Name: תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: למדו שיטה לתרבות מקרופאגים מונוציטים אנושיים באמצעות M-CSF עם קריופרזרבציה והפרדה צנטריפוגלית. שיטה זו מבטיחה צפיפות תאים אחידה ומפחיתה תלות בתורמים למחקר ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחלקה לרפואת עירוי, המרכז הקליני, המכונים הלאומיים לבריאות, סיפקה מונוציטים משופרים. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר התוך-כיתתי, המכון הלאומי ללב, ריאות ודם, המכונים הלאומיים לבריאות.

Leukapheresis בוצע תחת פרוטוקול המחקר של הסובייקט אנושי שאושר בידי מכוני הלאומיים לוח סקירה מוסדית הבריאות. 1. ניתוק ו Cryopreservation של מונוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג תאים mononuclear ידי leukapheresis התורמים אדם, ולהעשיר מונוציטים ידי elutriation צנטריפוגה רציפה נגד זרימה של תאים mononuclear כמתואר אזכור 7,8. השג כ 100 x 10 6 תאים elutriated (כ -80 - 90 מונוציטים%) במאגר elutriation שצוינו על ידי היצרן. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מונוציטים צנטריפוגה בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ&quot;ל ב 300 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant בעדינות resuspend התאים FBS ואחריו sulfoxide דימתיל כדי להשיג ריכוז סופי של sulfoxide דימתיל 90% FBS / 10% ו -50 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כל מ&quot;ל של התא תלוי על העריסהo cryovial הפרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את cryovials במיכל הקפאה תא ולהעביר מקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני העברת טנק אחסון cryovial חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך. </li></ol> בידול 2. של מונוציטים לתוך המקרופאגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פשרת cryovial של תאים על ידי העברה במהירות באמבט מי 37 ° C ומייד הסרה כאשר השעית התא הפשירה כ -70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד עם ההפשרה מלאה בטמפרטורת החדר, להעביר את 1 מ&quot;ל תוכנו cryovial לתוך 50 מ&quot;ל של 37 ° C חימם רוזוול פארק הזיכרון במכון (RPMI) 1640 בינוני עם 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml interleukin-10 (IL-10), ו -10% FBS (בינוני מלא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 25 מ&quot;ל של השעיה מונוציטים לתוך כל אחת משתי 75 ס&quot;מ 2 צלוחיות תרבית תאים פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תרבויות בתוך חממת תרבית תאי 37 ° C עם אוויר 5% CO 2/95% למשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את מ&quot;קltures 3 פעמים עם 10 מיליליטר RPMI 1640 בינוניים (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס), הסרת בינוני התרבות בעדינות כדי למנוע פירוק כל תאים מחוברים באופן רופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות שטיפה, להוסיף בינוני שלם טרי, שינוי בינוני כל 2 ימים עד מונוציטים להבדיל מתרבים מספיק להיות ומחוברות. זה דורש כשבוע של התרבות. </li></ol> המקרופאגים קציר 3. ליזום ניסויים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מקרופאגים הבדיל ב הבקבוק 3 פעמים עם 10 מ&quot;ל מראש חימם 37 ° שנאגרו מלוחים פוספט של C Dulbecco ללא Ca 2 + ו Mg 2+ לפני הוספת 10 מ&quot;ל מראש חימם 37 ° C 0.25% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה פתרון (EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בקבוק באינקובטור תרבית תאים עבור 10 - 15 דקות שאז כ 90% של מקרופאגים צריכים מעוגלים ומנותקות. לבדוק זאת על ידי בדיקה מיקרוסקופית של הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של מדיום RMPI 1640 המכיל 10% FBS כדי strypsinization העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה תא מקרופאג מהבקבוק לתוך צינור פוליפרופילן 50 מ&quot;ל, צנטריפוגה XG 300 במשך 5 דקות, וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend בעדינות את מקרופאגים לתוך 1 מ&quot;ל של מדיום מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10 μl של השעיה תא מקרופאג עם 10 μl פתרון Trypan כחול לקבוע מספר הסלולרי מקרופאג הכדאיות (בדרך כלל&gt; 95%) באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתבסס על ספירת התאים (בדרך כלל בערך 15 - 18 x 10 5 מקרופאגים), להוסיף בינוני מלא נוסף כדי להשיג את צפיפות תאי זריעה הרצויה. הערה: 1 x 10 5 מקרופאגים 1.5 מ&quot;ל בינוני לכל גם צלחת 12 גם יפיק התרבות ליד ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זריעה, דגירת מקרופאגים לילה חממת תרבית תאי 37 ° C עם 5% CO 2/95% אוויר לאפשר התקשרות תא. לאחר מכן, מתחיל ניסויים רצויים. </li></ol>

