איך ללמוד מרתף ממברנה נוקשות כמפעיל Biophysical הערמונית סרטן ומחלות גיל הקשורות אחרים או מחלות מטבוליות

המטרה הכוללת של מודל זה היא לחקור כיצד קשיחות ועובי קרום הבסיס, עקב גליקציה מתקדמת וחשיפה למוצר, יכולים לווסת את התנהגות התאים הפולשניים המתאימים לשלבים המוקדמים והמתקדמים של סרטן ערמונית גרורתי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפתולוגיות הקשורות לגיל. כמו למשל כיצד קשיחות ועובי מוגברים של קרום הבסיס תורמים להתקדמות הסרטן, וגם הפרעות מטבוליות כמו סוכרת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה פשוטה לחיקוי רמת הנוקשות הנמדדת בגידולי ערמונית אנושיים בסביבה הקלינית. ההשלכה של טכניקה זו משתרעת על הטיפול והאבחון שלנו בסרטן הערמונית על ידי שיפור ההבנה שלנו כיצד נוקשות קרום הבסיס מקדמת שינויים מולקולריים ותאיים. אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק, מכיוון שהמודל הוא רב תחומי.

שילוב טכניקות מתחומי הכימיה, הפיזיקה והביולוגיה. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר שיערנו שנוקשות קרום הבסיס בבלוטת הערמונית יכולה לקדם התנהגות פולשנית דה נובו בתאי אפיתל ידועים שעברו טרנספורמציה. הדגמת וידאו של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שיש לתאר צעדים בין-תחומיים.

כולל קישור צולב של קרום הבסיס, ואחריו תרבית תאים תלת מימדית. התחל בהכנת משטח קרח אחיד, והשתמש בו כדי לצנן מגלשת זכוכית תאית של שמונה בארות לארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, חותכים את קצה קצה הפיפטה של 200 מיקרוליטר, ומצננים גם את הקצה לארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הקירור, הנח את הקצה על עזר פיפטינג בקיבולת 200 מיקרוליטר. והשתמש בו כדי להעביר 40 מיקרוליטר של תמיסת מטריצת BM קרה כקרח לכל באר של מגלשת הזכוכית המצוננת של שמונה בארות. לאחר מכן הנח את שקופית החדר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לקדם פילמור של קרום המרתף.

סגור את דלת החממה בזהירות רבה כדי למנוע הפרעה לקרום המרתף המשוחזר בנוזל. לאחר 30 דקות בדיוק, הוסיפו 250 מיקרוליטר של תמיסת גליקולאלדהיד מוכנה כדי לכסות את קרום הבסיס הפולימרי והמשוחזר. לאחר מכן, הכינו בקרה שלילית על ידי הוספת 250 מירקוליטר של PDS סטרילי לג'ל קרום מרתף מקורי ומשוחזר.

כמו כן, הכינו שני בקרות נוספות על ידי הוספת 50 מילי-מולרי נתרן ציאנובורוהידריד, או 250 מילי-מולרי אמינוגואנידין לתמיסת גליקולאלדהיד לפני הוספתו לג'ל קרום המרתף. לאחר מכן, דגרו את הג'לים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שש שעות כדי לייצר ג'ל חצי נוקשה. או למשך 14 שעות לייצור ג'ל נוקשה.

לאחר הדגירה, הסר בזהירות את התמיסות מהג'לים והוסף 250 מיקרוליטר של אסתר אתיל גליצין מולארי אחד לכל ג'ל. ולדגור אותם בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. שטפו כל ג'ל 10 פעמים ב -500 מירקוליטר של PBS כדי להסיר את כל העקבות של תמיסת הגליקולאלדהיד ואסטר הגליצין אתיל.

לאחר מכן הוסיפו 400 מיקרוליטר PBS כדי למנוע התייבשות ודגרו את ג'לי קרום הבסיס המחודש למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כאשר מוכן להמשיך, הסר את ה- PBS מג'לי קרום המרתף המשוחזרים, והוסף 250 מיקרוליטר מים קרים כקרח מזוקקים כפולים לכל באר. דגרו את הג'לים בארבע מעלות צלזיוס למשך 16 עד 24 שעות כדי להבטיח שהמטריצה נוזלית לחלוטין.

לאחר מכן העבירו את קרום הבסיס הנוזלי לצינור של 1.5 מיליליטר, ומדדו את פליטת הפלואורסצנט של התמיסה באמצעות ספקטרופוטומטר. ואז צנטריפוגה את התמיסה והסר את הסופרנטנט שהתקבל. השעו מחדש את הגלולה ב -500 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 20 מיליגרם למיליליטר ציאנוגן ברומיד ו -70% חומצה פורמית.

דגרו את הדגימות למשך הלילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמש במזרק חד פעמי של מיליליטר אחד כדי להעביר את ג'ל קרום המרתף התלוי מחדש לקלטת דיאליזה עם חיתוך משקל מולקולרי של 3.5 קילודלטון. טבלו את הקסטה בכוס זכוכית של 500 מיליליטר המכילה 500 מיליליטר מים מזוקקים כפולים.

