Name: ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: חקור את ההשפעות המגנות של מלטונין בתאי טרופובלסט אנושיים תחת תנאי היפוקסיה וריאוקסיגנציה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד על מנגנוני הגנה מפני מתח חמצוני בפלצנטה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נתמך על ידי מענקים ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) (מס' 262011-2009) למענק CV ו-March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research (#12-FY12-179) ל-CV ו-JTS; על ידי מלגות ל-LSF מ-Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) ו-Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, ל-HC מ-Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, ל-AAHT מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) ו-FRQ-Santé, ול-JBP מ-NSERC; על ידי מלגה ל-EMAS מה-Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) ו-Program de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.

למחברים אין מה לחשוף.

ביונקים, התפתחות עוברת תלויה ישירות על תפקוד השליה נאות. מקורותיה ההתפתחותי של הפרעות בריאות מבוססים על ההשערה כי הגורם למחלות לידי ביטוי בשלב מאוחר יותר בחיים יכול להיות נעוצה בהתפתחות מוקדמת וכי השליה יש תפקיד מכניסטית בתכנות עוברי 30-32. השליה היא מתווך המפתח של גדילת עובר ופיתוח: זה מסדיר העברת מזין, מגן מפני חשיפות מזיקות, ויש לו פונקציות האנדוקרינית גדולות. הפיתוח על ידי Kliman et al. של טכניקה לשחזור לבודד cytotrophoblasts העיקרי הקיימא הוא ציון דרך בחקר...

במהלך הריון אדם, תאי cytotrophoblast השליה, אשר הם תאי גזע mononucleated, להתרבות במהירות להתמיין לתאי cytotrophoblast או villous או extravillous. cytotrophoblasts Extravillous לפלוש לשפץ העורקים ספירלה של דופן הרחם. Cytotrophoblasts Villous, מצד שני, ממשיכים להתרבות, להבדיל הפתיל כדי ליצור syncytiotrophoblast multinucleated (להלן syncytium) 1. התחזוקה של הומאוסטזיס trophoblast villous חיונית לרווחתה עוברית הריון בריא. למעשה, trophoblasts villous לאפשר חילופי האם והעובר של חמצן וחומרים מזינים, וכן ליצירת הורמונים חיוניים עבור ההריון. יתר על כן, syncytiotrophoblast הוא תא מהסוג רק במגע ישיר עם מחזור הדם האימהי ומספק מחסום פיזי אימונולוגיים חיוני. לכן, syncytiotrophoblast חייב לעבור אפופטוזיס והחלפת לתחזוקה ההומיאוסטטית וכדי AVOid השליה פתולוגיות 2-5. הטכניקה פותחה על ידי Kliman et al. 6 בשנת 1986 לבודד cytotrophoblasts villous ראשית ממנהל שליות אדם גרמה מהפכה במחקר שליה בכך שהוא מאפשר בחקר המנגנונים המולקולריים המעורבים בידול trophoblast villous. טכניקה קלסית זו, המבוססת על digestions האנזימטית רציף עם טריפסין ו DNase, ואחריו בידוד במדיה צנטריפוגה הצפיפות (חלקיקי סיליקה colloidal מצופים ידי polyvinylpyrrolidone, או Percoll) מוכר כיום את תקן הזהב עבור לבודד תאי cytotrophoblast villous. הטכניקה יכולה להיות מותאמת על ידי מגנטי immunopurification, הליך שמפריד cytotrophoblasts villous מתאי הלא trophoblastic מבוססים על ביטוי ההפרש של אנטיגנים ספציפיים על פני השטח של תאים אלה. בחרנו ABC אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA-ABC) בשל העדר הביטוי שלה על membran תא trophoblasticדואר 7,8. השליה היא איבר שעובר וריאציות דרמטיות ברמות החמצן במהלך הריון. בטרימסטר הראשון, יחס החמצון הוא פיסיולוגי נמוך מאוד (2% O 2) אך עליות לרמות קלות של חמצון (8% O 2) בטרימסטר השני ושלישי. Tuuli et al. 9 תיאר כי רבייה במבחנה של הסביבה trophoblast בתוך villi השליה היא אתגר לשינויים ברמות חמצון עשוי אפילו להוביל לשינויים phenotypical. זהו, אם כן, הציע לאמץ חמצן 8% כפי normoxia לחקות את המתח חמצן נמצא villi השליה במהלך השליש השלישי של ההריון 8,9. חן et al. 10 בהרחבה למדו מספר משתנים הקשורים במתח חמצן תרבית תאי trophoblast והדגימו את החשיבות של קביעת רמות חמצן בסביבת pericellular. רמות חמצן villi נוטות להגדילבשל vasculogenesis. זרימת הדם בעליות villi שלית זמן ורמת החמצן (זן חמצן תגובתי בשפע) היא איתות חשובה שולט vasculogenesis 11,12. בשנת סיבוכי הריון, חוסר vasculogenesis מייצר היפוקסיה, ויותר מכך, וריאציות לסירוגין של חמצון (שנקרא היפוקסיה / reoxygenation). תנאים אלה להוביל לעלייה חריגה סטרס חמצוני, אשר פוגעת השליה 13,14 הכדאיות עוברית. השינויים שתאים trophoblast לעבור in vivo במהלך אירועי היפוקסיה / reoxygenation ניתן חיקה במבחנה כדלקמן: cytotrophoblasts villous נשמרים בתנאי normoxic (8% O 2) עד שהם להתמיין syncytiotrophoblast. לאחר מכן הם חשופים לתנאי חוסר חמצן (0.5% O 2) עבור 4 שעות, ואחריו hr 18 נוסף של normoxia (reoxygenation). באמצעות גישה זו היפוקסיה / reoxygenation, trophoblasts לשעברhibit deregulated מצב חיזור רמות גבוהות של אפופטוזיס המהותי 8, כמו נצפה סיבוכי הריון מסוימים. לפיכך, מדובר שימושי במודל חוץ גופית על מנת להעריך גישות למנוע ולרפא אותן חדשה למאבק סיבוכי הריון הקשורות השליה היפוקסיה / reoxygenation. תאי שליה לייצר מלטונין, אשר יש פונקציות חשובות, כגון היכולת לייתר סטרס חמצוני ופגיעה בתפקוד השליה 15. כאן, אנו מציגים מודלי הגישה ותא הניסוי נעשו שימוש כדי להמחיש את ההשפעות המגנות של מלטונין בתאי trophoblast שליה ברמה המולקולרית, תאית ופונקציונלית 8.