<ol><li>Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+polarization+of+macrophages+in+inflammation%3A+blood+monocytes+versus+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages.</a> Front. Immunol. 5, 683(2014).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+colony-stimulating+factor-induced+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages.</a> Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).</li>
<li>Akagawa, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+colony-stimulating+factor-induced+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages.</a> Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).</li>
<li>Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF%29+and+macrophage+CSF-dependent+macrophage+phenotypes+display+differences+in+cytokine+profiles+and+transcription+factor+activities%3A+implications+for+CSF+blockade+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation.</a> J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).</li>
<li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).</li>
<li>Strasser, E. F., Eckstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+leukocyte+collection+and+monocyte+isolation+for+dendritic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture.</a> Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+enrichment+from+leukapheresis+products+by+using+the+Elutra+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator.</a> Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).</li>
<li>Anzinger, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+low-density+lipoprotein+uptake+by+macrophage+colony-stimulating+factor-differentiated+human+macrophages+is+mediated+by+macropinocytosis+and+micropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+receptor-independent+low+density+lipoprotein+uptake+and+cholesterol+accumulation+by+macrophages+differentiated+from+human+monocytes+with+macrophage-colony-stimulating+factor+%28M-CSF%29%5BTitle%5D)+AND+%22+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF).</a> J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).</li>
<li>Freeman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG1-mediated+generation+of+extracellular+cholesterol+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains.</a> J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).</li>
<li>Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-independent+fluid-phase+pinocytosis+mechanisms+for+induction+of+foam+cell+formation+with+native+low-density+lipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles.</a> Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCA1+contributes+to+macrophage+deposition+of+extracellular+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol.</a> J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).</li>
<li>Ong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+cholesterol-rich+microdomains+generated+by+human+macrophages+and+their+potential+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport.</a> J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).</li>
<li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li>
<li>Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+inhibits+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor-dependent+human+monocyte+survival+at+the+early+stage+of+the+culture+and+inhibits+the+generation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages.</a> J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).</li>
<li>Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+monocytes+from+whole+blood+by+density+gradient+centrifugation+and+counter-current+elutriation+followed+by+cryopreservation%3A+six+years%27+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).</li>
<li>Weiner, R. S., Normann, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integrity+of+cryopreserved+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Functional integrity of cryopreserved human monocytes.</a> J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).</li>
<li>Hansen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+phagocytic+functions+in+cryopreserved+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).</li>
<li>Seager Danciger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+large+scale+isolation%2C+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis%2C+cellular+adhesion+assays%2C+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).</li>
<li>Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+contamination+of+apolipoprotein+A-I%3A+effect+on+macrophage+proliferation--a+cautionary+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale.</a> Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

יצירת סוגים מקרופאג מוגדר יכול להבהיר כמה תוצאות סותרות שהגיעו לידי החוקרים כאשר לומדים ביולוגיה מקרופאג. שימוש תנאי תרבות שונים וגורם בידול כדי ליצור מקרופאגים אדם מן המעלה ראשון יכולים להוביל סוגי מקרופאג שונים מאוד, עובדה כי לא יכול להיות מוערכת על ידי החוקר. לדוגמא, מקרופאגים לפעמים נוצרים מתוך מונוציטים אדם ללא שימוש בסרום, נסיוב אדם לבד, נסיוב האדם השלים עם M-CSF, FBS לבד, או FBS המכיל M-CSF או GM-CSF. כפי שדווח בעבר וכפי שאנו גם ציינו, מונוציטים מתורבתים במשך שבוע ללא סרום ...

