Cytometric זרימה פשוט שיטה למדוד ספיגת הגלוקוז ואת ביטוי נשא גלוקוז עבור מונוציטים subpopulations ב דם מלא
12 באוגוסט 2016
מונוציטים הם מרכיבים אינטגרליים של מערכת החיסון המולדת האנושית המסתמכים על חילוף חומרים גליקוליטי כאשר הם מופעלים. אנו מתארים פרוטוקול זרימה ציטומטרית למדידת ביטוי טרנספורטר גלוקוז וספיגת גלוקוז על ידי סך כל המונוציטים ותת-אוכלוסיות המונוציטים בדם מלא טרי.
המטרה הכללית של מתודולוגיה זו היא למדוד את ספיגת הגלוקוז ואת הנשא שלה בתתי-אוכלוסיות שונות של מונוציטים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון מהי החשיבות של מטבוליזם של תאי מערכת החיסון בתוצאות מחלה? היתרונות המרכזיים של טכניקות אלו הם שהן מהירות, קלות לביצוע, אינן דורשות חומרים ריאקטיביים ודורשות רק נפח קטן של דם.
בתוך שעה אחת מאיסוף דגימות הדם, בתוך מבחנות עם נוגד קרישה מסוג citrate ACD-B, העבירו את הדגימות לקבינט בטיחות ביולוגית. לאחר מכן, העבירו 100 µL דם מכל דגימה למבחנות פוליפרופילן נפרדות, וטפלו בתאים עם 2 mL של 1X lysing solution על קרח, תוך שאיבה עדינה עם פיפט למערבב. לאחר 15 דקות, סובבו את התאים בצנטריפוגה ובצעו לאחר מכן שני סבבים נוספים של סבב בצנטריפוגה ב-wash buffer.
לאחר השטיפה השנייה, השתמש בפיפט כדי להסיר בזהירות כמה שיותר מהנוזל העליון (supernatant), ותלה את המשקעים (pellets) ב-100 µL של באפר שטיפה על קרח. כדי לזהות את תתי-האוכלוסיות הספציפיות של המונוציטים, צבע את התאים באמצעות 5 µL של הנוגדנים המתאימים לכל 100 µL של תאים, למשך 30 דקות על קרח ובחושך. בסיום האינקובציה, שטוף את הדגימות פעמיים בתמיסת שטיפה וקבע את התאים באמצעות 200 µL של 0.5% formaldehyde ב-PBS.
לאחר מכן, נתחו את התאים בתוך 24 שעות באמצעות ציטומטר זרימה המסוגל לזהות ארבעה צבעים. כדי להעריך את ספיגת הגלוקוז של תתי-האוכלוסיות של המונוציטים, העבירו 90 µL דם מכל דגימה לשפופרות פוליפרופילן נפרדות, והוסיפו לדם 10 µL של האנלוג הפלואורסצנטי של הגלוקוז הרלוונטי. נערו בעדינות את השפופרות כדי לערבב, וכסו את הדגימות בנייר אלומינום.
לאחר מכן, הדגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 עד 30 דקות, ולאחר מכן העבירו אותם מיד לקרח. בשלב הבא, הוסיפו למבחנות 4 mL של תמיסת ליזיס ל-FACS, וסבבבו את התאים בצנטריפוגה. לאחר מכן, בצעו סבב צנטריפוגה שני בבופר שטיפה.
שפכו את הנוזל העליון, וצבעו את התאים עם הנוגדנים המתאימים למטרת המחקר למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר מכן, שטפו את הדגימות ב-4 milliliters של בופר שטיפה קר מאוד, השעיקו מחדש את המשקעים ב-200 עד 300 microliters של PBS קר מאוד, ונתחו את המבחנות תוך 10 דקות. לצורך ניתוח בציטומטריה של זרימה, השתמשו תחילה בדגימות ביקורת לא צבועות וצבועות בנפרד כדי לקבוע את הפיצוי (compensation).
בשלב הבא, בתוכנה המתאימה לניתוח תאים בודדים, פתח את הדגימה הראשונה בתרשים פיזור של forward מול side scatter, ובצע סינון (gating) של המונוציטים כפי שמוצג. לאחר מכן, לחץ פעמיים על אוכלוסיית המונוציטים שסוננה, ובצע סינון של האוכלוסייה השלילית ל-CD3. כעת, לחץ פעמיים על האוכלוסייה השלילית ל-CD3, והגדר את ציר ה-x להצגת הצביעה של CD14, ואת ציר ה-y להצגת הצביעה של CD16.