<table><tbody><tr><td>מספריים מעוקלים של מצנבאום</td><td>שנדון</td><td>9212</td><td>ציוד כירורגי (בידוד תאים) (2 יחידות)</td></tr><tr><td>מלקחיים ספלינטר פיין 41/2</td><td>בפישרברנד</td><td>13-812-42</td><td>ציוד כירורגי (בידוד תאים) (2 יחידות)</td></tr><tr><td>מספריים 4.5 Str Dissection</td><td>Fisherbrand</td><td>08-940</td><td>ציוד כירורגי (בידוד תאים) (2 יחידות)</td></tr><tr><td>ספוג גזה 10 ס"מ x 10 ס"מ</td><td>בריאות</td> <td>קרדינלית</td><td></td>361020733</tr><tr><td>תבנית אפייה מזכוכית מלבנית</td><td>פיירקס</td><td>1105397</td><td>כלי זכוכית (2.8 ליטר)</td></tr><tr><td>משפך Buchner</td><td>Coorstek Inc</td><td>10-356E</td><td>כלי זכוכית (קוטר 114 מ"מ)</td></tr><tr><td>צפה בזכוכית&nbsp;</td><td>pyrex</td><td>9985100EMD</td><td>כלי זכוכית</td></tr><tr><td>תמיסת פורמלין, מאגר ניטרלי, 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>תמיסת קיבוע רקמות היסטולוגיות</td></tr><tr><td>צלוחיות טריפסיניזציה</td><td>כלי זכוכית Wheaton</td><td>355395</td><td>(יחידה אחת)</td></tr><tr><td>צינורות תרבות חד פעמיים</td><td>Kimble</td><td>73750-13100</td><td>כלי זכוכית</td></tr><tr><td>בורוסיליקט פסטר פיפט (22.8 ס"מ)</td><td>פישרברנד</td><td>K63B1367820C</td><td>כלי זכוכית</td></tr><tr><td>250 מ"ל כוסות זכוכית</td><td>פישרברנד</td><td>KFS14005250</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי מדיה מזכוכית עם פקק</td><td>פישרברנד</td><td>KFS14395250</td><td>כלי זכוכית (8 יחידות)</td></tr><tr><td>50 מ"ל שפופרת קורקס&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>8422-A</td> <td>(יחידה אחת)</td></tr> <tr><td>15 מ"ל צינור צנטריפוגה פוליסטירן</td><td>קורנינג</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה פוליסטירן</td><td></td><td>430829</td><td></td></tr><tr>10 מ"ל <td>מסננת</td> תאים <td>11415038</td><td></td><td>פיפט סרולוגית</td></tr><tr><td>100 &mu; m ניילון</td><td>קורנינג</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>תוחם סופג</td><td>Scienceware</td><td>1199918</td><td></td></tr><tr><td>500&nbsp; בקבוקי מ"ל מסנן עליון</td><td>נקבוביות</td><td></td><td>: 0.22&nbsp; ומיקרו; m / בינוני והכנה HBSS</td></tr><tr><td>2 מ"ל בקבוקונים קריוגניים</td><td>קורנינג</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>מיכל הקפאה, Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>Pharmacia Fine Chemicals</td><td>P3 דגם</td><td></td></tr><tr><td>רועד אמבט מים</td><td>פישר</td><td>דגם 127</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום</td><td>ABM</td><td>4EKFS6CX-4</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישרברנד</td><td>EC231-598-3</td><td>תמיסת מלח 0.9%</td></tr> <tr><td>האנק' s תמיסת מלח חוצצת (Hbss)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td>כמות: 9.25 (בקבוקון אחד) עבור 1 ליטר של תמיסת עיכול</td></tr><tr><td>Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes)</td><td><a name="RANGE! B29 ">Life Technologies</a></td><td>15630-080</td><td>25 מ"ל (1 מ ') עבור 1 ליטר תמיסת עיכול</td></tr><tr><td>טריפסין סוג I</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8003</td><td>9,888 U</td></tr><tr><td>דאוקסיריבונוקלאז סוג IV</td><td>רוש</td><td>10-104-159-001</td><td>402,000 U</td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C4901</td><td>100 מ"מ</td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט</td><td>בייקר</td><td>2500-01</td><td>800 מ"מ</td></tr><tr><td>דולבקו