חקר מקרופאגים מתורבתים הוא מודל שימושי להבנת תפקודם של תאים אלה בדלקת, כפי שקורה בפלאק טרשת עורקים. כאשר המחקר מתמקד במחלות אנושיות הכוללות מקרופאגים, כדאי לחקור מקרופאגים אנושיים ראשוניים ולא מקרופאגים לא אנושיים כדי למנוע הבדלים בין מינים. כמו כן, ניתן להימנע מההשפעות של טרנספורמציה תאית על ידי שימוש במקרופאגים ראשוניים ולא בקווי תאים של מקרופאגים. למטרה זו, מקרופאגים המובחנים ממונוציטים המבודדים מדם אנושי משמשים כאמצעי להשגת מקרופאגים אנושיים ראשוניים. 
מקרופאגים ברקמות עשויים להיות שוכנים בתוך רקמות או עשויים להיגזר ממונוציטים הנודדים לרקמה ומתמיינים למקרופאגים 1. הוגדרו שני סוגים של מקרופאגים אנושיים שמקורם במונוציטים הנבדלים זה מזה לא רק במורפולוגיה אלא גם בביטוי גנים ובתפקוד התא 2. שני סוגים אלה מתקבלים ממונוציטים המובחנים למקרופאגים בנוכחות M-CSF + סרום בקר עוברי (FBS) ומונוציטים המובחנים למקרופאגים בנוכחות גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) + FBS 2-6. מניסיוננו (תצפית שלא פורסמה), שימוש בסרום אנושי ולא ב-FBS מייצר את סוג ה-GM-CSF ללא קשר אם M-CSF או GM-CSF כלולים במדיום ההתמיינות. מקרופאגים מסוג M-CSF נוטים להיות מוארכים יותר מאשר מקרופאגים מסוג GM-CSF, הדומים לביצים מטוגנות במורפולוגיה שלהם. על החוקרים להכיר בכך שמקרופאגים אנושיים שמקורם ב-M-CSF ו-GM-CSF אינם זהים למה שנקרא מקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר M1 ו-M2 6.
במהלך מחקר באמצעות מקרופאגים מובחנים M-CSF שמקורם במונוציטים אנושיים, חווינו קושי הקשור לזמינות של מונוציטים ליזום ניסויים ושונות בצפיפות התאים המתקבלת של מקרופאגים במהלך התמיינות של מונוציטים למקרופאגים. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו את הפרוטוקול הבא שבו מונוציטים מוקפאים עד שהם נדרשים לשימוש, ומונוציטים מובחנים בכמויות גדולות למקרופאגים שניתן להסיר אותם מצלוחיות התרבית ולצפות אותם בצפיפות התאים הרצויה כדי לקבל תרביות אחידות יותר מניסוי לניסוי.

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבית 12 בארות Cellbind</td><td>Corning</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR, בקבוק T-75, תרבית רקמות מטופלת</td><td>Greiner Bio-One צפון אמריקה</td><td>658157</td><td></td></tr><tr><td>מדיום תרבית RPMI 1640</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>15-040-CM</td><td>מחומם ל-37 מעלות; C</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>IL-10&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>375418</tr><tr><td>DPBS ללא Ca2+ ו-Mg2+&nbsp;</td><td>קורנינג סלגרו</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% טריפסין-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי מפוליפרופילן</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer אור בהיר משופר נויבאואר</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>610031</td><td>http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html</td></tr><tr><td>הקפאת תאים CoolCell LX מיכל</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td>מיכלי הקפאה אחרים צריכים גם הם&nbsp; להיות מתאימים לשלב זה</td></tr><tr><td>מערכת אחסון חנקן נוזלי, CryoPlus 1</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>7400</td><td>כל מיכל חנקן נוזלי צריך להיות מתאים</td></tr></tbody></table>