בשלב הבא, כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז או את הנשא שלה בתת-אוכלוסייה ספציפית של מונוציטים, צור את ההיסטוגרמות המתאימות. לאחר מכן, במקומות שבהם קיימות אוכלוסיות תאים מוגדרות, השתמש בדגימות הבקרת FITC igG כדי לקבוע את השער (gate) ולהגדיר את האחוז הכולל של מונוציטים חיוביים ל-CD14 בכל דגימה. כאן מוצגת אסטרטגיית השעירה הראשונית לבידוד המונוציטים לפי פיזור תאים (cell scatter) והדרה של תאי T על ידי שעירה בתוך האוכלוסייה השלילית ל-CD3.
לאחר מכן מבצעים בחירת תאים (gating) של המונוציטים עבור ביטוי של CD14 לבדו, או בשילוב עם CD16, כדי לזהות את כלל המונוציטים או תתי-אוכלוסיות של מונוציטים. ניתן להבחין באוכלוסיות נפרדות של מונוציטים חיוביים ל-CD14 וחיוביים למשגר הגלוקוז Glut-1, בולט במיוחד בתאי דם לבנים במחזור הדם שהתקבלו מאנשים חיוביים ל-HIV. תאים חיוביים ל-CD14 וחיוביים ל-Glut-1 עשויים להופיע גם בתוך תתי-קבוצות ספציפיות של מונוציטים באנשים שאינם נגועים ב-HIV, אם כי אוכלוסיות אלו בולטות יותר בחולים חיוביים ל-HIV.
כפי שניתן היה לצפות מנתוני הביטוי של נשאי הגלוקוז, גם האנלוג של הגלוקוז 2-NBDG נספג בכמויות גבוהות יותר בתאים של אנשים חיוביים ל-HIV. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בתוך שעה וחצי אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להגביל את החשיפה לאור בכל האזורים.
בעקבות ספיגת אנלוגים של גלוקוז, ניתן לצבוע את התאים באמצעות נוגדנים לפני השטח של התא כדי לזהות אוכלוסיות חיסוניות ספציפיות שמעניינכם. לאחר פיתוחה, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבוע כיצד HIV משפיע על חילוף החומרים בתאי מערכת החיסון; היא יכולה להיבחן גם על ידי חוקרים אחרים, בתחומים שונים, כגון אימונולוגיה, וירולוגיה ומחקר הסרטן. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לזהות את מוביל הגלוקוז one (glucose transporter one), וספיגת גלוקוז בתאי מערכת החיסון.
זכרו כי בעת עבודה עם גורמים זיהומיים, יש להשתמש בנהלי בטיחות סטנדרטיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול של ציטומטריית זרימה למדידת ביטוי של נשאי גלוקוז וספיגת גלוקוז במונוציטים, מרכיבים קריטיים של מערכת החיסון המולדת. השיטה מאפשרת ניתוח של תתי-אוכלוסיות של מונוציטים בדם מלא טרי, ומספקת תובנות לגבי מטבוליזם של תאי חיסון.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אימונולוגיה
- מטבוליזם של תאים
- ציטומטריה של זרימה
רקע
- מונוציטים ממלאים תפקיד חיוני בתגובה החיסונית של בני האדם.
- מטבוליזם גליקוליטי הוא חיוני עבור מונוציטים מופעלים.
- הבנת ספיגת הגלוקוז יכולה לספק מידע על תוצאות של מחלות.
- ציטומטריה של זרימה מאפשרת ניתוח מפורט של תאי מערכת החיסון.
מטרת המחקר
- למדידת ספיגת גלוקוז בתתי-אוכלוסיות של מונוציטים.
- לחקירת תפקידו של חילוף החומרים של תאי מערכת החיסון במחלות.
- לספק שיטה מהירה ויעילה לניתוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף דגימות דם למבחנות עם נוגד קרישה citrate ACD-B.
- שימוש בתמיסת ליזה לטיפול בתאים על קרח.
- צנטריפוגציה ושטיפה של התאים לצורך אנליזה.
- ציטומטריה עם זרימה למדידת ביטוי של נשאי גלוקוז.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של ספיגת גלוקוז במונוציטים.
- זיהוי הבדלים בביטוי של נשאי גלוקוז.
- תובנות לגבי מסלולים מטבוליים בתגובות חיסוניות.
- הדגמת היעילות וקלות השימוש של השיטה.
מסקנות
- השיטה מספקת נתונים בעלי ערך על מטבוליזם של מונוציטים.
- הבנת ספיגת הגלוקוז יכולה לסייע במחקר של מחלות.
- ניתן להחיל פרוטוקול זה על מחקרים אימונולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של תכנות מחדש מטבולי של מונוציטים בדם מלא, ותומכת בתיקוף מטרות במחקר של אימונו-מטבוליזם ומחלות דלקתיות. באמצעות כימות ספיגת גלוקוז וביטוי של נשאי גלוקוז בתתי-אוכלוסיות של מונוציטים, היא מספקת הפחתת סיכונים מנגנונית עבור היפותזות טיפוליות הקושרות בין מטבוליזם של תאי חיסון לתוצאות מחלה. זרימת העבודה תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות לתיקוף פונקציונלי של שינויים גליקוליטיים בתאים אנושיים ראשוניים ללא מניפולציה ex vivo.