s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem)</td> <td>Life Technologies</td><td>10564-045</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין סולפט</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>קורנינג</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td>שיפוע צנטריפוגה צנטריפוגה. נפח: 36 מ"ל</td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>אקרוס</td><td>42383-0010</td><td>50 מ"ל</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>472301</td><td></td></tr><tr><td>מפריד מגנטי אוטומטי&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>דגם 003</td><td></td></tr><tr><td>Automacs&nbsp; טורים&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Automacs מריצים Buffer&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 פתרון שטיפת Automacs&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx שיבוט מטוהר אנטי אנושי ABC W6/32</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-9983-82</td><td>נוגדן נגד עכבר</td></tr><tr><td>אנטי עכבר Igg מיקרו-חרוזים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130048401</td><td></td></tr><tr><td>צלחת באר מרובה -&nbsp; 6 באר עם מכסה</td><td>קורנינג</td><td>3335</td><td>משטח קשירת תאים</td></tr><tr><td>צלחת באר מרובה -&nbsp; 24 באר עם מכסה</td><td>קורנינג</td><td>3337</td><td>משטח קשירת תאים</td></tr><tr><td>צלחת באר מרובה -&nbsp; 96 באר עם מכסה</td><td>קורנינג</td><td>3300</td><td>תא קשירת תא</td></tr><tr><td>תא חממה מודולרית&nbsp;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td>סט של שניים נחוץ ליצירת נורמוקסיה ותנאי היפוקסיה/חמצון מחדש בו זמנית</td></tr><tr><td>מד זרימה יחיד</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>SFM3001</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"מ מסנן בשורה</td><td>Whatman</td><td>6721-5010</td><td>PTFE, נקבוביות: 1.0 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>ווסת גז</td><td>Pro Star</td><td>PRS301233</td><td>סט של שניים נחוץ ליצירת נורמוקסיה ותנאי היפוקסיה/חמצון מחדש</td></tr><tr><td>צינור גז Class Vi Clear 5/16&nbsp;</td><td>Parker</td><td>100-05070102</td><td>3 חלקים עם ~ 0.5 מ'</td></tr><tr><td>17 מ"מ צינור גז מתכוונן מהדק</td><td>עניבות</td><td>THCSS-16</td><td></td></tr><tr><td>צילינדר גז נורמוקסיה&nbsp;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>גודל K (3rd הרכב הטרימסטר: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2)</td></tr><tr><td>Normoxia Gas Cylinder&nbsp;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>גודל K (3rd הרכב הטרימסטר: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2)</td></tr><tr><td>מיקרואלקטרודה חמצן Mi-730</td><td>מיקרואלקטרודות INC</td><td>84477</td><td></td></tr><tr><td>מתאם חמצן</td><td>מיקרואלקטרודות INC</td><td>3572</td><td></td></tr><tr><td>מגיב זיהוי ROS: ס"מ-H2DCFDA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C-400</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-hCG ערכת ELISA&nbsp;</td><td>DRG אינטרנטינל</td><td>EIA-4115</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן מטוהר אנטי-וימנטין</td><td>eBioscience</td><td>14-9897</td><td>מארח:</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-ציטוקרטין 7 (FITC) לעכבר&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab119697</td><td>מארח: עכבר</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד מוס IgG H& L נוגדן</td><td>Life Technologies</td><td>A-11029</td><td></td></tr></tbody></table>