תרבות של macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

מוצג פרוטוקול לתרבית תאים של מקרופאגים שמקורם בגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF). לצורך התחלת ניסויים, מונוציטים טריים או קפואים מתורבתים בצלוחיות למשך שבוע אחד עם M-CSF כדי לגרום להתמיינות שלהם למקרופאגים. לאחר מכן, ניתן לקצור את המקרופאגים ולזרוע אותם לבארות תרבית בצפיפות התאים הנדרשת לביצוע ניסויים. השימוש במספרים מוגדרים של מקרופאגים במקום במספרים מוגדרים של מונוציטים כדי ליזום תרביות מקרופאגים לניסויים מניב תרביות מקרופאגים שבהן ניתן להשיג את צפיפות התאים הרצויה באופן עקבי יותר. שימוש במונוציטים שמורים בהקפאה מפחית את התלות בזמינות התורם ומייצר תרביות מקרופאגים הומוגניות יותר.

הכדאיות של מונוציטים טריים או cryopreserved היה יותר מ -95% כפי שנקבע עם Trypan כחול מכתים 9. איור 1 ואיור 2 להשוות בבית התחתון בהגדלות גדולות, בהתאמה, את ההתקדמות של בידול מונוציטים טריים cryopreserved (כלומר, קפוא) לתוך מקרופאגים. ראוי לציין, כי טרי לעומת מונוציטים cryopreserved להראות subpopulation של הבחנה מונוציטים כי אינם מתפשטים אבל להישאר מעוגל. vacuoles-לוסנט שלב להתרחש...

מוצג פרוטוקול לתרבית תאים של מקרופאגים שמקורם בגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF). הפרוטוקול משתמש בשימור בהקפאה של מונוציטים יחד עם התמיינות בתפזורת שלהם למקרופאגים. לאחר מכן ניתן לזרוע מקרופאגים שנקטפו לבארות תרבית בצפיפות התאים הנדרשת לביצוע ניסויים.

