שימוש בסוללה של שיטות כימיות Ecotoxicological עבור הערכת היעילות של תהליכי טיפול בשפכים להסיר אסטרוגניים און

המטרה הכוללת של סדרת הבדיקות המתוארת כאן, הכוללת כימיה אנליטית ושיטות in vitro ו-in vivo, היא לקבוע את יעילותן של טכנולוגיות חדשניות ומתפתחות לטיפול בשפכים להסרת מזהמים אסטרוגניים. שיטות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בהנדסת סביבה, למשל, בעת בחירת תהליכי טיפול בשפכים היעילים ביותר להפחתת העוצמה האסטרוגנית של השפכים. היתרון המרכזי של טכניקות אלו הוא רגישותן לריכוזים נמוכים מאוד של תרכובות פעילות, ובכך הן מאפשרות להצביע על הטכנולוגיות הטובות ביותר להגנה על חיי המים.

את הפרוצדורות ידגימו עמית המחקר לאחר הדוקטורט, Dr.Chris Green, סטודנטית לתואר מתקדם, Angela Pinzon, עמיתת מחקר, Dr.Alice Baynes, וטכנאית מחקר בכירה, Nicola Beresford. תהליך ה-SPE דורש תשומת לב קפדנית לנקיון ולסדר כדי למנוע זיהום של הדגימה. יש לנקות מראש את כל המבחנות, הברזים והפריטים (frits) באמצעות מيثנול.

לפני הרצת הדגימות, חברו את קווי ההעברה לסעפת המיצוי, ושטפו את המערכת כולה במים דאיוניים. כדי להריץ את הדגימות, חברו תחילה את דיפון השסתומים החד-פעמי, ולאחר מכן חברו את מחסניות ה-SPE מסוג styrene divinylbenzene. בשלב הבא, העבירו בפיפטה 5 mL של ethyl acetate לכל מאגר כדי להכין (condition) את המחסניות.

בשלב זה, ודאו שמיצוי הפאזה המוצקה (SPE) אטום. לאחר מכן, הפעילו את משאבת הוואקום לקצב זרימה של 10 millimeters per minute. לפני שהעמודיות יתייבשו, טענו חמישה milliliters של methanol, ולאחריהם חמישה milliliters של מים.

חשוב מאוד שסמילילי ה-SPE לא יתייבשו. לאחר שרוב המים נשאבו, כבו את המשאבה ומלאו שוב את מאגרי המים של כל סמיליל. לאחר מכן, חברו צינורות PTFE בקוטר 1/8th inch בין מאגרי הסמילילים לבקבוקורי דגימה מזכוכית.

כעת, העבירו את הוואקום לקצב זרימה נמוך מ-10 milliliters per minute, ואפשרו לכל הדגימה לעבור דרך העמוד. לאחר מכן, ייבשו ביסודיות את עמודי ה-SPE, עד שתכולת העמוד תשנה את צבעה. השתמשו בוואקום או בזרם גז.

כעת, טענו מבחנות איסוף מזכוכית נקיות ויבשות בנפח 10 milliliter למסננת והניחו את המסננת בתוך סבב המיצוי (extraction manifold). ודאו שכל 라이נר (liner) נמצא מעל מבחנה. מלאו את מאגרי הדגימות בשני מנות של 4 milliliters, לסך הכל 8 milliliters של dichloromethane, הפעילו את משאבת הוואקום, והניחו לנוזל לעבור דרך ה-SPE אל תוך מבחנות האיסוף.

לאחר מכן, השתמש במרכז (concentrator) כדי להפחית את הנפח בכל מבחנות האיסוף ל-1 milliliter. העבר כל דגימה למבחנת autosampler, ורכז אותן עוד יותר עד ל-100 microliters, באמצעות ציוד ייבוש בחנקן (nitrogen blow down). השלב הבא בתהליך הוא שימוש ב-GPC כדי להסיר הפרעות של מקרו-מולקולות.

ראשית, מזריקים 95 µL של תמצית הדגימה שנאלוטה לתוך ה-HPLC המצויד ב-GPC. מרכזים את תמצית ה-GPC לנפח של 200 µL באמצעות מרכז (concentrator) ומערכת ייבוש בחנקן, ולאחר מכן ממלאים לנפח של 2 mL עם hexane. לאחר מכן, מחברים לסומן ה-SPE רפידות שסתום חד-פעמיות, מחשבי amino purple ומכלי קיבול למחבובים, דרך מבחנות איסוף מזכוכית של 10 mL.

כעת, טענו שני מיליליטרים של hexane לכל מחסנית, כדי להכין אותן, והשליכו את הממס. לאחר מכן, טענו את תמצית דגימת ה-GPC למאגר, ושאבו אותה דרך המחסנית. הניחו את תמצית האיסוף בצד, והחזירו את הבקבוקון למעמד כדי לאסוף את השטיפה.

בשלב הבא, העבירו שני מיליליטר של תמיסת ethyl acetate ו-hexane בריכוז של 30% נפח/נפח דרך העמוד. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר נוספים של ethyl acetate ו-hexane, השליכו את תמיסות השטיפה והחזירו את מבחנת האיסוף בנפח 10 מיליליטר למעמד. כעת, הוסיפו למאגר שני מיליליטר של תמיסת ethyl acetate ואצטון בריכוז של 50% נפח/נפח, והפעילו את המשאבה בקצב זרימה נמוך, מתחת לשני מיליליטר לדקה.

