שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין ולמדוד את ההשתלה in vivo של תאי דם מושתלים לגומחות מח עצם מקבלות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הדמיה של תהליכים תאיים כמו ביות, התרחבות ולוקליזציה לנישות מח עצם שונות של תאים המטופויאטיים תורמים לאחר ההשתלה. בשימוש בשילוב עם מודלים של בעלי חיים מהונדסים, גישה זו יכולה לסייע בהגדרת מסלולים מולקולריים קריטיים להתחדשות תאים המטופויאטיים.

בניגוד להיסטולוגיה או טכניקות הדמיה אחרות, מיקרוסקופיה תוך-חיונית מאפשרת ללכוד אינטראקציות בין תאים בבעל חיים חי ברמה התאית ובזמן אמת. החלטנו להשתמש בשיטה זו כדי לקבוע אם המיקרו-סביבה של מח העצם הייתה האתר הראשוני להתפתחות המחלה המיאלופרוליפרטיבית הנגרמת על ידי אובדן איתות Notch. האתגרים עבור אנשים חדשים בטכניקה זו כוללים מזעור חפץ הנשימה, מיקום וייצוב אופטימלי של הראש והימנעות מרוויה בתמונה.

שעה עד שעתיים לפני ההשתלה, יש לרסס עכבר EGFP עם אתנול 70%. לאחר מכן, השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך בעור של כל רגל סביב הקרסול ובמלקחיים כירורגיים כדי להסיר את העור והפרווה יחד כדי לחשוף את רקמת השריר הנקייה. הסר כמה שיותר שריר מהרגליים.

לאחר מכן חתכו את העצמות במפרקי הברך והקרסול והשתמשו בספוגי גזה כדי להסיר את כל רקמת השריר שנותרה מעצם הירך והשוקה. שטפו את העצמות הנקיות בצלחת של שש בארות המכילה DMEM בתוספת 10% FBS. לאחר מכן העבירו את כל ארבע עצמות הרגליים האחוריות ל -10 מיליליטר EDTA קר ב- PBS למרגמה ומועכים את העצמות בעזרת עלי.

יש לשלש את תאי מח העצם כדי לקבל תרחיף חד-תאי ולסנן את התרחיץ דרך מסנן של 70 מיקרון לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. שוטפים את המסנן עם שניים עד שלושה מיליליטר PBS. לאחר מכן צנטריפוגה את התאים והשעיה מחדש של הגלולה ב-10 מיליליטר של DMEM טרי בתוספת 10% FBS.

לצורך ההזרקה, צנטריפוגה את תרחיף התאים ואז סופר ומתאים את ריכוז התאים ל-1.5 כפול 10 לתאים השביעיים למיליליטר ב-IMDM ללא סרום. הניחו את התאים על קרח. חמש עד שש שעות לאחר מנת ההקרנה השנייה, יש להזריק שלוש פעמים 10 עד שישי תאי מח עצם לווריד הזנב של כל בעל חיים מוקרן.

הוסף את נקודת הזמן המתאימה לאחר ההשתלה. הנח את עכבר הנמען המורדם על כרית חימום של 37 מעלות צלזיוס ואשר חוסר תגובה לצביטה בבוהן. יש למרוח משחה על עיני החיה ולתת 100 מיקרוליטר של הסמן הפלואורסצנטי המתאים דרך וריד הזנב.

לאחר מכן, השתמש בקוצץ חשמלי קטן כדי להסיר את השיער מהמשטח הגבי של ראש החיה, ולאחר מכן מריחת קרם אפילציה. לאחר חמש דקות, הסר את הקרם בעזרת ספוגי גזה ושטוף את כל התמיסה שנותרה במי מלח. חיטוי הקרקפת בעזרת צמר גפן ספוג אתנול 70%.

לאחר מכן השתמש במלקחיים עדינים ובמספריים כדי לבצע חתך עור בקו האמצע של 10 עד 20 מילימטר בקרקפת כדי לחשוף את פני הגולגולת הגביים הבסיסיים. בעזרת משי כירורגי 5-0, הניחו שני תפרי שהייה בכל צד של החתך וצרו דש לחשיפת הקלווריום להדמיה. מרחו טיפת שמן על הגולגולת החשופה.

כשהעכבר במצב שכיבה, טבלו את הקרקפת החשופה בכלי זכוכית מלא בשמן מיקרוסקופ. לאחר מכן הנח את החיה על שלב הדמיה מרובה פוטונים עם הקלווריום מעל המטרה וכסה את החיה בכרית חימום של 37 מעלות צלזיוס. חיוני שהראש יישאר מיוצב במיקום הנכון במהלך רכישת התמונה הרב-פוטונית.

השתמש במכשיר סטריאוטקטי או אבטח את העכבר עם סרט לפי הצורך. באמצעות מערכת קונפוקלית הפוכה שהותאמה להדמיה מרובת פוטונים, כוון את שני הלייזרים ל-830 ננומטר. לאחר מכן, פתח את התוכנה המתאימה לרכישת תמונות.