ראשוניים האדם trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

פרוטוקול זה מתאר כיצד תאי ציטוטרופובלסטים מבודדים מהשליה במועד על ידי עיכול אנזימטי עוקב, ואחריו צנטריפוגה בצפיפות, בידוד שיפוע מדיה וטיהור אימונומגנטי. כפי שנצפה in vivo, תאי ציטוטרופובלסטים חד-גרעיניים בתרבית ראשונית מתמיינים לתאי סינציטיוטרופובלסט מרובי גרעינים לאחר 72 שעות. בהשוואה לנורמוקסיה (8% O2), תאי ציטוטרופובלסטים וילוסים העוברים היפוקסיה/חמצון מחדש (0.5% / 8% O2) עוברים מתח חמצוני מוגבר ואפופטוזיס פנימי, בדומה לזה שנצפה in vivo בסיבוכי הריון כגון רעלת הריון, לידה מוקדמת והגבלת גדילה תוך רחמית. בהקשר זה, טרופובלסטים ראשוניים שגודלו בתנאי היפוקסיה/חמצון מחדש מייצגים מערכת ניסויית ייחודית להבנה טובה יותר של המנגנונים ומסלולי האיתות המשתנים בשליה האנושית ולהקל על החיפוש אחר תרופות יעילות המגנות מפני הפרעות הריון מסוימות. טרופובלסטים ויליים אנושיים מייצרים מלטונין ומבטאים את האנזימים והקולטנים המסנתזים שלו. מלטונין הוצע כטיפול ברעלת הריון והגבלת גדילה תוך רחמית בגלל השפעתו נוגדת החמצון המגנה. במודל התאים הציטוטרופובלסטים הראשוני המתואר במאמר זה, למלטונין אין השפעה על תאי טרופובלסט במצב נורמוקסי אך משחזר את איזון החמצון החיזור של תאי סינציטיוטרופובלסט שהופרעו על ידי היפוקסיה/חמצון מחדש. לפיכך, תאי טרופובלסטים ויליים אנושיים בתרבית ראשונית הם גישה מצוינת לחקר המנגנונים מאחורי ההשפעות המגנות של מלטונין על תפקוד השליה במהלך היפוקסיה/חמצון מחדש.

בידוד immunopurification של תאי cytotrophoblast villous מתוך השלית טווח נורמלית שהתקבלה על ידי משלוח נרתיק ניב 1 x 10 8 תאי קיימא. השליה שקלה 350 גרם, היה 19 ס&quot;מ קוטר, 4 ס&quot;מ עם צורה discoid וממברנות שקוף. אין מום טבורית זוהה. חבל הטבור היה לוקליזציה paracentral ובאורך של 56 ס&quot;מ. הטוהר הוערך על ידי cytometry זרימה באמצעות vimentin ו cytokeratin-7 סמנים. יותר מ 98% מכלל התאים היו שליליים עבור vimentin וחיוביות עבור cytokerat...