לאחר שהנוזל נשאב, הוסף שני מיליליטרים נוספים של ethyl acetate בריכוז 50% למאגר. כעת, השתמש במרכז (concentrator) כדי להפחית את נפח התמצית ל-1 מיליליטר. לאחר מכן, העבר את הדגימה למבחנה מזכוכית קטנה יותר, והשתמש בציוד ייבוש בחנקן (nitrogen blow down) כדי לאדות את התמצית עד להגעה לשלב התחלתי של התגבשות. הוסף 100 µL של methanol, ערבב את הדגימה היטב והעבר אותה למבחנת דגימה אוטומטית (autosampler vial) עם אינסרט של 0.3 מיליליטר.

לאחר מכן, בצע ניתוח LC-MS/MS של התמצית. ביום שלפני תחילת הבדיקה, הכן מצע גידול טרי והדבק אותו עם tenax dock של זן ה-HER שבו נעשה שימוש. למחרת, התכונן לבדיקה על ידי הכנת מהלולי דילול סדרתיים של 100 microliter של הכימיקלים הנבדקים או של תמציות השפכים, ולאחר מכן הכן עקומת סטנדרט של E2 באתנול.

כעת, העבירו מנות של 10 µL לפלטת 96 בארות סטרילית ומסומנת. לאחר מכן, השאירו את הפלטה ללא מכסה כדי לאפשר את התאיידות האתנול. בשלב הבא, הכינו 50 mL של מצע גידול, עם 0.5 mL של תמיסת CPRG.

מתוך תרבית השמרים בת 24 השעות, מדדו את העכירות ב-620 ננומטר כדי להעריך את צפיפות התאים. לאחר מכן, הוסיפו 40 מיליון תאי שמרים ל-50 מיליליטר של תוצר המבחן. העבירו את תוצר המבחן המוחדר לאמבטיה סטרילית, והשתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר 200 מיקרוליטר מהתוצר לכל באער של פלטת המבחן.

החזירו את מכסה פלטת הבדיקה, אטמו את הקצוות בעזרת סרט דבק, ונערו את פלטת הבדיקה בעוצמה במשך שתי דקות באמצעות מנער פלטות. לאחר מכן, הדגירו את הפלטה בטמפרטורה של 32 Celsius, בתוך תנור חימום מאוורר באופן טבעי. לאחר שלושה ימי הדגרה, חזרו על פעולת הניעור, ולאחר מכן המתינו כשעה עד לשקיעת השמרים.

לבסוף, מדדו את בליעת האור על ידי הדגימות, באורכי גל של 540 ו-620 ננומטרים. דגימות מים ממתקן טיפול שפכים קונבנציונלי להפעלת תהליך הבוצה שלהן, נותחו באמצעות LCMS עם יינון שלילי במיקרו-רסס (electrospray), ונמצא כי אתניל אסטרדיול היה נוכח בריכוז הגבוה מרמת התגובה החזויה (predicted no effect level). באמצעות טיפול מתקדם במים, כגון פחם פעיל גרנולרי, או GAC, ניתן היה להפחית באופן משמעותי את רמות האתניל אסטרדיול.

כלל תמציות מי השפכים נותחו עם סטנדרט פנימי מסומן איזוטופית, שיא אדום, כדי לאפשר כימות. בדיקת הסריקה של השמרים לאסטרוגן הייתה רגישה בבירור לסטנדרט האסטרדיול, אך לא הראתה תגובה לאתנול, המשמש למעשה כביקורת (blank). תאי סריקת השמרים הגיבו בבירור לשפכים מתהליך בוצה מופעלת, בעוד שהשפכים שעברו טיפול ב-GAC הניבו תגובה מופחתת, אך הם עדיין היו פעילים ביולוגית יותר מהביקורת.

באמצעות טכנולוגיה חדשנית זו לטיפול בשפכים, הן ריכוז ה-ethanol estradiol, המוצג בכחול, והן הפעילות האסטרוגנית, המוצגת בירוק, הופחתו באופן משמעותי על ידי טיפול משולב במימן פרוקסיד ו-TAML. מתקני טיפול בשפכים הם המקור העיקרי לזיהום מי שטח בחומרים בעלי פעילות אסטרוגנית. דרכים חדשות לתהליכי טיפול במים במטרה לשפר שפכים אלו מחייבות בדיקה מעמיקה של הפעילות האסטרוגנית.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של סדרת בדיקות כימיות ובדיקות רעילות סביבתית (ecotoxicology), הנחוצות למדידת פעילות אסטרוגנית בדגימות מים. חשוב ביותר להבטיח שהזיהום של הדגימות והתמציות ימוזער באמצעות טיפול זהיר בהן. לדוגמה, פלסטיקים נפוצים מכילים תרכובות אסטרוגניות, לכן חיוני לכלול בקרות שליליות לבדיקת זיהום כימי, ובקרות חיוביות כדי לוודא ששיטת המיצוי עבדה ושניכר שיעור השבה טוב של אסטרוגנים שהוספו למערכת.