יישומים אסטרטגיים במו"פ בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות מדידת ספיגת גלוקוז תפקודי בתתי-אוכלוסיות של מונוציטים בתנאי הומאוסטזיס ובתנאי דלקת.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכון ביולוגי של מטרות המעורבות במסלולים אימונו-מטבוליים באמצעות שימוש במונוציטים אנושיים ראשוניים מדם מלא.
- ערך ניבוי: תומך בתעדוף פורטפוליו על ידי מתאם בין ביטוי של נשאי גלוקוז (למשל, Glut-1) למצבי מחלה כגון זיהום ב-HIV.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מכינה תתי-אוכלוסיות מאושרות של מונוציטים לסריקה המשכית על ידי קביעת מדדי בסיס של ספיגת גלוקוז במצב בריאות ובמחלה.
- תוצר כמותי: מייצר היסטוגרמות של ציטומטריה זרימה של ספיגת 2-NBDG וביטוי של סמני שטח עבור מדידות סטנדרטיות וניתנות לשחזור.
- יכולת הרחבה: משתמש בנפחי דם קטנים ובתשתית סטנדרטית של ציטומטריה זרימה, מה שמאפשר התאמה לסריקה בעלת תפוקה גבוהה בקרב קבוצות תורמים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין הגילוי לוולידציה פרה-קלינית באמצעות ניטור שינויים גליקוליטיים במונוציטים במודלים שונים של מחלות ובהתערבויות טיפוליות.
- הלימה של סממנים ביולוגיים: תומך בזיהוי של סממנים ביולוגיים מטבוליים (למשל, מונוציטים CD14+/Glut-1+) הקשורים לחסינות מאומנת (trained immunity) ולדלקת כרונית.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק בסיס לקריטריוני go/no-go באמצעות כימות מצבי אקטיבציה מטבוליים המנבאים תגובות חיסוניות פונקציונליות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, ומאפשרת ביצוע פנוטיפ של מטבוליזם בתאי מערכת חיסון אנושיים ראשוניים בשלבים מוקדמים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של מנגנונים אימונו-מטבוליים על ידי בידוד וכימות של ספיגת גלוקוז בתת-אוכלוסיות מוגדרות של מונוציטים (קלאסיים, ביניים, לא-קלאסיים).
- סריקה: מספק תוצאות הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה של פעילות גליקולית באמצעות ספיגת אנלוג גלוקוז פלואורסצנטי, בסטנדרטיזציה בין דגימות.
- אנליטיקה: מספק תוצאות כמותיות של ציטומטריה עם זרימה (אחוז ספיגה, עוצמת פלואורסצנציה ממוצעת) המאפשרות השוואה של מצבים מטבוליים בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי מעקב אחר שינויים מטבוליים במונוציטים המתואמים עם התקדמות של מחלות דלקתיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה רב-פעמית לפרופיילינג אימונו-מטבולי, הישמימה לסוגים מרובים של לוקוציטים ולהקשרי מחלה שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מנגיסטית באימונו-מטבוליזם על ידי קישור ביטוי של נשאי גלוקוז לספיגה פונקציונלית במונוציטים אנושיים ראשוניים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות פרוטוקולים מוגדרים של צביעה, gating ואנליזה תוך שימוש בציוד נפוץ של ציטומטריית זרימה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי אספקת תיקוף מטבולי מוקדם של מטרות, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים בתוכניות של אימונולוגיה ווירולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות או תרופות ביולוגיות מותאם-סיכון, בהתבסס על השפעותיהם על שטף גליקוליטי במונוציטים והפעלה חיסונית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בפיצוי (compensation) של ציטומטריית זרימה רב-צבעית ובאסטרטגיות סינון (gating) של תתי-אוכלוסיות של מונוציטים.
- תלוי בגישה לציטומטר זרימה בעל 4 צבעים ולמ বোপদেব ביולוגית לעיבוד דם.
- מחייבת סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הצביעה והתזמון האיסכמי בין אתרים שונים במחקרי רב-מרכזיים.
- הסתגלות לתתי-אוכלוסיות אחרות של לוקוציטים דורשת תיקוף של פאנלים של סמנים ושל קינטיקת ספיגה של אנלוגים של גלוקוז.
- מוגבל על ידי חלון היציבות בן 24 השעות של דגימות מקובעות והצורך בעיבוד מהיר לאחר האיסוף.