כתב יד זה מציג מודל ייחודי במבחנה של תאי ציטוטרופובלסט אנושיים מטוהרים חיסונית שגודלו תחת היפוקסיה/חמצון מחדש. מודל זה מתאים לחקר ההשפעות המגנות של טיפולים מבטיחים, כגון מלטונין, על סיבוכי הריון הקשורים למתח חמצוני מוגבר ושינוי בתפקוד השליה.

ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון את ההשפעות המגינות של מלטונין באמצעות תאי cytotrophoblast ראשוניים מבלוטות השילייה של בני אדם שטוהרו אימונולוגית, אשר תורבדו תחת היפוקסיה או רה-אקסגנציה. שיטה זו עשויה לסייע בהבנת המנגנונים ומסלולי השליחה הקשורים לסיבוכי היריון בשילייה תחת היפוקסיה ורה-אקסגנציה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא התאמתה לבחינת טיפולים מבטיחים, כגון מלטונין, להפרעות בהיריון הקשורות לעקה חמצונית מוגברת.בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בשלבי בידוד הציטוטרופובלסט הווילי, כגון קיצוץ הרקמות והכנת מדרג הצפיפות למרכז הפגא. למרות שנושא זה יכול לספק תובנות על טרופובלסט בשליש השלישי להיריון, ניתן ליישמו גם על מערכות אחרות, כגון שליה בשליש הראשון או שליה של מינים אחרים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא חשובה, כיוון ששלבים רבים קשים ללמידה ללא צפייה בהם, והיא יכולה להגביר את השחזור ולהפחית את זמן הלמידה.את הפרוצדורה יעדימו סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי, Andree-Anne Hudon-Thibeault, Philippe Wong Yen ו-Eugenia Assuncao. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, חתכו את חבל הטבור לאורך נקודת החיבור לשליה ושמרו אותם ב-300 ml של תמיסת קיבוע לרקמות לצורך ניתוח היסטולוגי. לאחר מכן, חתכו את השליה כולה לקוביות.שטפו את הקוביות שוב ושוב בתמיסת סליין כדי להסיר תאי דם, עד שהסליין יהיה צלול. לאחר מכן, הסירו את קרומי השילייה וקצצו את הרקמות כדי להסיר כלי דם נוספים ולאפשר גישה להסדיים.לאחר מכן, העבירו את השליה הקצוצה למשפך בוכנר ושטפו את הרקמות עם 100 ml של בופר מלוח. המשיכו בקציצה עד לקבלת 30 עד 35 גרם של רקמות קצוצות והניחו אותן בכלי שקילה על קרח. לאחר מכן, הוסיפו את רקמות השליה הקצוצות לבקבוק טריפסינזציה.לאחר מכן, העבירו 150 ml של תמיסת העיכול 1 שהוכנה לבקבוק הטריפסינציה וערבבו היטב. הניחו את בקבוק הטריפסינציה במקלחה רועדת למשך 30 דקות, וערבבו את הבקבוק ידנית מדי חמש דקות כדי להבטיח עיכול הומוגני. בסיום העיכול הראשון, הוציאו את בקבוק הטריפסינציה מהמקלחה והטו אותו בזווית של 45 מעלות למשך דקה אחת כדי לשקע את רקמות השליה.בעזרת פפיטה סטרילית של 10 ml, הסיר והשלך כ-80 ml של נוזל העל (supernatant) ללא שאיבה של הרקמה. לאחר מכן, העבר 100 ml של תמיסת עיכול 2 לבקבוק הטריפסינציה וערבב היטב. הנח את בקבוק הטריפסינציה במכשיר רעידה בתוך אמבט מים למשך 30 דקות, וערבב את הבקבוק ידנית בכל חמש דקות כדי להבטיח עיכול הומוגני.בסיום העיכול השני, הוצא את הבקראק של ה-trypsinization מאמבט המים והטה אותו בזווית של 45 מעלות למשך דקה אחת. הסר 80 ml של הנוזל העליון (supernatant) והעבר אותו בעדינות לתוך מבחנה לצנטריפוגה באמצעות מסננת תאים בעלת רשת של 100 micrometer. בצע את העיכולים השלישי והרביעי, וחלק את הנוזל העליון מהעיכולים השני, השלישי והרביעי למנות של 13.5 ml בתוך מבחנות צנטריפוגה של 15 ml.