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לשפר את זמינות המונוציטים ולמזער את השונות בצפיפויות התאים המתקבלות במהלך גילוי בידול של מונוציטים מדם אנושי למקרופאגים בהשראת MCSF. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח הנוגעות לביולוגיה של מקרופאגים אנושיים. היתרון המרכזי של טקטיקה זו הוא שניתן להשיג בקלות תרבויות של מקרופאגים המופקים ממונוציטים אנושיים עם תלות מופחתת בזמינות תורמים.בנוסף, ניתן להשיג באופן עקבי את צפיפות תאי המקרופאג הרצויה ואת התרביות ההומוגניות. כדי להתחיל בהליך זה, השג תאים חד-גרעיניים באמצעות לוקאפרזיס מתורמים אנושיים, ולאחר מכן העשר את המונוציטים באמצעות אלוטריציה צנטריפוגלית בזרם נגדי רציף של תאים חד-גרעיניים. לאחר מכן, ספור את התאים באמצעות המוציטומטר.בשלב הבא, סובבו את המונוציטים בצנטריפוגה בתוך מבחנה פוליפרופילן של 15 מיליליטר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסירו את העילאי (supernatant) והחזירו בעדינות את התאים לתמיסס ב-FBS ולאחר מכן ב-Dimethyl Sulfoxide כדי להגיע לריכוז סופי של 90% FBS, 10% Dimethyl Sulfoxide ו-50 × 10⁶ תאים למיליליטר. לאחר מכן, העבירו מיליליטר אחד של תמיסס התאים לתוך קריו-מבחנה (cryofile) בודדת.הניחו את הקריו-וואליאליות (cryofiles) במכל הקפאת תאים, והעבירו אותו למקפיא של 80- מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, העבירו את המכל למכל קריו-וואליאליות בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. בשלב זה, הפשירות קריו-וואליאלית של תאים על ידי השהייה קצרה במקלח מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.כאשר תרחיף התאים הופשר בערך ב-70%, הוצאו אותו מיד מאמבט המים והעבירו אותו לטמפרטורת החדר. לאחר שתרחיף התאים הופשר לחלוטין, העבירו מילליטר אחד מתוכני הקריו-ויה (cryrofile) ל-50 מילליטר של מצע RPMI 1640 עם 2 מילימול L-glutamine, 50 ננוגרם למילליטר M-CSF, 25 ננוגרם למילליטר IL-10 ו-10% FBS בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, העבירו 25 מילליטר של תרחיף מונוציטים לשני בקבוקי תרבית תאים מפלסטיק בנפח של 75 סמ"ר.דגרו את התרביות בטמפרטורה של 37 °C למשך 48 שעות. זכרו לא להחליף את המצע עד להשלמת 48 השעות; אחרת, התאים לא יהיו מקובעים היטב וייסחפו במהלך השטיפה. לאחר 48 שעות, שטפו את התרביות שלוש פעמים עם 10 mL של מצע RPMI 1640 שחומם מראש.הסיר בעדינות את מצע השגילול כדי למנוע תלוש של תאים המחוברים באופן רופף. לאחר מכן, הוסף מצע מלא ושגיל את התאים למשך שבוע אחד. החלף את המצע מדי יומיים עד שהמונוציטים יבצעו דיפרנציאציה ויהיו רבייה יעילה עד להגעה לקונפלואנס.כעת, שטפו את המקרופאגים המובחנים בבקבוק שלוש פעמים עם 10 milliliters של DPBS בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של תמיסת 0.25%Trypson EDTA בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. לאחר מכן, הכניסו את הבקבוק לאינקובטור לתרביות תאים למשך 10 עד 15 דקות.לאחר מכן, כ-90% מהמקרופאגים אמורים להיות בעלי צורה עגולה ולהיפרד מהמשטח. לאחר מכן, הוסף 10 milliliters של מצע RPMI 1640 המכיל 10% FBS כדי לעצור את הטיריפניזציה. במידת הצורך, השתמש במגבב תאים (cell lifter) כדי להסיר את התאים לחלוטין.לעיתים, במהלך הליך זה, מקרופאגים רבים נותרים דבקים. ניתן להסיר מקרופאגים אלו לאחר טריפסינציה על ידי העברת מקרצף תאים (cell lifter) על פני השטח של הבקבוק. לאחר מכן, העבירו את תרחיף תאי המקרופאגים מהבקבוק אל מבחנה מפוליפרופילן בנפח 15 milliliter.סבב את הדגימה בצנטריפוגה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והסר את supernatant. לאחר מכן, השהה בעדינות את המקרופאגים במיליליטר אחד של מצע מלא. בהתבסס על ספירת התאים, הוסף מצע מלא נוסף כדי להגיע לצפיפות התאים הרצויה לזריעה.לאחר מכן, זרעו את המקרופאגים ב-1.5 milliliters של מצע לכל באער בלוח של 12 באערים. ריכוז של 1 × 10⁵ תאים ב-1.5 milliliters של מצע לבאער מייצר בדרך כלל תרבית כמעט קונפלואנטית (confluent). לאחר הזריעה, דגרו את המקרופאגים למשך לילה ב-37 °C כדי לאפשר היצמדות של התאים לפני השימוש בהם בניסויים.איור זה מציג תמונות מיקרוסקופיות בניגודיות פנים (face contrast) של מונוציטים טריים שהקפאו, במהלך התמיינותם למקרופאגים בהשראת MCSF, בהגדלה נמוכה. התמונות של המונוציטים צולמו ביום השלישי והשביעי של התרבית בבקתלה (flask), וביום השמיני, יום אחד לאחר קצירתם והעברתם לפלחתית תרבית בעלת 12 בארות. מוצגת כאן השוואה בין מונוציטים טריים למונוציטים שהקפאו ששימשו לייצור מקרופאגים, בהגדלה גבוהה.הואקולות שנראות רפויות במיקרוסקופ פאזה הן מקרופינוסומים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ההקפאה (cryopreservation) ומאוחר יותר גדילה והבחנה של מונוציטים אנושיים למקרופאגים באמצעות MCSF. לאחר מכן, ניתן לתרבת את המקרופאגים בצפיפויות תאים רצויות לצורך ניסויים.

culture-macrophage-colony-stimulating-factor-differentiated-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את הפרימיום של מונוציטים ראשוניים למקרופאגים. מונוציטים אנושיים ראשוניים יכולים להיות מבודדים ומובחנים לפנוטיפ פרו-דלקתי דמוי M1 באמצעות גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) או לפנוטיפ אנטי-דלקתי דמוי M2 באמצעות גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF).

