותר המתסיסות בצורה יעילה יותר סוכרים מעורבים בהידרוליזטים לא מחומצנים. לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו בהשקעת זמן יומית ממוצעת של כשעה ביום. ניתן לתעד שינויים משמעותיים בתהליך האבולוציה תוך ארבעה חודשים בלבד.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להציל אוכלוסיות מתקדמות באופן קבוע על ידי הכנת מלאי הגליצרול להקפאה במינוס 80 מעלות צלזיוס. זה מאפשר התאוששות אוכלוסייה, הערכה תקופתית, בידוד או התנעה מחדש של תהליך האבולוציה. כדי לנהל מוטציות שונות, זכור לסנן באופן קבוע את השמרים בתנאים ספציפיים לתהליך עבור מערך פנוטיפים.

חישוב מדדי ביצועים יחסיים חסרי מימד כוללים, או RPIs, המבוססים על פרמטרים קינטיים, מאפשר להעריך את דירוג הזן והחוסן לשינויים בתנאי תסיסה כמו סוג הידרוליזט ותוספי חומרים מזינים. שמרים מעולים הנובעים מכל שלב בתהליך האבולוציה הם מועמדים לריצוף גנומי כך שאופי השיפורים כגון סבילות למעכבים יופחת וניתן יהיה להבין פיגור דיוקסי ולהשתמש בו לתכנון זנים ביו-קטליטיים מהדור הבא.