לאחר מכן, הוסיפו בעדינות ובאיטיות 1.5 ml של FBS לתחתית של כל מבחנה כדי ליצור שכבה נפרדת. סובבו את המבחנות בצנטריפוגה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאבו והשליכו את שכבת העל ואת שכבת ה-FBS, כולל את העשיר הלבן שבין שתי השכבות.יש להשעות את המשקע ב-1 ml של מצע תרבית תאים חם. אספו את התאים שהושעו מכל השפופרות ואיחדו אותם לשפופרה אחת עבור כל עיכול. לאחר מכן, השלימו את הנפח ל-15 ml באמצעות מצע תרבית תאים חם.סנטריפוג את התאים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסירו את supernatant באמצעות משאבת ואקום והימנעו משאיבת ה-pellet. לאחר פעולה זו, השביה בעדינות את ה-pellet ב-1 ml של מצע גידול תאים חם.אחדו את התכנים של כל מבחנות העיכול. הוסיפו מצע גידול תאים חמים נוסף עד להשגת נפח של 8 ml. לאחר מכן, הניחו בעדינות את תרחיף התאים על גבי מדרג הפרדה (separation gradient) וסבבו בצנטריפוגה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הצנטריפוגציה, זהו את השכבות השונות של התאים במדרג הדחיסות באמצעות תאורה אחורית. אתר את השכבות המכילות טרופובלסטים ואת התאים המזהמים בין 40% ל-50% של מדיום הצנטריפוגציה לפי דחיסות, והסר את השכבות העליונות בעזרת משאבת ואקום. לאחר מכן, אסוף את התאים הנמצאים בשכבות הרלוונטיות והעבר אותם למבחנה לצנטריפוגה בנפח 50 ml.השלם את הנפח ל-50 ml באמצעות מצע גידול תאים וסבב במערך צנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. תחת תנאים סטריליים, הפשר במהירות את התאים שהוקפאו בשלב 1.2.22 באמבט מים בטמפרטורה של 37-degree Celsius. העבר את התאים שהופשרו למבחנה של 50 ml ושחזר אותם בעדינות עם 20 ml של running buffer קר.בשלב הבא, סבבו את המבחנה בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-4 degrees Celsius. השליכו את העילוי וחזרו על שלב השטיפה עם תמיסת ריצוף (running buffer) קרה. לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר (hemocytometer) כדי לקבוע את חיוניותם, ולאחרי כן חזרו שוב על הסבב בצנטריפוגה.לאחר מכן, הסירו בזהירות את העל-נוזל והוסיפו לתאים 1 ml של תמיסת ריצה (running buffer) קרה המכילה 1% נפח לנפח של נוגדן עכבר נגד HLA ABC. דגרו את התאים בטמפרטורה של 4 degrees Celsius למשך 30 דקות, תוך ערבוב עדין מדי חמש דקות. לאחר הדגירה, הוסיפו 6 ml של תמיסת ריצה קרה וסבבו בצנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 degrees Celsius.שפוך את הנוזל העליון וחזור על שלב זה. לאחר מכן, השהה את התאים ב-1 ml של running buffer קר המכיל 10% נפח לנפח של חרוזי מגנט המצומדים לנוגדן משני נגד עכבר. לאחר מכן, דגרי את התאים בטמפרטורה של 4 degrees Celsius למשך 30 דקות, תוך ערבוב עדין בכל 5 דקות שוב.לאחר מכן, הוסיפו 6 ml של running buffer קר וסובבו במערך צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השליכו את העילוי ותלו את התאים מחדש ב-5 ml של running buffer קר. לאחר מכן, הפרידו את תאי הטרפובלסט באמצעות מכשיר טיהור מגנטי ואספו את התאים בפתח השלילי (negative port).