תרבית חוץ גופית והתמיינות של מונוציטים ראשוניים למקרופאגים

בסרטון זה, אנו מדגימים הליך לגרימת התמיינות וקיטוב של מונוציטים היקפיים שמקורם בדם למקרופאגים M1 או M2. דגירה עם גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים, ליפופוליסכריד ואינטרפרון-גמא מניבה מקרופאגים M1 מעודדי דלקת, ואילו דגירה עם גורם מגרה מושבת מקרופאגים ואינטרלוקין-4 גורמת לייצור מקרופאגים אנטי-דלקתיים מסוג M2.

התמיינות וקיטוב של תאים שמקורם במונוציטים לתאים דמויי מקרופאגים

מקרופאגים הנגזרות מונוציטים הם תאים חשובים של מערכת החיסון המולדת. כאן, אנו מתארים קלים...

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל לייצור מקרופאגים אנושיים. מעילים באפי מעובדים על ידי צנטריפוגה הכפולה שיפוע צפיפות ולאחר מכן מונוציטים מבודדים נבדלים למקרופאגים בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון. זה ממקסם תשואות מקרופאג ומקל על קצירת תאים לניסויים הבאים.

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

תאי מח עצם שגודלו עם גורם מגרה מושבת מקרופאגים גרנולוציטים (GM-CSF) מייצרים תרבית הטרוגנית המכילה מקרופאגים ותאים דנדריטיים (DCs). שיטה זו מדגישה שימוש בקשירת MHCII והיאלורונן (HA) כדי להבדיל בין מקרופאגים ל-DCs בתרבית GM-CSF. למקרופאגים בתרבות זו יש קווי דמיון רבים למקרופאגים המכתשית.

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

מוצג כאן הוא פרוטוקול אופטימיזציה עבור בידוד, culturing, העברה, וההבחנה העיקרי האנושי מונוציטים מאנשים נגועים בריאים ושליטה בריאה.

בידוד, העברה ותרבות של האדם הראשי המונולוציטים

הציג כאן הוא פרוטוקול כדי לזהות מלכודת מקרופאג מסחטות (MET) ייצור בתרבות התא החי באמצעות מיקרוסקופ וכתמים פלואורסצנטית. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב עוד יותר כדי לבחון סמנים מסוימים של החלבון נפגשו על-ידי כתמים immunofluorescence.

בגירוי חוץ-גופית והדמיה של שחרור מלכודת השמנה ב הבדיל מונוקרוציט האדם הנגזר

מקרופאגים דמויי M2 הקשורים לגידול (TAM) קשורים להתקדמות הגידול ולאבחנה לקויה בסרטן. פרוטוקול זה משמש כמדריך מפורט להבחנה וקיטוב של תאים דמויי THP-1 למקרופאגים דמויי M2 תוך 14 יום. מודל זה הוא הבסיס לחקור את ההשפעות האנטי דלקתיות של TAM בתוך microenvironment הגידול.

בידול מקרופאג' וקיטוב לפנוטיפ דמוי M2 באמצעות קו תאים דמוי THP-1 לוקמיה דמוי מונוציטים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים.

בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

מונוציטים ומקרופאגים הם תאים חיסוניים פלסטיים מאוד וניתנים לתכנות מחדש החיוניים לבריאות ולמחלות. הם חשים ומגיבים למגוון רחב של גירויים על ידי אימוץ תוכניות בידול ופנוטיפים ספציפיים. תקננו מודל מבחנה לחקר קיטוב ותכנות מחדש של מקרופאגים, ומספק כלי רב ערך למחקר.

מודל תכנות מחדש של מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים לבדיקות חוץ גופיות

למדו שיטה לתרבות מקרופאגים מונוציטים אנושיים באמצעות M-CSF עם קריופרזרבציה והפרדה צנטריפוגלית. שיטה זו מבטיחה צפיפות תאים אחידה ומפחיתה תלות בתורמים למחקר ביולוגי.

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

גלה סרטונים נוספים