ומערבבים את המים בעזרת מוט ערבוב מגנטי. הנח את ההתקנה הזו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל עקבות הציאנוגן ברומיד וחומצה פורמית. השתמש במזרק חד פעמי של מיליליטר אחד כדי להעביר את התמיסה המחייגת מהקסטה לצינור של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן נתח את התמיסה על ידי הפעלתה על ג'ל פוליאקרילאמיד 12%. צבעו את הג'ל בכתם כסף כדי לדמיין את הדפוס האלקטרופורטי של פפטידי מטריצת הציאנוגן ברומיד. החל מג'לי קרום המרתף המכוסים ב- PBS, יש לשטוף את הג'לים פעמיים נוספות, כאשר 300 מיקרוליטר PBS המכילים 0.1 מילימול סידן כלורי.

ו -0.5 מילימול של מגנזיום כלוריד. במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את ה-PBS והוסף 300 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד כדי לכסות כל ג'ל קרום מרתף משוחזר.

דגרו את הג'לים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את רכיבי קרום המרתף המשוחזרים. לאחר מכן, הסר את הקיבוע והוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת מרווה המכילה 75 מילימול אמוניום כלוריד ו -0.5 מילימול מגנזיום כלוריד. דגרו את התמיסה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ואז הסירו את התמיסה וחזרו על השטיפה ארבע פעמים נוספות.

לאחר השטיפה הסופית, הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר אימונופלואורסצנטי לג'לים של ממברנת הבסיס המשוחזרים כדי למנוע תגובות לא ספציפיות. דגרו את הג'לים בתמיסה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר על פלטפורמה מטלטלת. לאחר מכן הסר את המאגר החוסם את האימונופלואורסצנטי.

ולהוסיף 300 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני המדולל במאגר החוסם. דגרו את ג'לי קרום הבסיס המחודשים בארבע מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. למחרת, הסר את הנוגדן העיקרי ושטוף את הג'לים שלוש פעמים עם 300 מיקרוליטר של חיץ אימונופלואורסצנטי.

יש לנער את הג'לים בטמפרטורת החדר על משטח ניעור למשך 10 דקות לאחר כל תוספת חיץ. לאחר מכן הסר את המאגר והוסף 300 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המסומן בפלורסנט מדולל במאגר החוסם. מניחים את הדגימות על משטח טלטול, ומדגרים את הג'לים למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.

הסר את הנוגדן המשני. שטפו את הדגימה במאגר אימונופלואורסצנטי, ואחריו PBS, ולאחר מכן תקנו והרוו את הדגימות בפעם השנייה. לבסוף, הרכיבו את הג'לים והשתמשו במיקרוסקופ כדי לנתח את היווצרותם של צרורות צפופים.

ליצירת אציני בלוטת הערמונית, יש לדלל 5,000 תאי RWPE-1 ב-300 מיקרוליטר של KSFM שלם, בתוספת 2% מתמיסת קרום הבסיס. עבור אגרגטים של תאי גידול בערמונית, יש לדלל 2,500 תאי PC3 ב-300 מיקרוליטר של מדיום תרבית RPMI-1640, בתוספת 2% מתמיסת קרום הבסיס. לאחר דגירה של לילה של ג'לי קרום הבסיס המשוחזרים ב- PBS, יש לשטוף אותם פעמיים עם 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית.

לפני זריעת התאים. זרעו בעדינות את התאים על ממברנות הבסיס המקוריות והמתקדמות של המוצר הסופי המוקשח. והניחו בזהירות את התרביות בחממה כדי להבטיח חלוקה אחידה של אציני וספרואידים גדלים.

עבור התאים היוצרים אציני, החלף את המדיום כל יומיים במדיום תרבית טרי, המכיל 2% מתמיסת קרום הבסיס. כדי להבטיח שלתאים יש את גורמי הגדילה הנדרשים להומאוסטזיס אקיני תקין. לאחר שישה ימים בתרבית, תאי אפיתל של הערמונית יוצרים אציני על קרום הבסיס המקורי ששוחזר.

ומאורגנים בספרואידים במדים של תאי אפיתל. לאציני אלה יש גם מאפיינים של PECs מאורגנים מאוד עם קוטביות אפיקלית עד בסיסית, ומרחב לומינלי גלוי. כאשר מתרבתים במשך שישה ימים על הממברנה הנוקשה יש לתאים ארכיטקטורה משובשת.

ומשתנה מכדורי למצולע בצורתו. בנוסף, האציני הללו מאוד לא מאורגנים. ואיבדו את הקוטביות האפיקלית לבסיסית שלהם, עם מרחב לומינלי קטן או לא קיים.

זה נכון גם לגבי תאים שמקורם בבלוטת הערמונית המושפעת מהגדלה שפירה של הערמונית. כאשר נמדדו תאי גידול הערמונית, התאים נמצאו ארוכים יותר על קרום הבסיס הנוקשה והמשוחזר, וגם נדדו מהר יותר והגדילו את עמידות התאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדגמן את ההשפעות של נוקשות קרום הבסיס על התנהגות תאי האפיתל והגידול.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהרמה הרצויה של קשיחות קרום הבסיס מושרתת, ונוצרים כראוי acini או s-spheroids. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האונקולוגיה לחקור את השראת פלישת תאים סרטניים על ידי נוקשות קרום הבסיס בבלוטת הערמונית. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע שיטה אחרת, כמו אימונובלוטינג של ליזאט תאים כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות למסלול האיתות, המווסת על ידי נוקשות קרום הבסיס.

אל תשכח שעבודה עם נתרן ציאנובורוהידריד, ציאנוגן ברומיד וחומצה פורמית עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת חלוק מעבדה, כפפות, מגן פנים ומכונת הנשמה בזמן עבודה במכסה האדים בעת ביצוע הליך זה.