הוסיפו 20 ml של בופר הרצה (running buffer) קר לתאים וסבבו בצנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השליכו את העלייה (supernatant) והחזירו בעדינות את התאים לתליה ב-20 ml של מצע תרבית ראשוני לתאים חמים המכיל 10%FBS, לפני ספירת התאים לקביעת החיוניות. כעת, זרעו את התאים והדגירו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2.לאחר ארבע שעות לפחות, שטפו את התאים פעמיים במצע תרבית חם כדי להסיר תאים שאינם תפוסים. לאחר מכן, העבירו את הפלטות לתא נורמוקסיה, אשר ימולא ב-8%O2. מחוץ למCה, חברו את פתח הכניסה של התא לצינור הגז כדי להגיע למקור הגז.פתחו את שני פתחי הכניסה והיציאה של התא והשאירו את ווסת הגז סגור. לאחר מכן, פתחו בזהירות את שסתום ווסת הגז ושטפו בזרימת אוויר של 25 liters per minute למשך 4 דקות כדי להחליף לחלוטין את האוויר בתוך התא. לאחר שטיפת התא, סגרו את ווסת הגז, ולאחריו את פתחי הכניסה והיציאה של התא.נתק את צינור היציאה של מד הזרימה מפתח הכניסה של התא והנח את התא באינקובטור לתרביות תאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. החלף את האוויר שנמצא כעת בלוחיות, בבקבוקים ובמדיום התרבית על ידי מילוי מחדש של התא בגז בקצב זרימה של 25 liters per minute למשך 4 דקות. איור זה מראה את ההשפעה של melatonin על הפרשת beta human chorionic gonadotropin במהלך התמיינות של villous trophoblast.הבידול הביוכימי של ציטוטרופובלסטים וילוסיים (villous cytotrophoblasts) לסנציטוטרופובלסטים (syncytiotrophoblasts) נקבע על פי הערכים העולים של beta human chorionic gonadotropin, שהגיעו לערך מקסימלי לאחר 72 שעות של תרבית תאים, כפי שמוצג כאן. לטיפול במלטונין לא הייתה השפעה על בידול ציטוטרופובלסטים שגודלו ב-8% oxygen בהשוואה לבקרת vehicle. מוצג כאן השפעתה של 1 millimolar של מלטונין על רמות של מיני חמצן רגזים (reactive oxygen species) בין-תאיים בתאי סנציטוטרופובלסט תחת נורמוקסיה או היפוקסיה עם חמצון מחדש (reoxygenation) שהושרה לאחר 72 שעות של תרבית.טיפול במלטונין מגן על הסינציטיוטרופובלסטים מפני עקה חמצונית מוגברת הנגרמת מרה-חמצון לאחר היפוקסיה, על ידי החזרת רמות הרדיקלים החופשיים לרמות של נורמוקסיה. סכימה זו ממחישה את ההשפעות המגינות הבין-תאיות הרחבות של מלטונין מפני עקה חמצונית ואפופטוזיס מיטוכונדריאלי המושרים על ידי היפוקסיה ורה-חמצון בסינציטיוטרופובלסטים ראשוניים. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע את טכניקת הבידוד בשמונה שעות, ושלוש שעות מספיקות לקבלת תאי טרופובלסט מטוהרים אם הפעולה מבוצעת כראוי.לאחר פיתוחה, סללה הטכניקה של בידוד, טהרה ותמיכה ראשונית של תרביות תאי cytotrophoblasts תחת טכניקת היפוקסיה-רי-אוكسגנציה (hypoxia-reoxygenation) את הדרך להבנה טובה יותר של סיבוכי היריון ולשיפור בריאות השילייה והעובר. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להעריך את רמת הטוהר של תאי ה-villous trophoblast בסיום תהליך ה-immuno-purification, למשל באמצעות flow cytometry.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכוש הבנה טובה של אופן בידוד של ציטוטרופובלסט ראשוני של שליה (primary villous cytotrophoblast) באמצעות טיהור אימונולוגי, וגידולם תחת תנאי היפוקסיה-ריאוキシגנציה.