בתפריט הגדרות הרכישה, ודא שמצב הסריקה החד-כיווני נבחר והגדר את מהירות הסריקה לארבע מיקרו-שניות לפיקסל, את קצב הפריימים ל-512 על 512 פיקסלים ואת הזום ל-1.5. בחר את ה-20X וואט במטרה של 0.95. פתח את חלון רשימת הצבעים ובחר שני פוטונים.

לאחר מכן בחר את מראה RDM690 בחלון בקר המיקרוסקופ. בחלון נתיב האור והקוביות, בחר את התיבה השנייה של יחידת הלייזר כדי לבדוק אם תריס הלייזר של שני הפוטונים פתוח. בחר EPI Lamp ובחר את קוביית המסנן B/G EPI.

לאחר מכן מקד את המטרה בדגימה כדי לדמיין את זרימת כלי הדם בנישת מח העצם של הקלווריום, תוך שימוש בהתפצלות של הווריד המרכזי והתפר הכלילי כנקודות ייחוס. באמצעות המצב הלא סרוק, בחר שלושה גלאים חיצוניים וצלם את הדגימה בקצב סריקה של ארבע מיקרו-שניות לפיקסל ללא ממוצע וכוח לייזר קבוע ורווח גלאי כדי לנצל את הטווח הדינמי המלא של הגלאי עם רוויה מינימלית. לאחר איסוף סדרה של קטעים בעומק הרקמה, פתח את תוכנת הכימות וההדמיה הייעודית המתאימה של 3 עד 4D.

דמיין באופן אינטראקטיבי את ערימות Z באמצעות אלגוריתם העיבוד התלת-ממדי המתאים בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן השתמש במודול פילוח אובייקטי הנקודה כדי לפלח את תאי ה-GFP ולהחיל עיבוד אריתמטי של מחסנית כדי לחסל את תאי ה-GFP החיוביים השגויים בערוצים הירוקים והאדומים. לבסוף, השתמש במודול פילוח פני השטח כדי לתקן את הפילוח של כלי הדם ומשטח העצם, תוך החלת מרחק מתח X של אלגוריתמים של נקודה לפני השטח כדי לחשב את מרחקי התאים לכל אחד מהמשטחים הדיסטליים לפי הצורך.

כאן, ערימות Z שנאספו מכל אחד מששת האזורים הסטנדרטיים של קלווריום מח העצם הוצגו כהקרנה תלת מימדית בעוצמה מקסימלית, הקרנת צל תלת מימדית כולל מרכיב העצם, ותמונות תלת מימדיות מפומנטות, המאפשרות כימות של התאים ומדידת המרחקים שלהם מהעצם וכלי הדם. בניסוי זה, הדמיה in vivo של תאים מיאלואידים במיקרו-סביבת מח עצם פגומה ב-Notch גילתה כי לתאי GFP שעברו ליזה של תורם יש יעילות ביות דומה בסוג הבר ומקבלי נוקאאוט 24 שעות לאחר ההשתלה בזמן שהם מציגים חריטה שונה בנקודות זמן מאוחרות יותר. ניתוח הדינמיקה של התרחבות האב המיאלואיד הראה כי תאים מושתלים במח עצם התרחבו מהר יותר ובמספרים גדולים יותר בקרב מקבלי נוקאאוט שבועיים לאחר ההשתלה.

תאי מח העצם התורמים במושתלי הבר התרחבו מאוחר יותר, אך במספרים גבוהים פי שניים מאשר תאי התורם ומושתלי הנוקאאוט לאחר ארבעה שבועות, זמן שבו תאי התורם במח העצם הנוקאאוט פוחתים מכיוון שהוא נכנס במהירות למחזור הדם. וכי לאחר שישה שבועות, ההבדלים במספר התאים התורמים בקלווריום של מח העצם מתאזנים. יתר על כן, ניתוח פילוח תלת מימדי של האזור האמצעי התחתון של נוקאאוט וקלווריה מסוג בר בשישה שבועות לאחר השתלת מח עצם מצביע על כך שתאי ה-GFP הליזים ממוקמים באותו מרחק מהעצם בשני סוגי בעלי החיים המקבלים, אך מעניין שהם שוכנים רחוק יותר מכלי הדם בעכברי הנוק-אאוט.

לאחר השליטה, ניתן להשלים את הדמיית מח העצם התוך-חיונית תוך שעה ו-30 דקות לכל עכבר אם היא מבוצעת כראוי. בעת שימוש בגישה זו, חשוב לזכור לדגום אזורים מרובים של מח העצם של הקלווריום לכל עכבר ולנתח לפחות שלושה עכברים בכל ניסוי כדי לטפל בכל וריאציה בתוך ובין הדגימה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשלב השתלת מח עצם והדמיה תוך-חיונית כדי לקבוע את הקינטיקה של ההשתלה של תת-אוכלוסיית דם ספציפית למיקרו-סביבה של מח העצם.