human-primary-trophoblast-cell-culture-model-to-study-protective

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מסורתית, שני ממדי התרבות טכניקות תא לעיתים לגרום מאפיינים שינו לגבי סמנים בידול, ציטוקינים וגורמי גדילה. תלת ממדי התרבות תאים במערכת מסתובבת תרבית תאים (RCCS) reestablishes הביטוי של רבים מהגורמים הללו כפי שמוצג כאן עם קו trophoblast extravillous התא.

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של תאים טרופובלסטיים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות חלבון מורפוגני בעצם 4 ומעכבים של מסלולי האקטיבין/צמתים. שיטה זו מתאימה להתמיינות יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ויכולה לייצר כמויות גדולות של תאים למניפולציה גנטית.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור דגימה של רקמה אנושית היפרדות villous חלקית ואחריה בידוד של cytotrophoblasts לתרבות התא הראשי. טיפול trophoblasts עם TNFα recapitulates דלקת התוך-רחמית שמנים ומקל על גילוי מטרות מולקולריות מוסדר על ידי דלקת מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית.

מודל ראשי Trophoblast האנושי כדי לחקור את ההשפעה של דלקת הקשורות בהשמנת יתר אימהית על ויסות Autophagy את השליה

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול ונגישות גבוהה להערכת תנועת התא בתאים trophoblast האנושי באמצעות שלושת מבחני במבחנה: וזמינותו מאפס, וזמינותו הפלישה transwell ואת וזמינותו התפשטות תאים.

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

כאן, אנו מתארים שיטה לחימום בלסטוציטים אנושיים זגוגיים, איסוף אותם דרך תקופת ההשתלה במבחנה, לעכל אותם לתאים בודדים ואיסוף תאי trophoblast מוקדם לחקירה נוספת.

אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי

ההשפעות המובהק של דרגות שונות של היפותרמיה על הגנה שריר הלב לא הוערכו ביסודיות. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לכמת את רמות המוות התאי בעקבות טיפולי היפותרמיה שונים במודל מבוסס קרדיומיוציטים אנושיים, ולהניח את היסודות למחקר מולקולרי מעמיק בעתיד.

אין ויטרו הערכה של הגנה שריר הלב בעקבות היפותרמיה-תנאים מקדים במודל מיוציטים לב אנושי

מחקר זה נועד לפתח מודל תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית חדשנית (HORC) המונעת פגיעה בשלמות הרשתית במהלך טיפול בהסבר. זה מושגת על ידי פולחן הרשתית עם הזגוזית יתר על המידה ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית הבסיסית-choroid (RPE-choroid) ו sclera.

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

כאן, אנו מתארים פרוטוקול חוץ גופני למידול נזקי היפוקסיה/חמצון מחדש בתאי אפיתל פרוקסימליים פרוקסימליים מטבוליים מאוד. מודל זה נועד לגרום לנזק שנגרם מלחץ מטבולי, שניתן למדוד באמצעות ביטוי סמני נזק לצינורות הפרוקסימליים והערכת תפקוד הנשימה המיטוכונדריאלי.

מידול פגיעות היפוקסיה/חמצון מחדש בתאי אפיתל צינוריים פרוקסימליים

אורגנואידים קרדיאליים אנושיים מתאספים מעצמם (hCOs) הם מערכת מתפתחת למידול התפתחות ומחלות לב אנושיות. כאן, מסופקת מתודולוגיה ליצירת ופגיעה ב-hCOs עם היפוקסיה-חמצון מחדש ופרטים על תוצאות היסטולוגיות ותפקודיות צפויות לאחר הפציעה.

מודל פגיעות היפוקסיה-חמצון מחדש בקרדיואידים אנושיים שמרכיבים את עצמם

פרוטוקול סטנדרטי להשראת הזדקנות מוקדמת ב-HNM באמצעות tBHP, פרוטוקולים סטנדרטיים לניתוח סמנים מרכזיים של הזדקנות, כולל עצירת גדילה, פעילות SA-β-גלקטוזידאז וגורמי SASP.

פרוטוקול סטנדרטי להשראת הזדקנות מוקדמת הנגרמת מלחץ במלנוציטים ראשוניים בבני אדם באמצעות טרט-בוטיל הידרופרוקסיד

חקור את ההשפעות המגנות של מלטונין בתאי טרופובלסט אנושיים תחת תנאי היפוקסיה וריאוקסיגנציה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד על מנגנוני הגנה מפני מתח חמצוני בפלצנטה.

ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש

גלה סרטונים נוספים